Finjustera storlek och minimera buller av Solid-state Nanopores

Summary

En metod för framställning av halvledarnanoporer i lösning för biomolekylära transloka experiment presenteras. Genom att tillämpa korta pulser av höga elektriska fält, kan nanopore diameter vara reglerbart förstoras med subnanometer precision och dess elektriska bulleregenskaper förbättrats avsevärt. Denna procedur utförs in situ med användning av standardlaboratorieutrustning under experimentella förhållanden.

Abstract

Solid-state nanopores har dykt upp som ett mångsidigt verktyg för karakterisering av enskilda biomolekyler såsom nukleinsyror och proteiner ^1. Men skapandet av en nanopore i ett tunt isolerande membran är fortsatt utmanande. Tillverkningsmetoder som involverar specialiserade fokuserad elektronstrålesystem kan producera väldefinierade nanoporer, men avkastningen av pålitliga och tystgående nanoporer i kommersiellt tillgängliga membran är fortsatt låg ^2,3 och storlek kontroll är nontrivial ^4,5. Här, tillämpning av höga elektriska fält för att finjustera storleken på nanopore samtidigt säkerställa en optimal låg-brusprestanda demonstreras. Dessa korta pulser av höga elektriska fält används för att producera en ren elektrisk signal och möjliggör utvidgning av nanoporer med subnanometer precision vid långvarig exponering. Denna metod utföres in situ i en vattenhaltig miljö med användning av standardlaboratorieutrustning, förbättra utbytet och reproducerbarhet solid-state nanopore tillverkning.

Introduction

Biologisk och solid-state nanopores tillhandahålla ett sätt att känna av biomolekylära analyter vid enda molekyl nivå ^1. Individuella nanoporer är vanligtvis inbäddade i tunna isolerande membran, som ger den enda kanal för jonisk ström att passera mellan två flytande reservoarer. Med hjälp av principerna för storskaliga Coulter räknare, nanopore experiment relatera förändringar i jonström att bestämma längd, storlek, laddning och konformation av laddade biomolekyler som de elektro drivs genom en nanopore i närvaro av ett yttre elektriskt fält.

Även biologiska nanoporer såsom α-hemolysin erbjuder ofta större känslighet och låg brusegenskaperna ^3, är den bärande lipidbiskiktet bräcklig och av fast storlek, vilket begränsar deras användbarhet. Solid-state nanoporer, å andra sidan, är tillverkad i tunt (10-50 nm) kiselnitrid eller kiseloxidmembran och kan vara gjorda av olika sizes, lätt integreras med wafer-skala teknik ^6,7, och är mer robusta, vilket möjliggör ett bredare spektrum av experimentella förhållanden. Trots dessa fördelar, halvledarteknik nanopore lider av flera praktiska nackdelar som begränsar deras användbarhet för biomolekylära studier. Även kontroll av nanopore storlek är möjligt, är det oftast dyrt och besvärligt att uppnå, som kräver specialutrustning och kompetent personal. Till exempel nanoporer borrade genom fokuserad-jonstråle har nyligen visat att krympa under specifika experimentella betingelser i ett svepelektronmikroskop (SEM) ^5. Med andra metoder kan nanoporer borrade genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) expandera eller krympa beroende på balkförhållanden och efterföljande exponering för vattenhaltiga lösningsmedel ^8. I dessa fall är begränsad, svår att kontrollera och även otillförlitliga den uppnå intervallet nanopore storlekar som storleken nanoporen kan förändras till följd av kemisk behandling ellernär nedsänkt i en speciell vätska miljö ^9.

Jonströmmen genom solid-state nanopores kan också drabbas av högt buller, källorna som är en intensivt undersökt ämne i nanopore litteraturen ^2,3,10,11. Medan olika metoder har föreslagits för att minska elektriska störningar, är utbytet av tillförlitliga, stabila låg brusnanoporer vanligtvis lågt. Deponering av kolhaltiga rester vid borrning och bildbehandling kan ha skadliga effekter på den elektriska signalkvalitet, vilket ofta gör fullständig vätning en utmaning och orsakar bildandet av nanobubbles som kan vara svåra att ta bort ^12. Dessutom igensättning av nanopore med analytmolekyler försämrar signalkvaliteten rendering porer oanvändbar för vidare experiment ^13,14. Sammantaget dessa effekter kraftigt minska utbytet av funktionella nanopore enheter och öka kostnaderna i samband med solid-state nanopore forskning.

Tillämpningenning av en spänning med Ag / AgCl-elektroder för att producera höga elektriska fält i intervallet 0,15 till 0,3 V / nm uppvisar en förvånansvärt enkel lösning på dessa utmaningar. Genom den cykliska tillämpningen av korta spänningspulser, en ren, lågt brus nanopore yta idealisk för enda molekyl studier produceras. Långvarig exponering för höga elektriska fält initierar avlägsnandet av membranmaterialet som bildar por vägg, vilket resulterar i en ökning av nanopore diameter. Denna tillväxt kan justeras genom att ställa puls styrka och varaktighet. Som nuvarande spår degraderar under loppet av ett experiment på grund av igensättning av nanopore som molekyler adsorberas till nanopore ytan, kan denna process upprepas för att återställa igensatta anordningar som annars skulle ha kasse. Som sådan är utbytet av funktionella nanoporer ytterligare ökas genom förmågan att använda samma apparat flera gånger. Denna metod ger flera fördelar, eftersom det snabbt utföras i vätskan under experimentellförhållanden, kräver endast standardlaboratorieutrustning, kan automatiseras med programvara, och producerar funktionella högkvalitativa nanoporer med en avkastning på över 95%.

Protocol

1. Nanopore Fabrication och rengöring

OBS: När en nanopore existerar i ett isolerande membran kan den monteras direkt i vätskan cellen utan vidare bearbetning eller rengöring, enligt beskrivningen i steg 2. Men om det är nödvändigt för att avlägsna spår av föroreningar mellan experiment, nanopore chips kan rengöras med användning av antingen Piranha lösning ^3,15,16 (3:01 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ eller genom exponering för syreplasma ^2. Som sådant steg 1,2-1,9 i följande protokoll är valfria om förrening genom exponering för Piranha-lösning är inte nödvändig.

1. Degas filtrerat avjoniserat (DI) vatten genom att placera under vakuum i en sonikator under 30 min vid 40 ° C.
2. Förbered Piranha-lösning i en 10 ml bägare genom försiktig tillsats av 3 ml svavelsyra, följt av 1 ml väteperoxid. Blanda noggrant genom återloppskokning i pipetten. VARNING: Piranha-lösning är extremt farligt. Vänligen TA ke alla försiktighetsåtgärder.
3. Med hjälp av syrabeständigt pincett, försiktigt in nanopore innehåller membranchipsidan först in i piraya lösningen att helt dränka chip och undvika det som flyter på ytan.
4. Skölj pincett noggrant i filtrerat vatten.
5. Placera bägaren på en värmeplatta förinställd på 90 ° C och låt den att städa i minst 30 minuter.
6. Ta försiktigt bort piraya lösningen från bägaren med en ren glas pipett och kassera in stora mängder vatten.
7. Med hjälp av ett rent glas pipett 5 ml av den avgasat avjoniserat vatten från steg 1.1 i bägaren att skölja. Ta bort vattnet och upprepa minst 5x.
8. Ta försiktigt bort nanopore chip från bägare med rena skarpa-tip pincett. Hanteras med yttersta försiktighet eftersom nanopore membranet är mycket bräcklig.
9. Torka chipet genom att försiktigt applicera sug på sin kant med hjälp av en sug. Förvara chip i en ren petriskål tills klar för användning.

ve_title "> 2. Montering av Nanopore

1. Rengör Teflon nanoporen cell (fig. 1) genom att placeras i 20% salpetersyralösning och kokning under 10 minuter. VARNING: Använd all nödvändig personlig skyddsutrustning och hantera syror med omsorg.
2. Ta försiktigt bort cellen från salpetersyra och placera i kokande avjoniserat vatten i 10 min.
3. Koka den cell i Dl-vatten under ytterligare 10 min för att säkerställa fullständig borttagning av salpetersyra. Ta bort bägaren från värmeplattan och låt den svalna till rumstemperatur.
4. Ta bort cellen från bägaren och föna med filtrerad luft eller _N2. Förvara cell i en ren petriskål.
5. Degas filtrerad KCl-lösning (buffrad med HEPES vid pH 8) genom att under vakuum i en sonikator under 30 min vid 40 ° C.
6. Rena två silikonbaserade elastomera packningar för varje nanopore chip genom sonikering i etanol i minst 10 min.
7. Placera nanopore chip på en ren elastomer packning vara careful att anpassa membranet fönster med packningsöppningen. Placera och rikta en andra packning ovanpå chipet.
8. Placera chip och packningar på reservoaren inloppet hos en halv av den rengjorda nanoporen cellen. Montera cell genom att skruva den andra hälften på plats. En sprängskiss av komponenterna nanopore cell visas i figur 1.
9. Blöt nanopore chip genom att pipettera etanol i cell reservoarer och placera i en vakuumkammare till för några bubblor ses för att avsluta inlopp.
10. Avlägsna etanol genom spolning behållarna med minst 3 ml avgasad filtrerades KCl-lösning. Var noga med att ta bort spill med hjälp av en sug.

3. Nanopore Karakterisering

1. Placera nanopore cellen i elektriskt skärmade experimentuppställning och placera Ag / AgCl-elektroder i varje behållare. Denna inställning är liknande den som visas i figur 2 med undantag för den externa strömförsörjningen och strömförstärkare som ärersätts med en låg brus resistiv återkopplingsförstärkare.
2. Använda lågbrusförstärkaren i spänning-clamp läget gäller potentialer som sveper från -200 mV till 200 mV och spela in IV egenskaper.
3. Montera IV-kurvan för att få nanopore konduktans, som kan användas för att beräkna dess diameter i lösningen ^17. Om den beräknade diametern är mycket mindre än förväntat från TEM avbildning, är por sannolikt inte helt fuktade och / eller innehåller skräp eller föroreningar.
4. Applicera en 200 mV potential över nanoporen och registrera jonströmmen för 30 sek.
5. Utför en effektspektrum (PSD) analys av den joniska ström och integrera för att kvantifiera de elektriska brusegenskaper nanopore. Om bullret är över 15 pA RMS vid 5 kHz bandbredd, då är det por sannolikt inte helt fuktade och / eller innehåller föroreningar och kan inte användas på ett tillförlitligt sätt i experiment.

4. Conditioning Nanopores Använda High Electric FieLDS

Obs: Om IV kurvan genereras uppvisade asymmetri eller mindre än väntat konduktans, eller den nuvarande spår visade instabilitet och höga ljudnivåer vid låga frekvenser, är det nödvändigt att konditionera nanoporen med höga elektriska fält för att avlägsna eventuella föroreningar på por yt-och / eller väta por. Även om denna metod inte påverkar den högfrekventa ljud som förorsakas av membranets kapacitans eller någon parasitisk kapacitans kopplad till ingången på strömförstärkaren som används i mätningarna kan lågfrekvent brus (även kallad 1 / f brus) ¹⁸ att minska avsevärt. En schematisk bild av installationen användas för att utföra denna konditionering är visad i fig 2.

1. Koppla bort elektroderna från patch-clamp förstärkare.
2. Anslut en av elektroderna till en datorstyrd strömförsörjning kan generera> 6 V (> 0,2 V / nm elektrisk fältstyrka för de 30-nm tjocka membran som används här) och den andra till en eXTERNA strömförstärkare som kan övervakas i realtid.

   OBS: Tillämpningen av höga elektriska fält kan användas för att påverka nanoporer i olika membran material och tjocklekar. Även om båda 30 nm och 10 nm-membran diskuteras här, spänningar beskrivs hänvisas till de som används för 30-nm tjocka membran om inget annat anges.

3. Applicera en spänningsskillnad på 400 mV (mätspänning) över nanoporen i minst 5 sekunder.
4. Beräkna medelströmvärdet från den sista 1 sek av uppgifter för att bestämma ledningsförmåga nanopore. Beräkna diameter nanopore utifrån detta konduktans, vilket bör göras automatiskt med hjälp av mjukvaran och nanopore konduktans modell val baserat på det mest troliga geometri. Det bör motsvara diametern mätt från IV-kurvan.
5. Applicera en 200 ms puls på 6 V (vätning spänning) över nanopore att producera ett elektriskt fält på 0,2 V / nm följt av en mätperiod 5 sekvid 400 mV. Återigen, beräkna en diameter av nanoporen använder den slutliga 1 sekund av data och jämför med det värde som förväntas från TEM-mätningar för att säkerställa att nanoporen är helt våt. Om nödvändigt, upprepa flera gånger.
6. Om så är nödvändigt upprepa appliceringen av höga elektriska fältpulser med ökande spänning tills den aktuella signalen under mätperioden är stabil och visar den förväntade konduktans. Det rekommenderas inte att överstiga 10 V (dvs.> 0,3 V / nm), eftersom detta kan avsevärt förstora eller skada nanopore snabbt.

5. Förstoring Nanopores Använda höga elektriska fält

Obs: Diametern för nanoporen är avgörande för dess funktion för en särskild biomolekylär sensing ansökan. För detta ändamål, en nanopore som skapats med ett TEM kan förstoras till önskad storlek genom att tillämpa höga elektriska fält tills lämplig diameter uppnås med samma inställning som används för att rengöra och fuktananopore (Figur 2).

1. Genom att använda samma elektroniska konfiguration som i del 4, tillämpar en 200-500 mV partiskhet över por att få mätning diameter. Även mindre exakt än montera en IV kurva, kan en enda mätning användas för att grovt uppskatta nanopore storlek snabbt.
2. Applicera en 2 sek puls av 8 V över nanoporen följt av en mätperiod av minst 5 sekunder vid 400 mV. Beräkning av den nya diametern normalt visar en mycket liten ökning av nanopore storlek (<0,1 nm).
3. Upprepa denna process cykliskt, alternerande mellan spänningarna utvidgningen och mätning för att få på plats och realtidsmätningar av ökande nanopore diameter.
4. Om snabbare tillväxttakt är önskvärd, öka storleken på den spänning som stegvis upp till 10 V. Tillväxt normalt accelerera som den por förstoras med ökningstakten i konduktans mellan 0.03 nS / s ec & #160; till 10 nS / sekund, beroende på storleken av nanoporen, styrkan hos det elektriska fältet och elektrolytlösning egenskaper.
5. När den önskade diametern har uppnåtts, avbryta tillämpningen av höga elektriska fält. Detta kan göras automatiskt med hjälp av datorprogrammet.
6. Anslut patch-clamp förstärkare till elektroderna.
7. Förvärva nya IV och nuvarande spårdata vid 200 mV för att bekräfta diameter nanoporen och kontrollera lågbrusiga strömsignaler som i stegen 3,2 till 3,5 ovan. Om nödvändigt, upprepa konditionering och utvidga protokoll (steg från 4,1 till 5,5).

6. DNA Sloka

1. Innan man tillsätter en biomolekylär prov, utför ett kontrollexperiment för att säkerställa att det inte finns någon kontaminering i behållaren. Skaffa en aktuell spår under en pålagd potential av 150-300 mV i frånvaro av något prov för att kontrollera att inga aktuella blockader detekteras efter 2 min.
2. Lägg λ-DNA (48,5 kb dubbelsträngat) till <em> cis reservoar för en slutlig koncentration av 0,5 till 2 ng / | il. Återflöde försiktigt med pipett i minst 10 sekunder för att säkerställa homogen fördelning av provet i hela behållaren.
3. För en 30-nm tjockt nanopore, tillämpa en potentiell bias på 150-300 mV till trans reservoaren och mäta den joniska ström passerar genom nanopore. För mycket korta sloka händelser är det önskvärt att sampla vid en hög frekvens (250 kHz eller mer) med en relativt hög lågpassfiltrering frekvens (100 kHz).
4. Övervaka jonströmmen med hjälp av programvara för att detektera transienta ström blockader som molekyler translocate genom nanopore. De joniska nuvarande spår av molekylär sloka kan analyseras för att bestämma blockering djup, varaktighet och frekvens för att sluta sig till information om provet av intresse. Omvänt, om information om transloca molekyler är känd, denna information kan användas för att undersöka egenskaperna hos nanoporen självt.

Representative Results

De nanoporer användes i denna studie borrades i 30-nm eller 10 nm tjock kiselnitrid membranfönster. Medan det protokoll som beskrivs kan appliceras på solid-state nanopores av olika material som tillverkats med hjälp av någon metod, de är vanligen borrad av TEM med hjälp av tidigare fastställda protokoll ^11,14. Nanopores borrade av TEM är vanligtvis mellan 4-8 nm i diameter (figur 2). Även om båda 30 nm och 10 nm tjocka membran kan monteras och konditioneras med användning av ovanstående protokoll, spänning förspänner beskrivna hänvisa de som krävs för 30-nm tjocka membran om inget annat anges. För membran av olika storlek, bör den pålagda spänningen justeras för att generera ett elektriskt fält i området av från 0,15 till 0,3 V / nm inuti nanoporen.

Figur 3a visar två typiska konduktans spår av en 10-nm nanopore i en 30-nm tjockt membran före och efter behandling med höga elektriska fält. Vid montering av en ny drilled nanopore, är sannolikheten för att få en instabil och bullriga joniska strömsignal, som uppvisar en hög grad av lågfrekventa svängningar, oftast hög. Nanoporen visas i fig. 3a belyser detta beteende. Dess konduktans är betydligt mindre än förväntat för en nanopore av sin storlek, troligtvis på grund av ofullständig vätning. Vid tillämpning av höga elektriska fält av 0,27 V / nm i storlek produceras av 8 V-pulser (90 pulser av 2 sek varaktighet) blir nanoporen helt våta och därefter förstoras till 21 nm i diameter. Vid denna punkt, uppvisar den por en stabil konduktans med tystare egenskaper. Kvantitativ analys av buller i liknande nanoporer visas såsom spektraltäthet tomter i figur 3b. Den lågfrekventa buller amplitud unwet och / eller tilltäppta porer är mycket hög (> 20 pA RMS), vilket gör dem oanvändbara i experimentet. Efter konditionering med höga elektriska fält, buller effekt vid låga frekvenser (<10 kHz) är diminished med upp till 3 tiopotenser och redo för låg ljudnivå experiment.

Figur 4a visar en typisk strömmätning som potentialen tillämpas pulsas mellan höga elektriska fält för att utvidga och låga mätperioder elektriska fält. Efter varje efterföljande puls, ökar den resulterande joniska strömmen genom nanopore vid mätningsspänning (dvs. nanopore konduktans) med en begränsad mängd. Detta visar att nanopore ökar i storlek, eftersom diametern d kan härledas från dess konduktans G i en lösning av ledningsförmåga σ, approximerar nanoporen ha cylindrisk geometri effektiv längd l _eff. Medan flera andra modeller finns för rör nanopore konduktans till sin geometri ^17,19-21, har följande samband, som innehåller en geometrisk sikt och en tillgång motstånds sikt visat sig gälla för TEM-borrade nanoporer i hög saltkoncentrationer, över en rad olika diametrar av intresse för dsDNA sloka ^17,22.

När den önskade diametern har uppnåtts, är processen automatiskt stoppas av programvaran. Kan sedan bekräftas Den erhållna nanopore diameter använda exakta mätningar IV, såsom visas i fig 4b.

Det är viktigt att notera att nanoporer som behandlats med användning av höga elektriska fält är fullt funktionella. Detta är validerad genom detektering av λ DNA sloka, som visas i konduktans spår som presenteras i figur 5a. I denna figur är dsDNA drivs genom två nanoporer som förstorades till 11 nm och 32 nm med användning av den beskrivna metoden. I varje fall är extremt stabil baslinje konduktans och tydliga blockader observeras som dsDNA-molekyler translokera genom nanopore, visar högt signal-Buller enda molekyl slokahändelser jämfört med obehandlade porer som uppvisar höga ljud. Såsom visas i inläggningar av figur 5a, finns flera diskreta blockeringsnivåer observeras som individuellt vikta molekyler translocate, som förväntat för nanoporer av dessa storlekar. Histogram av nanopore konduktansen under transloka händelser genom varje por visas i figur 5b. De tystgående egenskaper hos nanoporer avslöjar tydliga, lätt upplösbara toppar motsvarande baslinjen (inget DNA), singel (en DNA-sträng - ovikt) och dubbla blockeringstillstånd (två DNA-strängar - vikta). Att notera är att förändringen av konduktans som motsvarar en enda dsDNA-molekyl upptar por är olika för de stora och små nanoporer. Detta ger indirekta bevis för att tillämpningen av höga elektriska fält är i själva verket utvidga befintliga nanoporer, som samma blockering amplitud skulle observeras om andra porer eller sprickor skapas i than membran under processen ^17.

På liknande Figur 6 illustrerar effektiviteten av höga elektriska fält för att utvidga nanoporer fabricerade i membran med olika tjocklek. Här är en nanopore skapats i en 10-nm SiNx membran initialt delvis unwet, visar instabila och relativt små konduktans. Vid tillämpningen av omväxlande ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulser av 4 sek varaktighet (30 totalt), blir nanopore våt och uppvisar ideala IV egenskaper för en 3 nm por. Metodiken upprepades sedan för 400 efterföljande pulser och nanopore utvidgades till 8 nm. Denna utvidgning, som utförs vid jämförbara elektriska fält men lägre pålagd spänning partiskhet än för nanoporer tillverkade i 30 nm-membran, visar att processen är i huvudsak elektriskt fält driven. Eftersom den nuvarande blockaden producerad av translokation genom ett tunnare membranet är större än den som produceras i grövre porer, nanoporer i tunna membranbehandlas på detta sätt kan användas för att studera kortare molekyler, såsom proteiner med ökad känslighet.

Figur 1. Nanopore cellmontering. En kiselnitrid membran som innehåller en nanopore är placerad mellan silikonelastomerpackningar, som i sin tur komprimeras av två Teflon halvceller som innehåller elektrolytbehållarna. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Nanopore konditionering och utvidga installationen. En nanopore borras i en 30 nm tjockt kiselnitrid membran (vänster) förbinder två elektrolytbehållarna. ETTDatorn används för att styra antingen en patch-clamp förstärkare eller extern strömförsörjning (DAQ-kort) som gäller en eventuell bias över nanoporen via Ag / AgCl elektroder som är nedsänkta i elektrolyten reservoarer. Den nuvarande förstärkare förmedlar jonströmmen mäts som skall övervakas i realtid med hjälp av datormjukvara. Denna siffra har modifierats [11]. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Observationer spår före och efter applicering av höga elektriska fält. (A) Efter montering, och även efter rengöring med Piranha-lösning, är konduktans nanoporen instabil och mindre än väntat för en cylindrisk 10-nm porstorlek (blå). Efter appliceringen av 2 sek pulser av 8 V, dennanopore är helt fuktade och förstorad, uppvisar en stabil ledningsförmåga och kan användas för biomolekylära kännande experiment (grön). (B) spektraltäthet tomter på ett ofullständigt fuktade och tilltäppta nanopore (blå och orange, respektive). Vid tillämpning av 200 ms pulser av 8 V, var nanoporer vätta och skräp tas bort (grönt och rött, respektive). Denna siffra har modifierats [11]. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Nanopore utvidga använder höga elektriska fält. (A) Växla mellan utvidgningen och mätning eventuella fördomar (röd) visar att den joniska strömmen genom nanopore (blå) ökar i ändliga steg. Den resulterande beteenderingsmätning kan användas för att sluta sig till nanopore diameter. När väl har uppnåtts den önskade diametern, är processen stoppas. (B) Exakta IV mätningar av konduktans bekräftar att nanopore storlekar har ökat. Sådana tomter ger en bättre uppskattning av porstorlek än single-point aktuella värden som de kan vara i form och deras symmetriska och Ohmskt beteende kan bekräftas. Denna siffra har modifierats [11]. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5. DNA-translokation genom rade nanoporer. (A) Tillsats av dsDNA (48,5 kb) på ena sidan av nanopore vid en bias på 150 mV ger övergående blockader i konduktansen spår av 11-nm (blå) och 32-nm pores (röd). (B) Histogram av konduktansen av var och en av de nanoporer visar diskreta toppar motsvarande baslinjen, enkel-och dubbel-translokahändelser. Denna siffra har modifierats [11]. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6. Utvidgningen av nanoporer i 10 nm membran. En nanopore i en 10 nm membran ursprungligen uppvisar mycket lite konduktans och asymmetriska IV egenskaper (apelsin). Vid tillämpningen av 30 pulser av alternerande mellan ± 3 V (4 sek varaktighet), nanopore väter och uppvisar ideala IV fastigheter med en konduktans som överensstämmer med den som förväntas för en 3 nm por (blå). Ytterligare 400 pulser av ± 3 V förstorar nanoporen till en diameter av 8 nm(Grön). Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Kontroll av nanopore storlek är av grundläggande betydelse i biomolekylära analystillämpningar. Nanopore diameter måste vara på order av storleken på de molekyler som sonderade, de måste vara tillräckligt stor för att rymma provet men tillräckligt liten för att uppnå optimal signal-till-brus. Även kontrollen av storlek med hjälp av den metod som presenteras att tillämpa höga elektriska fält är enkelriktad i att nanopore diametrar bara ökat under hela processen, kan nanoporer med diametrar mellan 3-100 nm vara gammalmodiga, med subnanometer precision. Som 3-4 nm porer lätt kan tillverkas med hjälp av en TEM ^23, gör detta för tillförlitlig tillverkning av solid-state nanopores för ett brett spektrum av applikationer från sondering ssDNA struktur för samverkan mellan skrymmande protein-ligand-komplex. Medan nanopore tillväxt över 100 nm kan vara mycket snabb och mindre exakt, kan mer moderata förstorande villkor användas för att få bättre kontroll över processen. Som such, är det viktigaste steget för att uppnå en effektiv storlek styr valet av pulsstyrka och längd för att balansera utvidgad effektivitet och precision som krävs för att uppnå en önskad pordiameter. Detta belyses ytterligare av utvidgningen av tunnare nanoporer (10-nm tjocklek), där utvidgningen observeras ett lägre partiskhet men jämförbar elektrisk fältstyrka. Beroende på den slutliga storleken, är det i allmänhet möjligt att förstora en nanopore till sub-100-nm diameter på några få minuter.

Likaså stora lågfrekventa strömsvängningar utesluter enda molekyl studier eftersom det är nästan omöjligt att skilja sloka signaler från bakgrundsljud. Ofullständig vätning ²⁴ kan närvaron av kolhaltiga rester som återstår efter initial tillverkning ²⁵ och adsorption av skräp på nanoporen vägg ¹³ försämra signalkvaliteten, vilket kräver ytterligare rengöring med starka kemiska behandlingar som ofta är inefficacious. Intressant nog är det vanligt att solid-state nanopore protokoll för att betona vikten av rengöring av nanopore i piraya-lösning eller med syrgasplasma innan montering för att underlätta vätning eller ta bort föroreningar kvar från borrning, bild-och hanteringsprocesser. Även med denna behandling är dock nanoporer gör ofta inte våt eller fortsätter att uppvisa höga ljud, och den föreslagna lösningen för misslyckade försök är att utföra extra städning som kan vara mycket tidskrävande ^14. Med tillämpning av höga elektriska fält, kan dessa långa protokoll inte vara nödvändigt beroende på tillämpning. Det visade sig att de flesta enheter kan renoveras på plats med hjälp av den metod som beskrivs här, alltså minska förberedelsetid och behovet av att ta itu med starka kemikalier. De viktigaste stegen i att lindra elektriska störningar är en enkel ökning av spänning och / eller pulslängd för att helt väta porerna och ta bort löst bundet skräp.Nanopores som behandlats på detta sätt kan på ett tillförlitligt sätt kan användas i biomolekyl sloka experiment, såsom passagen av DNA och proteiner. Om dessa molekyler ansluta sig till por väggen som leder till en igensatt och högljudd elektrisk signal, kan höga elektriska fältpulser appliceras på nytt för att avlägsna hindret och återfå låg brusegenskaper för ytterligare experiment, utan att lossa på nanopore chip från fluidic cellen.

Tillämpningen av höga elektriska fält med installationen som beskrivs begränsas av kravet på en extern strömkälla som kan gälla upp till 10 V och strömförstärkare, som saknar den känslighet och låg brusegenskaperna vid hög bandbredd (> 1 kHz) för enda molekyl avkänning. Medan vanliga biomolekylära experiment förlita sig på en låg brusströmförstärkare som är begränsad till ± 1 V, är det enkelt att utforma ett system som kunde åstadkomma både hög elektrisk fältkonditionering och känslig strömmätning med en anpassar sig efter typenstabil vinst. Trots denna begränsning, är övergången från en inställning till en annan snabb och okomplicerad. I jämförelse med existerande teknik för kontroll av nanopore storlek såsom användning av SEM ^5, termisk oxidation och membran omforma ^8, höga elektriska fält ger en snabbare, mer exakt och mindre kostsam metod som kan utföras på laboratoriebänken med hjälp av standardutrustning och ger ett bredare utbud av nanopore storlekar. Förmågan att snabbt och reproducerbart reducerar lågfrekventa ljud gör också initial tillverkning mer tillförlitlig och förlänger livslängden på solid-state nanopores, som tidigare använts porer kan föryngras för ytterligare experiment. Totalt över 95% av nanoporer av varierande tjocklek rade med höga elektriska fält uppvisade mycket lite lågfrekvent buller egenskap, vilket gör dem lämpliga för biomolekyler avkänning. Fabrication är således enklare och mer tillförlitlig, vilket gör solid-state nanopore experiment mer gängligt för forskare och potentiellt möjliggör en väg mot kommersialisering av nanopore teknik genom mer robusta tillverkningsprocesser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM-2100F TEM	JEOL		Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier	Molecular Devices		Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card	National Instruments	PCI-6351	Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software	National Instruments		Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier	Keithley		Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005X	Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005Z	Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings	Marian Chicago	HT6135	Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes	In Vivo Metric	E255
Nitric acid	Fisher Scientific	52004P	Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H323	Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300	Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride	Fisher Scientific	P335
HEPES	Fisher Scientific	BP310	Buffering KCl solution
Primary Faraday cage			Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage			Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell			To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate	VWR		Heating piranha solution