Summary
الوقت الفاصل بين المجهري يسمح التصور من العمليات التنموية. النمو أو الانجراف العينات خلال الحصول على الصور يقلل من القدرة على متابعة بدقة وقياس الحركات الخلية أثناء التطور. وصفنا استخدام المصدر المفتوح برامج معالجة الصور لتصحيح العينة لمدة ثلاثة الأبعاد الانجراف مع مرور الوقت.
Abstract
توليد رباعي الأبعاد (4D) مجموعات البيانات متحد البؤر؛ تتألف من تسلسلات الصور 3D مع مرور الوقت؛ يوفر منهجية ممتازة لالتقاط السلوكيات الخلوية المشاركة في العمليات التنموية. القدرة على تتبع ومتابعة تحركات الخلية محدودة بسبب الحركات العينة التي تحدث بسبب الانجراف من العينة، أو في بعض الحالات، والنمو خلال الحصول على الصور. وسوف تتبع الخلايا في مجموعات البيانات تتأثر الانجراف و / أو النمو إدماج هذه الحركات في أي تحليل للموقف الخلية. وهذا قد يؤدي في الحركة واضح من هياكل ثابتة ضمن العينة. لذا قبل خلية تتبع، وينبغي تصحيح أي عينة الانجراف. استخدام المصدر المفتوح فيجي توزيع 1 من يماغيج 2،3 والأدوات الامكنه أدرجت 4، قمنا بتطوير 3D الانجراف في المكونات الصحيحة لإزالة الحركة عينة الخاطئة في مجموعات البيانات متحد البؤر. هذا البروتوكول يعوض فعال للترجمة عينة أو تغييرات في بو التنسيقsition من خلال الاستفادة من مرحلة الارتباط لتسجيل كل نقطة مرة من مجموعات البيانات متحد البؤر رباعي الأبعاد مع الحفاظ على القدرة على تصور وقياس الحركات الخلية على تمديد التجارب مرور الزمن.
Introduction
ويستخدم على نطاق واسع التصوير متحد البؤر في الخلية والبيولوجيا التطورية لمتابعة تحركات الخلية والتغييرات في مورفولوجية. يسمح التقاط سلسلة من المقاطع البصرية في طائرات التنسيق المختلفة توليد ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج لعينة، ومن ثم يمكن تمديدها إلى أربعة أبعاد (4D) عن طريق إنشاء سلسلة الوقت الفاصل بين مجموعات البيانات 3D. توليد مجموعات البيانات 4D يسمح قياس مفصلة لتحركات الخلية والسلوكيات. في المدى الطويل التجارب مرور الزمن فمن الشائع لمراقبة حركة العينة. يمكن أن يكون سبب ذلك عن طريق أخطاء طفيفة في الأجهزة السيطرة على خشبة المسرح والمواقف المحورية. بينما في حالات أخرى، والانحراف هو نتيجة لحركات الناجم عن النمو عينة أو المرونة في وسائل الاعلام عينة في تصاعد مستمر. توجد طرق للتعويض أو الحد من هذه الحركات بما في ذلك إدخال تحسينات على أنظمة تركز الأجهزة وزيادة صلابة من المتوسطة المتزايدة. ومع ذلك، هذه الأساليب لا يمكن أن تطبق في كثير من الحالات نظرا ليالي التصويرآخرون حتى اللازمة لتوفير الظروف المناسبة لصيانة العينات والنمو. حلول البرمجيات مفتوحة المصدر موجودة لتصحيح الحركة في 2D مع مرور الوقت، من خلال استخدام StackReg وTurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 الإضافات في ImageJ أو فيجي، ولكن هذه لا يمكن يمكن تطبيقها على مجموعات البيانات 4D.
لتصحيح العينة الانجراف وضعنا في قابس (تصحيح الانحراف 3D) للاستفادة من المصدر المفتوح لتجهيز منصة التصوير، فيجي 1. لدينا المكونات هي قادرة على أداء تسجيل ارتباط مرحلة لتصحيح الحركة التي تحدث نتيجة الانجراف العينة في ثلاث تجارب الأبعاد الوقت الفاصل. المرحلة ارتباط 6 هو طريقة فعالة الحسابية لتحديد الترجمة بين الصور. المكونات في وصفها هنا يستخدم المكتبة مرحلة الارتباط التي وضعتها Preibisch وآخرون. 7. في تجارب متعددة القنوات، والمكونات في قناة واحدة تستخدم لمحدداتشمال شرق التصحيح المطلوب. ثم يتم تطبيق هذا التصحيح على أي قنوات إضافية مما أدى إلى تسجيل بيانات 4D.
في النظام النموذجي الزرد فمن الممكن لتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير على مدى عدة ساعات، أو حتى عدة أيام 8. وهناك طريقة مشتركة لتركيب الزرد هو تضمين الجنين يعيش مخدرة في انخفاض الاغاروز نقطة انصهار (0.8-1.5٪)، وتقييد حركتها 9-11. في حين يقتصر حركة النمو من العينة لا يزال يحدث، مما أدى إلى الخلايا داخل مجال الرؤية يتحول الموقف. من أجل متابعة حركة الخلايا داخل الجنين فمن الضروري لتصحيح الأول للحركة من العينة بأكملها. وقد تم تطوير هذا البروتوكول مع العينات الزرد، وقد استخدمت لتطوير صورة الجسيدة 12 ولكن يمكن تطبيقها على أي متحد البؤر بيانات 4D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تجارب التصوير 4D الوقت الفاصل
سوف الإعدادات المستخدمة للحصول على صورة تختلف اعتمادا على المعدات المستخدمة. قدرة المجهري متحد البؤر لقسم بصريا عينة يعتمد على عدد من العوامل: الطول الموجي للإثارة، وحجم الثقب، والفتحة العددية للهدف، ومعامل انكسار العينة والوسط الذي هو جزءا لا يتجزأ من العينة. فإن حجم الثقب متحد البؤر اختيارها تحديد سماكة المقطع البصرية التي تم جمعها. وهناك الثقب أصغر إنتاج القسم البصرية أرق زيادة القرار ض محور ولكن الحد من كمية الضوء التي تم التقاطها. وهناك الثقب أكبر زيادة سمك المقطع البصرية، والحد من القرار ض محور ولكن زيادة كمية الضوء التي تم التقاطها.
عوامل إضافية للنظر خلال جمع البيانات 4D قبل التصحيح ما يلي:
- تحسين سرعة المسح الضوئي لإزالة أو الحد، الانجراف دخلال شهر القبض على واحد الوقت نقطة. وبالتالي فإن الوقت الذي يستغرقه لجمع الصور يجب أن يكون جزء صغير من الفاصل الزمني بين نقاط الوقت.
- هياكل التكرار تماما، أو الشبكات، ليست مناسبة كما هياكل للتسجيل كما أنه ليس من الممكن تحديد التصحيح المطلوب. والخرز موزعة بشكل عشوائي أو هياكل متفاوتة تسمح تسجيل لا لبس فيها.
- إذا كان من المتوقع والانحراف، زيادة مساحة المسح الضوئي وحدود التركيز العلوي والسفلي من أجل ضمان بقاء المنطقة ذات الاهتمام داخل الصورة المكدس.
- بالإضافة إلى ضمان وجود القرار المكانية المناسبة لحل هياكل الفائدة، تعيين معدل أخذ العينات لتقديم القرار الزماني للأحداث الحيوية التي تجري دراستها.
ملاحظة: ولذلك ينبغي للوقت بين صورة نقاط الوقت يكون النصف على الأقل إلى الفاصل الزمني بين الأحداث العادية وتقليل تكرار للأحداث غير النظامية.
2. فتح متحد البؤر Dataset
حزمة مفتوحة المصدر فيجي هو توزيع برنامج يماغيج، الذي يحتوي مثبتة مسبقا المكونات الإضافية لتنفيذ عمليات عديدة على البيانات التي تم جمعها من التجارب المجهري. يوفر البرنامج أسهل العمارة تحديث المكونات في وتشمل نسخة من تصحيح الانحراف 3D في المكونات المستخدمة لهذا البروتوكول. ويدعم البرنامج استيراد مجموعة واسعة من صيغ الصور الملكية المجهر من خلال استخدام بيو تنسيقات استيراد المكونات في فتح الميكروسكوب بيئة.
- تثبيت البرنامج فيجي (http://fiji.sc/Downloads).
- تحميل مجموعة البيانات المكتسبة باستخدام الامكنه بيو تنسيقات المستورد المساعد.
- إذا كانت مجموعة البيانات أكبر من الذاكرة المخصصة للبرنامج، اختر "استخدام الخيار المكدس الظاهري" ضمن قسم إدارة الذاكرة.
3. تصحيح الانجراف من كائن 3D في مرحلة ما بعد المعالجة
خلال تمديد الوقت الفاصلالتجربة قد نقل عينة حتى عندما المضمنة. لتصحيح أي حركة، والسماح للأحداث الهجرة تصويرها ليتم تحليلها ومعالجتها آخر من الصور لا يمكن أن يؤديها. يجب أن يوصف كل تجهيز آخر صورة بشكل واضح في منهجية تحليل أي المستمدة من هذا العمل.
- مرة واحدة وقد حملت ورقة العمل، قم بتشغيل تصحيح الانحراف 3D المساعد.
- إذا كانت هناك قنوات متعددة الصورة، حدد القناة ليتم استخدامها لتسجيل الصور. وهذا ينبغي أن تمثل مثالي هيكل ثابت داخل العينة بدلا من أي عناصر المهاجرة أو المحمول. ومع ذلك، إذا لم يكن ذلك ممكنا ينبغي اختيار القناة مع أقل حركة.
- إذا كانت ذاكرة الوصول العشوائي المتاحة على النظام المستخدم لهذا التحليل هو أقل من ضعفي حجم مجموعة البيانات الأصلية، حدد استخدام الخيار المكدس الظاهري. وهذا تخزين hyperstack المسجل في صورة تسلسل، بدلا من حفظ الملف على ذاكرة الوصول العشوائي.
- تحديد مجلد لفي المكونات الفردية لإخراج تصحيح معهد العالم العربيغيس الملفات. سيتم إنشاء ملف صورة منفصلة لكل قناة في كل موقف ض.
- فإن البرنامج المساعد ثم إجراء تحليل الارتباط المرحلة الزوج الحكيم بين كل نقطة من الوقت لتحديد التصحيح المطلوب الذي هو ثم تطبيقها على ورقة العمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الزرد النامية، خلايا العضلات بسرعة تندمج الألياف متعددة النوى من 19 ساعة بعد الإخصاب (20 - مرحلة الجسيدة) 13. من أجل تصور حركة النوى والانصهار من خلايا العضلات أجرينا 4D متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام سلالة معدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة الهيكل العظمي-α أكتين المروج لتسمية كل من العضلات خلايا الحمض النووي الريبي حقن 14 وترميز بروتين فلوري الحمراء الموسومة mCherry مع تسلسل توطين النووية، لتسمية نوى. وقد شنت حقن الأجنة وراثيا في البلدان المنخفضة ذوبان نقطة الاغاروز وتسلسل الصور التي تتكون من 71 المقاطع البصرية القبض على 2.0 ميكرومتر فترات كل 20 دقيقة على مدى 2 ساعة الفترة الزمنية. ولوحظ الانجراف عينة من حوالي 7 ميكرون على مدار التجربة مرور الزمن، مما يؤدي إلى عدم وضوح الصور المتراكبة (الشكل 1A) وحركة واضحة من nuclالصناعات الاستخراجية على مر الزمن (الشكل 1B). ويمكن رؤية تطبيق البرنامج المساعد أن يؤدي إلى تسلسل الصور المسجلة (أرقام 1C و1D).
الشكل 1: بروتوكول يصحح الحركة عينة خلال الحصول على الصور في الفضاء ثلاثي الأبعاد متوسط صورة إسقاط الحد الأقصى التوقعات من كل نقطة زمنية من مجموعة البيانات غير المصححة تظهر العضلات التعبير GFP محددة (A)، وتسلسل توطين النووية لتنصهر mCherry (B). مدى هذه الحركة يقلل من القدرة على تتبع نوى العضلات والانصهار، وعدم وضوح الصورة GFP هو واضح. وتظهر الصور الناتجة تصحيحه في (C) و (D)، مما يدل على تسجيل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدينا القدرة على استخدام البرمجيات مرحلة ما بعد المعالجة لتصحيح الانحراف عينة من مجموعات البيانات المستمدة من تمديد الوقت الفاصل بين التجارب المجهري مقيد من خلال عدد من العوامل. القدرة على التمييز الانجراف مقابل حركة الهجرة من عينة يعتمد على علامات الخلوية المستخدمة. علامات الخلوية التي إما يتم التعبير على نطاق واسع ضمن عينة أو لا يشاركون في الأحداث المهاجرة خلال الحصول على الصور توفير أفضل مصدر لتصحيح الانحراف. يستخدم البرنامج المساعد على قناة واحدة لتسجيل الحركة بين نقاط الوقت ومن ثم ينطبق هذا التسجيل لجميع القنوات من الصورة التي تم جمعها. لذلك، قد يكون من المفيد لاستخدام اثنين من علامات الفلورسنت في عينات من الفائدة. واحد علامة للحصول على الخلايا أو الهياكل التي سيتم تعقب وعلامة ثانية، إلى هياكل التسمية التي ليس من المتوقع أن تهاجر بعيدا عن الانجراف أثناء التجربة. ويمكن إجراء التسجيل في قواعد البيانات مع قناة واحدة ولكن إذا كان الأمر كذلك فإن الغالبية من اليجب أن تكون البيانات الإلكترونية الثابتة في الصورة مع نسبة صغيرة فقط من المتوقع أن تتحرك. إذا نسبة كبيرة من الصورة يتحرك بين نقاط في الوقت الذي سيتم تصحيح الحركة ل، بالإضافة إلى أي الانجراف، مما أدى إلى انخفاض في حركة قياسها.
بروتوكول أنشئت في هذه المخطوطة يفترض أنه ليس هناك حركة بين القسم البصرية الأولى والأخيرة من كل فرد الوقت نقطة. ليس من الممكن لتصحيح الانحراف التي قد تحدث داخل احد الوقت نقطة دون وضع افتراضات لشكل الكائن تم مسحها ضوئيا. من الناحية المثالية المعلمات التجريبية المستخدمة لجمع الصور من شأنه أن يحد من إمكانات للحركة أن تحدث داخل كل نقطة في الوقت التقاطها. وبالتالي فإن الوقت الذي يستغرقه لالتقاط تسلسل الصور يجب أن تكون قصيرة قدر الإمكان. الوقت الإجمالي لاكتساب الوقت نقطة واحدة يجب أن يكون جزء صغير من الفاصل الزمني بين نقاط الوقت.
طريقة ارتباط المرحلة التييشكل أساس الإجراء، ويحدد الترجمة المطلوبة لمحاذاة مرة واحدة نقطة مع القادم. يتم تصحيح حركات متعدية الأهم فقط لوبالتالي لن يتم تصحيح دوران حول أي محور (س، ص، ض). للعديد من الأسباب المحتملة للالانجراف، مثل الانجراف التنسيق، واختلاف موقف المرحلة، وترجمة تصف تماما للحركة. ومع ذلك، إذا كانت الحركة عينة تشمل التناوب سوف الترجمة لا تكون قادرة على وصف التصحيح اللازمة. وللارتباط المرحلة لا تزال تسمح المواقف الأكثر مماثلة يتم تحديدها والاستفادة من افضل الترجمة، مما أدى إلى بعض التحسن في التسجيل، ولكن إذا كانت هناك منهجيات بديلة دوران كبيرة السماح باستخدام المعالم في الصورة، سيكون أكثر ملاءمة.
وقد تم تصميم المكونات في العمل مع أكوام الظاهري السماح للعرض وتسجيل الملفات أكبر من الذاكرة المتوفرة. الملفات الجرميةد من القرص كما هو مطلوب لتحليل ونتائج التسجيل المحفوظة على القرص باعتبارها تسلسل الصور، بدلا من ملف صورة واحدة. هذا يسمح باستخدام جهاز كمبيوتر مع ذاكرة الوصول العشوائي أقل من الحجم الإجمالي لمجموعة البيانات، الحد الأقصى لحجم ورقة العمل بدلا من ذلك أن يحد من مساحة القرص الثابت المتاحة. كما يتم محاذاة كل نقطة من الوقت مع الوقت لاحقة نقطة يجب أن يكون الكمبيوتر ذاكرة كافية لفتح اثنين من نقاط الوقت واستكمال تحليل مرحلة الارتباط. القدرة على أداء متقدمة تسجيل وتحليل تصحيح العينة باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية، على أنظمة مع موارد محدودة، يفتح قدرة مرحلة ما بعد المعالجة المتطورة لجمهور أوسع بكثير العلمية.
وصفناها استخدام بروتوكول لتصحيح الانحراف في قواعد البيانات متحد البؤر الزرد ولكن يمكن تطبيق النهج إلى نتائج تم الحصول عليها باستخدام أي نوع من عينة أو نظام التصوير 3D. ونتيجة لذلك في المستقبل هذه التقنية يمكن أن يكون أيضاpplied لمجموعات البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير المقطعي الإسقاط الضوئية، الأشعة السينية التصوير المقطعي الكمبيوتر، والفحص المجهري ورقة الضوء، وتقنيات التصوير الناشئة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر غابي مارتينز ومنظمي ورشة العمل التنموي EMBO2010 3D التصوير حيث بدأ هذا العمل وجميع المساهمين في المشاريع فيجي ويماغيج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
