Fine-tuning van de grootte en het minimaliseren van de Noise van Solid-state Nanoporiën

Summary

Een methodologie voor het bereiden van solid-state nanoporiën in oplossing voor biomoleculaire translocatie experimenten wordt gepresenteerd. Door het toepassen van korte pulsen van hoge elektrische velden kan de nanopore diameter beheersbaar worden uitgebreid met subnanometer precisie en zijn elektrische ruis kenmerken aanzienlijk verbeterd. Deze procedure wordt uitgevoerd in situ met behulp van standaard laboratoriumapparatuur onder experimentele omstandigheden.

Abstract

Solid-state nanoporiën zijn ontstaan ​​als een veelzijdig instrument voor de karakterisering van enkele biomoleculen zoals nucleïnezuren en eiwitten ^1. Echter, het creëren van een nanogaatje in een dunne isolerende membraan blijft uitdagend. Fabricagemethoden waarbij gespecialiseerde gefocusseerde elektronenbundel systemen kunnen goed gedefinieerde nanopores te produceren, maar de opbrengst van betrouwbare en geluidsarme nanoporiën in commercieel verkrijgbare membranen blijft laag ^2,3 en de grootte controle is triviaal ^4,5. Hier, de toepassing van hoge elektrische velden te fine-tunen van de grootte van de nanogaatje en tegelijkertijd een optimale performance low-noise wordt aangetoond. Deze korte pulsen van hoge elektrische velden worden gebruikt om een ​​ongerept elektrisch signaal produceren en moeten voor het vergroten van nanoporiën met subnanometer precisie bij langdurige blootstelling. Deze werkwijze wordt uitgevoerd in situ in een waterig milieu met behulp van standaard laboratoriumapparatuur, verbetering van de opbrengst en reproduceerbaarheid van de solid-state nanogaatje fabricage.

Introduction

Biologische en solid-state nanoporiën een middel van sensing biomoleculaire analyten op de single molecule-niveau ^1. Individuele nanoporiën zijn meestal ingebed in dunne isolerende membranen, die de enige kanaal voor ionische stroom te geven tussen twee vloeibare reservoirs. Gebruik makend van de principes van grootschalige Coulter tellers, nanopore experimenten betreffen veranderingen in ionenstroom de lengte, grootte, lading en bevestiging van geladen biomoleculen bepalen zij elektroforetisch worden gedreven door een nanopore in aanwezigheid van een extern elektrisch veld.

Hoewel biologische nanoporiën zoals α-hemolysine hebben gewoonlijk een grotere gevoeligheid en geluidsarme eigenschappen ^3, de ondersteunende lipide bilaag is kwetsbaar en vaste grootte, beperking van hun toepasbaarheid. Solid-state nanoporiën, anderzijds, worden gefabriceerd in dunne (10-50 nm) siliciumnitride of siliciumoxide membranen en kan worden gemaakt van verschillende Sizes, gemakkelijk worden geïntegreerd met wafer-schaal technologieen ^6,7 en robuuster, waardoor een groter aantal experimentele condities. Ondanks deze voordelen, solid-state nanogaatje technologieën lijden aan een aantal praktische nadelen die hun bruikbaarheid beperken voor biomoleculaire studies. Hoewel regeling van nanoporiën omvang mogelijk is, typisch duur en omslachtig te bereiken, die gespecialiseerde apparatuur en geschoold personeel. Zo hebben nanoporiën geboord door-gerichte ionenbundel onlangs aangetoond krimpen onder specifieke experimentele omstandigheden in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) ^5. In andere benaderingen kunnen nanoporiën geboord door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) uitzetten of krimpen naargelang de balk daaropvolgend blootstelling aan waterige oplosmiddelen ^8. In deze gevallen, de bereikbare reeks nanoporiën afmetingen beperkt, moeilijk te controleren en zelfs onbetrouwbaar als de grootte van de nanopore volgende chemische behandeling veranderen ofbij onderdompeling in een bepaalde vloeibare omgeving ^9.

De ionische stroom door solid-state nanoporiën kunnen ook last hebben van veel lawaai, de bronnen waarvan een intens onderzocht onderwerp in nanopore literatuur ^2,3,10,11. Hoewel verscheidene werkwijzen voorgesteld om elektrische ruis, de opbrengst van betrouwbare, stabiele ruisarme nanoporiën is meestal laag. Afzetting van koolstofhoudende resten tijdens het boren en beeldvorming kan nadelige effecten op het elektrische signaal kwaliteit hebben, vaak het maken van complete bevochtiging van een uitdaging en het veroorzaken van de vorming van nanobelletjes die moeilijk te verwijderen ¹² kan zijn. Bovendien, verstopping van de nanogaatje door analytmoleculen degradeert signaalkwaliteit rendering poriën onbruikbaar voor verdere experiment ^13,14. In totaal hebben deze effecten sterk verminderen opbrengst van functionele nanogaatje apparaten en verhoging van de kosten in verband met solid-state nanogaatje onderzoek.

De toepassingtie van een spanning met een Ag / AgCl-elektroden van hoge elektrische velden produceren in het gebied van 0,15-0,3 V / nm geeft een verrassend eenvoudige oplossing voor deze problemen. Door de cyclische toepassing van korte spanningspulsen, een schone, geluidsarme nanopore oppervlak ideaal voor single-molecule studies wordt geproduceerd. Langdurige blootstelling aan hoge elektrische velden initieert de verwijdering van het membraanmateriaal die de porie muur, resulterend in een toename nanopore diameter. Deze groei nauwkeurig kan worden geregeld door het afstemmen van de puls sterkte en duur. Aangezien de huidige sporen degraderen tijdens een experiment door verstopping van de nanopore als moleculen adsorberen aan het oppervlak nanopore, kan dit proces worden herhaald verstopte apparaten die anders zouden zijn weggegooid herstellen. Als zodanig wordt het rendement van functionele nanoporiën nog versterkt door de mogelijkheid om hetzelfde apparaat meermalig gebruik. Deze werkwijze verschaft verscheidene voordelen zoals snel uitgevoerd vloeistof onder experimentelevoorwaarden maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur kan worden geautomatiseerd met software en produceert functionele hoogwaardige nanoporiën met een rendement van meer dan 95%.

Protocol

1. Nanopore Fabrication en reiniging

Opmerking: Zodra een nanopore bestaat in een isolerend membraan, kan het direct worden gemonteerd in de vloeistof cel zonder verdere verwerking of reinigen, zoals beschreven in stap 2. Indien het nodig is om sporen van verontreinigingen tussen experimenten te verwijderen, nanopore chips kunnen worden gereinigd met behulp van Piranha-oplossing ^3,15,16 (03:01 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ of door blootstelling aan een zuurstofplasma ^2. Als zodanig stappen 1,2-1,9 in het volgende protocol is facultatief indien voorreinigen door blootstelling aan piranha oplossing niet noodzakelijk.

1. Ontgas gefiltreerd gedeïoniseerd (DI) aan water door onder vacuüm in een ultrasoonapparaat gedurende 30 minuten bij 40 ° C.
2. Bereid piranha oplossing in een bekerglas van 10 ml door voorzichtig 3 ml zwavelzuur, gevolgd door 1 ml waterstofperoxide. Meng goed door refluxen in de pipet. LET OP: Piranha-oplossing is uiterst gevaarlijk. Gelieve ta ke alle voorzorgsmaatregelen.
3. Met behulp van zuurbestendige pincet, plaatst u voorzichtig de-nanogaatje met membraan chip rand eerst in de piranha oplossing om volledig onder te dompelen de chip en vermijd het op het water drijven.
4. Spoel pincet grondig gefilterd water.
5. Plaats het bekerglas op een hete plaat ingesteld op 90 ° C en laat het reinigen ten minste 30 minuten.
6. Verwijder voorzichtig de piranha oplossing uit de beker met een schone glazen pipet en gooi in een ruime hoeveelheid water.
7. Met een schone glazen pipet 5 ml van de ontgast gedemineraliseerd water uit stap 1.1 in de beker te spoelen. Verwijder het water en herhaal ten minste 5x.
8. Verwijder de nanogaatje chip voorzichtig uit de beker worden met schoon scherp-tip pincet. Hanteer met uiterste zorg als de nanogaatje membraan is zeer fragiel.
9. Droog de chip door zachtjes te zuigen aan de rand met behulp van een afzuiger. Bewaar de chip in een schone petrischaal tot aan gebruik.

ve_title "> 2. Montage van de Nanopore

1. Reinig de Teflon nanopore cel (figuur 1) door het plaatsen in 20% salpeterzuur oplossing en koken gedurende 10 minuten. LET OP: Gebruik alle nodige persoonlijke beschermingsmiddelen en handvat zuren met zorg.
2. Verwijder voorzichtig de cel van salpeterzuur en plaats in kokend DI water gedurende 10 minuten.
3. Kook de cel in gedeïoniseerd water nog eens 10 minuten om volledige verwijdering van salpeterzuur waarborgen. Verwijder het bekerglas van de kookplaat en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Verwijder de cel uit de beker en föhnen met gefilterde lucht of _N2. Bewaar de cel in een schone petrischaal.
5. Ontgas gefiltreerd KCl (gebufferd met HEPES bij pH 8) door plaatsing onder vacuüm in een sonificator gedurende 30 minuten bij 40 ° C.
6. Schoon twee siliconenelastomeer pakkingen per nanoporiën chip door sonicatie in ethanol gedurende minstens 10 minuten.
7. Plaats de nanogaatje chip op een schone elastomeer pakking wezen careful aan het membraan venster af te stemmen op de pakking opening. Plaats en richt een tweede pakking bovenop de chip.
8. Plaats de chip en pakkingen op het reservoir inlaat van de helft van de gereinigde nanopore cel. Monteer de cel door schroeven de andere helft plaats. Een opengewerkt aanzicht van de nanopore celcomponenten wordt getoond in figuur 1.
9. Bevochtig de nanogaatje chip door pipetteren ethanol in de cel reservoirs en plaatsing in een vacuümkamer tot een paar belletjes worden gezien om de inlaten verlaten.
10. Verwijder de ethanol door het spoelen van de reservoirs met minstens 3 ml ontgast gefilterd KCl oplossing. Zorg om overflow te verwijderen met behulp van een afzuiger.

3. Nanopore Karakterisering

1. Plaats de nanopore cel in de elektrisch afgeschermde experimentele opstelling en plaats Ag / AgCl elektroden in elk reservoir. Deze opstelling is soortgelijk aan die getoond in figuur 2 met uitzondering van de externe voeding en stroomversterker dievervangen door een low-noise resistieve feedback versterker.
2. De ruisarme versterker voltage-clamp stand toepassing potentialen vegen van -200 mV tot +200 mV en noteer de IV kenmerken.
3. Breng de IV curve nanopore geleiding, die kan worden gebruikt om de diameter te berekenen in oplossing ¹⁷ te verkrijgen. Als de berekende diameter veel kleiner dan verwacht van TEM beeldvorming, de porie waarschijnlijk niet volledig bevochtigd en / of vuil bevat of besmetting.
4. Breng een 200 mV potentiaal over de nanopore en noteer de ionenstroom voor 30 sec.
5. Voer een spectrale vermogensdichtheid (PSD) analyse van de ionenstroom en integreren om de elektrische ruis karakteristieken van de nanopore kwantificeren. Als het geluid boven 15 pA RMS bij 5 kHz bandbreedte dan de porie is waarschijnlijk niet volledig bevochtigd en / of verontreinigingen bevat en niet betrouwbaar kan worden gebruikt in experiment.

4. Conditioning Nanoporiën met High Electric Fields

Opmerking: Als de IV curve gegenereerd tentoongestelde asymmetrie of minder-dan-verwacht geleiding, of het huidige trace toonde instabiliteit en hoge geluidsniveaus op lage frequenties, is het noodzakelijk om de nanogaatje conditioneren met een hoge elektrische velden om verontreiniging op de porie te verwijderen oppervlak en / of nat de porie. Hoewel deze methode geen invloed op de hoogfrequente ruis door de membraancapaciteit of parasitaire capaciteit gekoppeld met de ingang van de stroomversterker in metingen kan laagfrequent geluid (ook wel 1 / f ruis) ¹⁸ sterk worden verminderd. Een schema van de installatie gebruikt om deze conditionering uitvoeren is getoond in figuur 2.

1. Koppel de elektroden van de patch-clamp versterker.
2. Sluit een van de elektroden met een computergestuurde voeding kan genereren> 6 V (> 0,2 V / nm elektrische veldsterkte voor de 30-nm dikke membranen hier gebruikt) en de andere een eXTERNE huidige versterker die kan worden gevolgd in real time.

   NB: De toepassing van hoge elektrische velden kunnen worden gebruikt om nanoporiën conditioneren verschillende membraanmaterialen en diktes. Terwijl zowel 30 nm en 10 nm membranen hier besproken spanningen beschreven verwijzen naar die voor 30-nm dikke membranen, tenzij anders vermeld.

3. Breng een potentiaalverschil van 400 mV (meetspanning) over de nanoporiën minstens 5 sec.
4. Bereken de gemiddelde stroomwaarde van de laatste 1 seconde van gegevens aan de geleiding van de nanogaatje bepalen. Bereken de diameter van de nanoporiën basis geleiding, die automatisch moeten worden uitgevoerd met de software en nanoporiën geleiding model van keuze op basis van de meest waarschijnlijke geometrie. Het moet overeenkomen met de diameter gemeten vanaf de IV curve.
5. Breng 200 msec puls van 6 V (bevochtiging spanning) over de nanoporiën een elektrisch veld van 0,2 V / nm gevolgd door 5 seconden meetperiode produceren400 mV. Ook berekenen diameter van de nanopore met de laatste 1 seconde van gegevens en vergelijken met de verwachte waarde van TEM metingen dat de nanoporiën volledig nat. Indien nodig, meerdere malen te herhalen.
6. Herhaal indien nodig de toepassing van hoge elektrische veld pulsen met toenemende spanning totdat de huidige signaal gedurende de meetperiode is stabiel en waarin wordt aangegeven welke geleiding. Het wordt niet aanbevolen om meer dan 10 V (dwz> 0,3 V / nm), omdat dit aanzienlijk kan vergroten of snel beschadigen de nanogaatje.

5. Het vergroten Nanoporiën met High Electric Fields

Opmerking: De diameter van de nanoporiën is doorslaggevend voor de functionaliteit voor een bepaalde biomoleculaire detectie toepassing. Hiertoe een nanopore gemaakt met een TEM kan tot een gewenste afmeting worden vergroot door toepassing van hoge elektrische velden tot de gewenste diameter wordt bereikt met de zelfde opstelling gebruikt voor het reinigen en bevochtigen hetnanopore (figuur 2).

1. Met dezelfde elektronische configuratie als in deel 4, breng dan een 200-500 mV vooroordeel over de porie om een ​​meting diameter te verkrijgen. Hoewel minder duidelijk dan plaatsen van een IV kromme, kan een enkel metingen worden gebruikt om snel ruwweg schatten nanopore grootte.
2. Breng 2 seconden puls 8 V over de nanoporiën gevolgd door een meetperiode van tenminste 5 seconden bij 400 mV. Berekening van de nieuwe diameter er zo uit een zeer kleine toename nanopore grootte (<0,1 nm).
3. Herhaal deze procedure cyclisch afwisselend uitbreiding en meting spanningen te verkrijgen in situ en real-time metingen van toenemende nanopore diameter.
4. Als snellere groei wenselijk is, verhoogt u de grootte van de spanning stapsgewijs aangebracht tot 10 V. De groei zal doorgaans te versnellen als de poriën vergroot met het stijgingspercentage van de geleiding, variërend van 0,03 nS / s ec & #160, 10 nS / s, afhankelijk van de grootte van de nanopore, sterkte van het elektrisch veld en elektrolytoplossing eigenschappen.
5. Wanneer de gewenste diameter is bereikt, stopt de toepassing van hoge elektrische velden. Dit kan automatisch worden gedaan met behulp van het computerprogramma.
6. Sluit de patch-clamp versterker naar de elektroden.
7. Verwerven van nieuwe IV en huidige trace gegevens met 200 mV aan de diameter van de nanogaatje bevestigen en controleren geluidsarme huidige signalen zoals in de stappen 3,2-3,5 boven. Herhaal indien nodig conditionering en vergroten protocol (stappen 4,1-5,5).

6. DNA Translocatie

1. Voorafgaand aan het toevoegen van een biomoleculaire monster uitvoeren van een controle-experiment om te verzekeren dat er geen verontreiniging in het reservoir. Schaf een huidige trace onder een aangelegde potentieel van 150-300 mV bij afwezigheid van een steekproef om te controleren dat er geen stroom blokkades worden gedetecteerd na 2 minuten.
2. Voeg λ DNA (48,5 kbp dubbelstrengs) aan de <em> cis reservoir voor een eindconcentratie van 0,5-2 ng / ul. Reflux zachtjes pipet tenminste 10 sec tot homogene verdeling van het monster in de gehele reservoir.
3. Voor een 30-nm dik nanopore, breng dan een mogelijke vertekening van 150-300 mV tot de trans reservoir en meet de ionische stroom die door de nanogaatje. Voor zeer korte translocatie gebeurtenissen, is het gewenst bemonsteren een hoge frequentie (250 kHz of hoger) met een relatief hoge laagdoorlaatfilter frequentie (100 kHz).
4. Bewaken van de ionische stroom gebruik van software om tijdelijke stroom blokkades detecteren moleculen translocatie door de nanogaatje. De ionische stroom sporen van moleculaire translocatie kan worden geanalyseerd om verstopping diepte, duur en frequentie informatie over het monster plaats afleiden bepalen. Omgekeerd, als informaties translokatie moleculen bekend, deze gegevens kunnen worden gebruikt om eigenschappen van de nanopore zelf onderzoeken.

Representative Results

De nanoporiën die in deze studie werden geboord in 30-nm of 10 nm dikke siliciumnitride membraan ramen. Hoewel de beschreven protocol kan worden toegepast op vaste stof nanoporiën van verschillende materialen vervaardigd met elke werkwijze worden zij gewoonlijk geboord door TEM met vooraf vastgestelde protocollen ^11,14. Nanoporiën geboord door TEM typisch tussen 4-8 nm in diameter (figuur 2). Terwijl zowel 30 nm en 10 nm dikke membranen kunnen worden gemonteerd en geconditioneerd met het bovenstaande protocol spanning biases beschreven verwijzen die nodig zijn voor 30-nm dikke membranen, tenzij anders vermeld. Voor membranen van verschillende grootte, zal de aangelegde spanning worden aangepast om een ​​elektrisch veld te genereren in het gebied van 0,15-0,3 V / nm in de nanoporiën.

Figuur 3a toont twee typische geleiding sporen van een 10-nm nanopore in een 30-nm dikke membraan voor en na behandeling met hoge elektrische velden. Bij montage van een nieuw dvulde nanopore, de kans op het verkrijgen van een instabiele en luidruchtige ionische stroom signaal, vertonen een hoge mate van laagfrequente fluctuatie, is meestal hoog. De in figuur 3a nanopore benadrukt dit probleem. De geleiding is aanzienlijk minder dan verwacht voor een nanogaatje van zijn grootte, waarschijnlijk als gevolg van onvolledige bevochtiging. Bij de toepassing van hoge elektrische velden van 0,27 V / nm in grootte door 8 V pulsen (90 pulsen van 2 seconden tijdsduur), de nanopore wordt volledig nat en vervolgens uitgebreid tot 21 nm in diameter. Op dit punt, de porie vertoont een stabiele geleiding met geluidsarme eigenschappen. Kwantitatieve analyse van ruis in soortgelijke nanoporiën weergegeven als spectrale densiteit percelen in figuur 3b. De laagfrequent geluid amplitude van unwet en / of verstopte poriën is zeer hoog (> 20 pA RMS), waardoor ze onbruikbaar experiment. Bij conditionering met hoge elektrische velden, geluid vermogen bij lage frequenties (<10 kHz) is diminished door tot 3 ordes van grootte en klaar voor geluidsarme experimenten.

Figuur 4a toont een typische stroommeting als de potentiële toegepast wordt gepulst tussen hoge elektrische velden voor het vergroten en laag elektrisch veld meetperioden. Na elke volgende puls, de resulterende ionenstroom door de nanopore op de meetspanning (de nanoporiën geleiding) toe met een eindige hoeveelheid. Dit toont aan dat de nanoporiën wordt vergroot, aangezien de diameter d kan worden afgeleid uit de conductantie G in een oplossing van geleidbaarheid σ, benadert de nanopore als hebbende cilindervormige geometrie van werkelijke lengte L _eff. Terwijl diverse andere modellen bestaan ​​voor het relateren nanogaatje geleiding zijn geometrie ^17,19-21, heeft de volgende relatie, die een meetkundige term en een toegang weerstand term bevat, is geldig bewezen voor TEM-geboord nanoporiën in hoog zoutgehalteconcentraties over een breed scala aan diameters van belang zijn voor dsDNA translocatie ^17,22.

Zodra de gewenste diameter wordt bereikt, wordt het proces automatisch gestopt door de software. De resulterende nanopore diameter kan dan worden bevestigd met IV nauwkeurige metingen, zie figuur 4b.

Het is belangrijk op te merken dat nanoporiën behandeld met hoge elektrische velden volledig functioneel. Dit wordt bevestigd door de detectie van λ DNA translocatie, zoals in de geleiding sporen in figuur 5a. In deze figuur wordt dsDNA aangedreven door twee nanoporiën die werden uitgebreid tot 11 nm en 32 nm met de beschreven werkwijze. In elk geval is de basislijn geleiding is zeer stabiel en helder blokkades waargenomen dsDNA molecules transloceren via nanopore, tonen hoge signaalGeluidsarme single-molecule translocatie gebeurtenissen in vergelijking met onbehandelde poriën die met veel lawaai vertonen. Zoals in de inzetten van figuur 5a worden meerdere discrete verstopping niveaus waargenomen individuele gevouwen moleculen verplaatsen, zoals verwacht voor nanoporiën van deze formaten. Histogrammen van de nanopore geleiding gedurende translocatie gebeurtenissen via elke porie worden getoond in figuur 5b. De geluidsarme eigenschappen van de nanoporiën onthullen duidelijke, gemakkelijk oplosbaar pieken die overeenkomen met de basislijn (geen DNA), single (een DNA-streng - ongevouwen) en dubbele blokkade staten (twee DNA-strengen - gevouwen). Opvallend is dat de verandering in geleiding correspondeert met een dsDNA molecuul bezetten de porie is verschillend voor de grote en kleine nanoporiën. Dit verschaft indirect bewijs dat de toepassing van hoge elektrische velden in feite uitbreiding bestaande nanoporiën, als dezelfde blokkade amplitude worden waargenomen wanneer andere poriën of scheuren werden gecreëerd in thij membraan tijdens het proces ^17.

Evenzo Figuur 6 illustreert de effectiviteit van hoge elektrische velden voor vergroting nanoporiën vervaardigd in membranen van verschillende dikte. Hier, een nanopore gemaakt in een 10-nm SiNx membraan is in eerste instantie gedeeltelijk unwet, het weergeven van instabiele en relatief kleine geleiding. Bij de toepassing van afwisselend ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulsen van 4 sec duur (30 in totaal), de nanogaatje nat en vertoont ideaal IV kenmerken voor een 3 nm porie. De methode werd vervolgens herhaald voor 400 daaropvolgende pulsen en de nanogaatje werd vergroot tot 8 nm. Deze uitbreiding, uitgevoerd bij vergelijkbare elektrische velden, maar lager aangelegde spanning vooringenomenheid dan voor nanopores gefabriceerd in 30-nm membranen, laat zien dat het proces is voornamelijk elektrisch veld gedreven. Aangezien de huidige blokkade translocatie door een dunnere membraan groter is dan die in dikkere poriën, nanoporiën in dunne membranende op deze wijze kunnen worden gebruikt om kortere moleculen zoals eiwitten met verhoogde gevoeligheid bestuderen.

Figuur 1. Nanopore celsamenstel. A siliciumnitride membraan dat een nanogaatje wordt geplaatst tussen siliconen elastomeer pakkingen, die op hun beurt samengedrukt door twee Teflon half-cellen met elektrolyt reservoirs. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Nanopore conditioning en uitbreiding setup. A nanopore geboord in een 30 nm dikke siliciumnitride membraan (links) verbindt twee elektrolyt reservoirs. Eencomputer wordt gebruikt om ofwel een patch-clamp versterker of externe voeding (DAQ-kaart) die een mogelijke vertekening van toepassing in het gehele nanopore via Ag / AgCl elektroden ondergedompeld in de elektrolyt reservoirs bedienen. De huidige versterker stuurt de ionische stroom gemeten worden gevolgd in real-time met behulp van computersoftware. Dit cijfer is aangepast [11]. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. Voor sporen voor en na toepassing van hoge elektrische velden. (A) Bij montage en zelfs na reiniging met piranha oplossing, de geleiding van de nanogaatje instabiel en minder dan verwacht voor een cilindrische 10-nm poriën (blauw). Na de toepassing van 2 seconden pulsen van 8 V, denanopore is volledig bevochtigd en uitgebreid, vertonen een stabiele geleiding en kan worden gebruikt voor biomoleculaire sensing experimenten (groen). (B) percelen spectrale vermogensdichtheid van een onvolledig bevochtigd en verstopte nanopore (blauw en oranje, respectievelijk). Na toepassing van 200 msec pulsen van 8 V, werden de nanoporiën bevochtigd en puin verwijderd (respectievelijk groen en rood,). Dit cijfer is aangepast [11]. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 4. Nanopore vergroten met behulp van hoge elektrische velden. (A) Afwisselend tussen uitbreiding en meting potentiële biases (rood) blijkt dat de ionische stroom door de nanogaatje (blauw) toeneemt in eindige stappen. De resulterende gedragAnce meting kan worden gebruikt om nanopore diameter afleiden. Zodra de gewenste diameter is bereikt, wordt het proces gestopt. (B) Precieze IV metingen van geleidbaarheid bevestigen dat nanopore maten zijn toegenomen. Dergelijke plaatsen een betere schatting van de poriegrootte dan een punt actuele waarden zij geschikt kunnen zijn en hun symmetrische en Ohmse gedrag kan worden bevestigd. Dit cijfer is aangepast [11]. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5. DNA translocatie door geconditioneerde nanoporiën. (A) de toevoeging van dsDNA (48,5 kbp) aan een zijde van de nanopore op een voorspanning van 150 mV produceert tijdelijke blokkades in de geleiding van sporen 11 nm (blauw) en 32-nm pores (rood). (B) Histogrammen van de geleidbaarheid van elk van de nanoporiën tonen discrete pieken die overeenkomen met de basislijn, enkele en dubbele translocatie gebeurtenissen. Dit cijfer is aangepast [11]. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 6. Uitbreiding van nanoporiën in 10 nm membranen. Een nanopore in een 10 nm membraan oorspronkelijk vertoont weinig geleiding en asymmetrische IV kenmerken (oranje). Bij de toepassing van 30 pulsen van afwisselend ± 3 V (4 sec duur), de nanogaatje plast en vertoont ideaal IV eigenschappen met een geleiding overeen met de verwachting voor een 3 nm porie (blauw). Een verdere 400 pulsen van ± 3 V vergroot de nanoporiën met een diameter van 8 nm(Groen). Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Controle van nanopore grootte is van fundamenteel belang in de biomoleculaire sensing toepassingen. Nanopore diameter moet in de orde van grootte van de moleculen wordt gesondeerd, en moet groot genoeg zijn om het monster tegemoet maar klein genoeg om een ​​optimale signaal-ruisverhouding te bereiken. Terwijl de controle van grootte met behulp van de gegeven van het toepassen van hoge elektrische velden methode is een richting in die nanopore diameters zijn alleen maar toegenomen gedurende het gehele proces, kan nanoporiën met een diameter tussen 3-100 nm ouderwets zijn, met subnanometer precisie. Aangezien 3-4 nm poriën gemakkelijk kan worden vervaardigd met een TEM ^23, dit zorgt voor een betrouwbare vervaardiging van solid-state nanoporiën voor een breed scala van toepassingen van sonderen ssDNA structuur om de interactie van volumineuze eiwit-ligand complexen. Terwijl nanopore groei boven 100 nm zeer snel en minder nauwkeurig kan zijn, kan meer gematigde vergroten voorwaarden toegepast om een ​​betere controle over het proces te realiseren. Al such, de belangrijkste stap voor het bereiken van effectieve grootte controle is de keuze van puls sterkte en duur om vergroting efficiëntie en precisie vereist het bereiken van een gewenste poriediameter evenwicht. Dit wordt verder benadrukt door de uitbreiding van dunnere nanoporiën (10-nm dikte), waar uitbreiding wordt waargenomen een lagere vooroordeel maar vergelijkbaar elektrische veldsterkte. Afhankelijk van de uiteindelijke grootte, is het meestal mogelijk om te vergroten een nanogaatje om sub-100-nm diameters in een paar minuten.

Ook grote laagfrequente stroom fluctuaties beletsel werkende moleculen studies aangezien het bijna onmogelijk om translocatie signalen te onderscheiden van achtergrondruis. Onvolledige bevochtiging ^24, kan de aanwezigheid van koolstofhoudende residuen gaan na de eerste vervaardiging ²⁵ en adsorptie van vuil op de nanoporiën wand ¹³ signaalkwaliteit verminderen, die extra reiniging met agressieve chemische behandelingen die vaak inefficacious. Interessant, is het gebruikelijk voor solid-state nanogaatje protocollen op het belang van het reinigen van de nanogaatje in piranha oplossing of met zuurstof plasma voor de montage bevochtiging helpen of te verwijderen besmetting overblijft van het boren, beeldvorming en handling processen te benadrukken. Zelfs met deze behandeling echter nanopores doen vaak niet nat of blijven hoge ruis vertonen, en de voorgestelde oplossing voor de mislukte pogingen is om extra schoonmaakkosten die zeer tijdrovend ¹⁴ kan uitvoeren. Met de toepassing van hoge elektrische velden, kunnen deze lange protocollen niet nodig zijn afhankelijk van de toepassing. Het bleek dat de meeste apparaten kunnen worden gereviseerd in situ met de hierin beschreven werkwijze, bijgevolg verminderen voorbereidingstijd en de noodzaak om te gaan met agressieve chemicaliën. De belangrijkste stappen in het verminderen van elektrische ruis is een eenvoudige verhoging van de spanning en / of pulsduur volledig nat de poriën en verwijdert losjes gebonden puin.Nanoporiën de op deze wijze betrouwbaar kan worden gebruikt in biomolecuul translocatie experimenten, zoals de doorgang van DNA en eiwitten. Als deze moleculen zich aan de porie muur leidt tot een verstopte en lawaaierige elektrisch signaal, kan hoog elektrisch veld pulsen opnieuw worden toegepast op de obstructie te verwijderen en weer geluidsarme eigenschappen voor verdere experimenten, zonder ontkoppelen van de nanogaatje chip van de vloeibare cel.

De toepassing van hoge elektrische velden met de beschreven configuratie wordt beperkt door de eis van een externe voeding die kan gelden voor 10 V en stroomversterker, die de gevoeligheid en geluidsarme eigenschappen bij hoge bandbreedte (> 1 kHz) ontbreekt voor single molecule detectie. Terwijl typische biomoleculaire experimenten rekenen op een low-noise huidige versterker die is beperkt tot ± 1 V, is het eenvoudig om een ​​systeem dat zowel een hoog elektrisch veld van airconditioning en gevoelige stroommeting zou kunnen bereiken met een adju ontwerpenstabiele winst. Ondanks deze beperking, de overgang van de ene instelling naar de andere is snel en eenvoudig. In vergelijking met bestaande technieken voor nanoporiën formaat zoals het gebruik van SEM ^5, thermische oxidatie en membraan hervormen ^8, hoge elektrische velden hebben een sneller, nauwkeuriger en goedkopere methoden die kunnen worden uitgevoerd op de laboratoriumtafel met standaarduitrusting en bieden een breder scala van nanopore maten. De mogelijkheid om laagfrequent geluid snel en reproduceerbaar te verminderen maakt ook aanvankelijke fabricage betrouwbaarder en verlengt de levensduur van solid-state nanoporiën, zoals eerder gebruikt poriën kan worden verjongd voor verdere experimenten. In totaal meer dan 95% van nanoporiën van verschillende diktes van airconditioning met een hoge elektrische velden vertoonden weinig laagfrequent geluid karakteristiek, waardoor ze geschikt zijn voor biomolecuul sensing. Fabrication is dus eenvoudiger en betrouwbaarder, waardoor solid-state nanogaatje experimenten meer accessiBLE onderzoekers en mogelijk waardoor een weg naar commercialisering van nanopore technologieën door middel van meer robuuste fabricage processen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM-2100F TEM	JEOL		Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier	Molecular Devices		Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card	National Instruments	PCI-6351	Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software	National Instruments		Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier	Keithley		Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005X	Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005Z	Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings	Marian Chicago	HT6135	Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes	In Vivo Metric	E255
Nitric acid	Fisher Scientific	52004P	Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H323	Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300	Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride	Fisher Scientific	P335
HEPES	Fisher Scientific	BP310	Buffering KCl solution
Primary Faraday cage			Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage			Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell			To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate	VWR		Heating piranha solution