Summary
时间推移显微镜可发育过程的可视化。图像采集过程中的增长或样品的漂移减小到准确跟踪和开发过程中测量细胞运动的能力。我们描述了使用开源的图像处理软件，以纠正随着时间的推移三维样品漂移。
Abstract
的四维（4D）的共聚焦数据集的产生;由3D图像序列的一段时间内;提供了一个极好的方法来捕捉参与发育过程的细胞行为。跟踪并按照细胞运动的能力是由发生是由于图像采集过程中的漂移的样品，或在一些情况下，生长的样品的运动的限制。跟踪细胞集受漂移和/或生长将把这些运动到细胞位置的任何分析。这可能会导致在样品内的静态结构的表观运动。因此，之前小区的跟踪，任何样品漂移应予以纠正。使用ImageJ的2,3开源斐济分布1及注册成立LOCI工具4，我们制定了正确的3D漂移插件的共聚焦数据集删除错误的样运动。该协议有效地补偿了样品翻译或改建焦宝sition通过利用相位相关注册的每个时间点的一个四维数据集焦，同时保持可视化和测量细胞运动在延长的时间推移实验的能力。
Introduction
共焦成像被广泛应用于细胞和发育生物学跟随细胞运动和变化的形态。拍摄的一系列光学切片在不同的焦平面允许生成一个三维（3D）模型的样品上，然后可以通过创建时间推移一系列的三维数据集被扩展成四个维度（4D）的。 4D数据集的产生使细胞运动和行为的详细的测量。在长期的延时实验是很常见的观察样品的运动。这可以通过在硬件控制阶段和焦点位置轻微的不准确引起的。而在另一些情况下，漂移是诱导样品安装介质内的样品生长或弹性运动的结果。方法存在补偿或限制这些运动包括改善硬件聚焦系统和安装介质的刚性增加。然而，这些方法不能在许多情况下应用，由于摄像s等最多需要提供适当的条件下对样品维持和生长。开源软件解决方案确实存在运动的二维校正随着时间的推移，通过使用STACKREG和TurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）5插件在ImageJ的或斐济，但这些都不能被应用到4D数据集。
为了校正样品的漂移，我们已经开发了一个插件（正确的3D漂移）利用开源的图像处理平台，斐济1。我们的插件能够执行相位相关配准修正的发生是由于在三维时间推移实验样品的漂移而导致的运动。相位相关6是计算效率的方法来确定图像之间的转换。这里所描述的插件，利用由Preibisch 等 7开发了相位相关的库。在多通道的实验中，该插件利用一个信道到determiNE所需的校正。这种校正，然后应用到产生的4D数据集的登记任何额外的通道。
在斑马鱼的模型系统，可以进行延时成像一段许多小时，甚至数天8。用于安装在斑马鱼的常用方法是嵌入麻醉活胚胎在低熔点琼脂糖（0.8-1.5％），限制其运动9-11。而移动被限制在样品的生长仍然发生，导致换档位置的视场范围内的单元格。为了遵循这个胚胎内细胞的运动，有必要首先纠正为整个样本的移动。这个协议是与斑马鱼标本研制，并已用于图像体节发育12而是可以应用到任何4D共聚焦数据集。
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Protocol
1，4D时间推移成像实验
用于图像采集的设置会有所不同取决于所使用的设备上。共焦显微镜进行光学部分的样品的能力取决于多个因素：激励，针孔大小，客观的数值孔径，样品的折射率，并且其中样本被嵌入该介质的波长。共焦针孔选定的大小将决定所收集的光学部分的厚度。一个更小的针孔会产生更薄的光学部分增加了Z轴的分辨率，但降低了光的捕获量。一个更大的针孔会增加光学部的厚度，从而降低沿z轴的分辨率，但增加光捕获量。
其他因素集合的4D数据之前修正过程中考虑的因素包括：
- 优化扫描速度，删除或限制，漂移ðuring一个时间点的捕捉。因此，采取的图像采集时间应的时间点之间的时间间隔的一小部分。
- 完全重复结构或网格，不适合作为结构注册为不可能确定所需的校正。随机分布的珠或不均匀结构将使明确登记。
- 如果漂移是意料之中的，增加扫描区域和上下聚焦限度，以确保感兴趣区域仍然是图像堆栈内。
- 除了确保有适当的空间分辨率来解决利益结构，设置采样率的动态事件正在研究提供时间分辨率。
注：因此图像的时间点之间的时间应定期重复事件之间至少有一半的时间间隔，减少不规则的事件。
2，打开激光共聚焦ðataset
开源包斐济是ImageJ的程序，其中包含预先安装的插件从显微镜实验收集到的数据进行大量的流程的分布。该软件提供更方便的插件更新架构，包括正确的3D漂移插件用于该协议的副本。该软件支持的专有显微镜图像格式繁多的通过使用开放式显微镜环境的生物的格式导入插件导入。
- 安装斐济程序（http://fiji.sc/Downloads）。
- 使用LOCI生物格式进口商插件加载收购数据集。
- 如果数据集是不是分配给程序的内存较大，选择内存管理部分中的“使用虚拟堆栈选项”。
3，修正了3D对象的漂移在后处理
在延长的时间推移的过程中实验嵌入式即使样品可能会移动。以纠正任何运动，并允许成像的迁移事件进行分析，能够进行图像的后处理。所有图像后处理必须在这项工作产生的任何分析的方法加以明确说明。
- 一旦数据集加载，运行正确的3D漂移插件。
- 如果有多个图像通道，选择要用于注册的图像的通道。这应该理想地代表了样品中的静态结构，而不是任何迁徙或移动元素。但是，如果这是不可能用最少的运动通道应选择。
- 如果用于该分析系统上的可用RAM是原始数据集小于两倍的大小，选择使用虚拟堆栈选项。这将在注册hyperstack存储为图像序列，而不是保存到RAM中的文件。
- 选择一个文件夹的插件输出单个纠正IMAGES文件。一个单独的图像文件将每个通道在每个z位置创建。
- 该插件会再进行每个时间点之间的成对相位相关分析，以确定所需的校正它，然后应用到数据集。
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Representative Results
在发展中的斑马鱼，快肌细胞融合成多核纤维由19小时后受精（20 -体节期）13。为了可视化核的运动和融合肌细胞，我们进行了使用转基因品系的骨骼α-肌动蛋白启动子的控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）标记所有肌肉的4D共聚焦延时成像的细胞14和注射编码红色荧光蛋白的mCherry标记的核定位序列，以标记细胞核RNA。注入的转基因胚胎被安装在低熔点琼脂糖和图像序列组成的在2.0微米的间隔，每隔20分钟在2小时的时间期间拍摄的71的光学部分。观察到随时间推移实验过程中的约7微米的样本漂移，从而导致模糊的重叠图像（ 图1A）和原子核的表观运动EI随着时间的推移（ 图1B）。可以看出，导致配准的图像序列（ 图1C和1D）的插件应用程序。
图1：该协议从未经校正的数据集示出肌肉特异性表达GFP（A）和稠合的mCherry（B）中的核定位序列的各时间点的最大突起的平均投影图像在三维空间中的图像采集过程中的样品进行整流动作 。这个运动范围减小跟踪肌细胞核和融合的能力，并且在GFP图像的模糊是显而易见的。所得到的校正后的图像示于（C）和（D），说明该数据集的注册。
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Discussion
我们使用后处理软件来纠正从延长的时间推移显微镜实验得出的数据集的样本漂移的能力受到许多因素的限制。辨别漂移对样品的迁徙运动能力依赖于所使用的细胞标记。无论是否广泛的样本中明示或图像采集过程中不涉及迁徙事件细胞标记为漂移校正的最佳来源。该插件使用单个信道来注册的时间点之间的移动，然后应用这一注册到所有收集到的图像的信道。因此，可能有利的是使用两种荧光标记物在感兴趣的样品。一个标记为将被跟踪的细胞或结构和第二个标记，以未预期的实验过程中，除了漂移迁移标签结构。注册可以在数据集用单声道进行，但如果让广大次方E数据应该是静止图像中，只有一小部分预期移动。如果图像的一个大比例的时间点该运动将被用于校正的，除了任何漂移，导致测量的运动的减少之间移动。
建立在这个手稿的协议假定有个别时间点的第一个和最后一个光学部分之间并无任何变动。这是不可能的，以纠正在一个单一的时间点，可能会发生没有作出假设，以被扫描的物体的形状的漂移。理想的情况下用于图像采集的实验参数将限制对移动每个时间点捕获内发生的可能性。从而采取捕捉图像序列的时间应尽可能的短。单个时间点采集的总时间应的时间点之间的时间间隔的一小部分。
相位相关方法，该方法形成过程的基础上，确定将对齐一个时间点的下一个所需的翻译。重要的是只有平移运动进行修正，因此，围绕任何轴线（X，Y，Z）的旋转将不被校正。对于许多漂移的可能原因，如焦点漂移，舞台位置的变化，翻译将完美地描述了运动。然而，如果样品移动包括旋转翻译将不能描述必要的校正。该阶段相关仍会允许确定最相似的立场和利用最好的翻译，导致注册一些改善，但如果有显著旋转的替代方法允许在图像中使用的标志，会更适合。
该插件的设计与虚拟堆栈允许文件的查看和登记超过可用内存的工作。文件是REA根据需要进行分析，并保存到磁盘中作为一个图像序列，而不是单个图像文件的登记结果d个磁盘。这允许使用一台计算机具有比数据集的总大小的RAM少，数据集的最大尺寸，而不是由硬盘可用空间的限制。由于每个时间点与随后的时间点对齐的电脑必须有足够的可用内存来打开两个时间点和完成阶段相关性分析。执行高级注册和校正样品分析使用免费提供的软件，在资源有限的系统的能力，开辟了先进的后处理，以更广泛的科学受众的能力。
我们已经描述了使用该协议来校正在斑马鱼中的共焦集漂移，但这种方法可使用任何类型的样品或3D成像系统被应用到所获得的结果。其结果是在未来该技术也可能是一个pplied使用磁共振成像，光学投影层析成像，X射线计算机断层扫描，光薄片显微镜和其他新兴的成像技术得到的数据集。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们要感谢盖比马丁斯和EMBO2010 3D发展成像的研讨会，这项工作开始，所有的贡献者斐济和ImageJ的项目的组织者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
