Summary
Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Entwicklungsprozessen. Wachstum oder Drift der Proben während der Bildaufnahme reduziert die Fähigkeit, genau zu verfolgen und zu messen Zellbewegungen während der Entwicklung. Wir beschreiben die Verwendung von Open-Source-Bildbearbeitungssoftware für dreidimensionale Probe Drift über die Zeit zu korrigieren.
Abstract
Die Erzeugung des vierdimensionalen (4D) konfokale Datensätze; bestehend aus 3D-Bildsequenzen über die Zeit; bietet eine hervorragende Methode, um Zellverhalten in Entwicklungsprozessen beteiligt zu erfassen. Die Fähigkeit zu verfolgen und folgen Zellbewegungen wird durch Probenbewegungen, die durch die Probe während der Bildaufnahme treiben oder, in einigen Fällen das Wachstum auftreten beschränkt. Tracking-Zellen in Datensätzen durch Drift und / oder Wachstums betroffen, diese Bewegungen in jede Analyse von Zell-Position zu übernehmen. Dieser kann aus der scheinbaren Bewegung des statischen Strukturen innerhalb der Probe führen. Daher vor der Zellverfolgung sollte jede Probe Drift korrigiert werden. Mit dem Open-Source-Distribution Fidschi 1 von ImageJ 2,3 und die einge LOCI Werkzeuge 4 des richtigen 3D-Drift-Plug-in, entwickelten wir zu fehlerhaften Probenbewegung in der konfokalen Datensätze zu entfernen. Dieses Protokoll effektiv kompensiert Probeübersetzung oder Änderungen in der Brenn position durch die Verwendung Phasenkorrelation zu jedem Zeitpunkt von einer vier-dimensionalen Datensätzen konfokalen registrieren und gleichzeitig die Fähigkeit, über längere Zeitraffer-Experimente visualisieren und messen Zellbewegungen.
Introduction
Die konfokale Bildgebung ist weit verbreitet in Zell-und Entwicklungsbiologie, Zell Bewegungen und Veränderungen in der Morphologie zu folgen. Erfassen einer Reihe von optischen Schnitten in verschiedenen Brennebenen ermöglicht die Erzeugung einer dreidimensionalen (3D) Modells der Probe, die dann durch die Schaffung eines Zeitserien von 3D-Datensätzen in vier Dimensionen (4D) verlängert werden können. Die Generation von 4D-Datensätzen ermöglicht die detaillierte Messung von Zellbewegungen und Verhaltensweisen. In Langzeit-Zeitraffer-Experimente ist es üblich, Probenbewegung zu beobachten. Dies kann durch kleine Ungenauigkeiten in der Hardware-Steuerung Bühne und Fokuspositionen verursacht werden. Während in anderen Fällen ist ein Ergebnis der Driftbewegungen Probe Wachstum oder Flexibilität in der Probenmontage Medien induziert. Methoden existieren, um auszugleichen oder zu begrenzen, diese Bewegungen einschließlich der Verbesserung Hardware Fokussiersysteme und erhöhte Steifigkeit der Montage Medium. Jedoch sind diese Ansätze können in vielen Fällen aufgrund der Abbildungs s angewendet werdenet up erforderlich, geeignete Bedingungen für die Proben Wartung und Wachstum. Open-Source-Software-Lösungen nicht für die Korrektur der Bewegung in 2D über die Zeit vorhanden ist, durch den Einsatz der STACKREG und TURBOREG (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 Plugins in ImageJ oder Fidschi, aber diese kann nicht 4D Datensätze angewendet werden.
Um für die Probe Drift zu korrigieren haben wir eine Plug-in (Richtiges 3D-Drift), um die Open-Source-Bildverarbeitungsplattform, Fidschi 1 nutzen entwickelt. Unser Plug-in ist in der Lage, Phasenkorrelation Registrierung durchzuführen, um eine Bewegung, die als Ergebnis der Probendrift im dreidimensionalen Zeitraffer-Experimente erfolgt korrigieren. Phase 6 ist eine Korrelation Rechen effiziente Methode zur Übersetzung zwischen den Bildern zu bestimmen. Die hier beschriebene Plug-in nutzt die Phasenkorrelation Bibliothek von Preibisch et al. 7 entwickelt. Der Mehrkanal-Experimenten die Steck nutzt einen Kanal zur Bestimmungne die erforderliche Korrektur. Diese Korrektur wird dann auf zusätzliche Kanäle, was zu der Eintragung der 4D-Datensatz angelegt.
Im Zebrafisch-Modell-System ist es möglich, Zeitraffer-Bildgebung über einen Zeitraum von vielen Stunden oder sogar mehrere Tage 8. Eine gängige Methode für die Montage des Zebrafisch ist es, die betäubt Live-Embryo in niedrig schmelzender Agarose (0,8-1,5%) einbetten, die Beschränkung ihrer Bewegung 11.09. Während Bewegung eingeschränkt ist noch Wachstum der Probe auftritt, was in den Zellen innerhalb des Sichtfeldes Schaltposition. Um die Bewegung der Zellen innerhalb des Embryos zu folgen ist es notwendig, zuerst für die Bewegung der gesamten Probe zu korrigieren. Dieses Protokoll wurde mit Zebrafisch-Proben entwickelt und hat zu Bild 12 Somitenentwicklung verwendet worden kann aber zu jedem 4D konfokalen Datenmenge angewendet werden.
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Protocol
Ein. 4D Zeitraffer-Imaging Experimente
Die für die Bildaufnahme verwendete Einstellungen in Abhängigkeit von der verwendeten Ausrüstung variieren. Die Fähigkeit der konfokalen Mikroskopie optisch Schnitt einer Probe hängt von einer Anzahl von Faktoren: die Wellenlänge des Anregungs, Lochblendengröße, numerische Apertur des Objektivs, den Brechungsindex der Probe und des Mediums, in dem die Probe eingebettet ist. Die Größe des konfokalen Lochblende ausgewählt wird, die Dicke der gesammelten optischen Abschnitt zu bestimmen. Eine kleinere Lochblende ein dünner optischer Schnitt Erhöhung der z-Achse Auflösung, sondern die Verringerung der Menge an Licht, eingefangen zu produzieren. Eine größere Lochblende wird die Dicke des optischen Schnitt erhöhen, wodurch z-Achse Auflösung, sondern die Erhöhung der Menge von Licht eingefangen.
Zusätzliche Faktoren, die bei der Sammlung von 4D-Daten vor der Korrektur berücksichtigen:
- Scan-Geschwindigkeit zu optimieren, zu beseitigen oder zu begrenzen, treiben dährend die Erfassung von einem einzigen Zeitpunkt. Deshalb ist die Zeit für die Bildsammlung entnommen sollte ein kleiner Bruchteil des Intervalls zwischen den Zeitpunkten.
- Perfekt wiederholenden Strukturen oder Gitter, sind nicht als Strukturen für die Registrierung geeignet, da es nicht möglich ist, um die erforderliche Korrektur zu bestimmen. Zufällig verteilt Perlen oder unebene Strukturen eindeutige Registrierung zu ermöglichen.
- Wenn Drift wird erwartet, erhöhen Sie den Scanbereich und obere und untere Grenzen Fokus, um sicherzustellen, das Gebiet von Interesse innerhalb des Bildstapels bleibt.
- Neben der Sicherstellung eine angemessene räumliche Auflösung, die Strukturen von Interesse zu beheben, legen Sie die Abtastrate auf zeitliche Auflösung für die dynamischen Ereignisse untersucht werden.
Hinweis: Die Zeit zwischen Bildzeitpunkten sollte daher mindestens die Hälfte der Zeit-Intervall zwischen regelmäßigen wiederkehrende Ereignisse und senken für unregelmäßige Veranstaltungen.
2. Öffnen der konfokale Dataset
Die Open-Source-Paket Fidschi ist eine Verteilung der ImageJ-Programm, das vorinstallierte Plug-ins für zahlreiche Prozesse auf Daten aus der Mikroskopie Experimente durchführen gesammelt enthält. Die Software bietet einfacher Plug-in-Architektur und Update enthält eine Kopie der richtigen 3D-Drift-Plug-in für dieses Protokoll verwendet. Die Software unterstützt den Import einer Vielzahl von proprietäre Bildformate Mikroskopie durch den Einsatz des Open-Mikroskopie Umwelt Bio-Formate Import-Plug-in.
- Installieren Sie den Fidschi-Programm (http://fiji.sc/Downloads).
- Laden Sie die Datenmenge mit Hilfe der erworbenen LOCI Bio-Formate Importer-Plugin.
- Wenn die Datenmenge ist größer als der Speicher für das Programm, wählen Sie die Option "Verwenden virtuellen Stack" in der Speicherverwaltung.
3. Drift Korrektur eines 3D-Objekt im Post Processing
Im Verlauf eines längeren Zeitrafferexperimentieren, eine Probe zu bewegen, auch wenn eingebettet. Um eine Bewegung zu korrigieren und damit die Migration Ereignisse abgebildet analysiert werden soll, kann die Nachbearbeitung der Bilder durchgeführt werden. Alle Bildnachbearbeitung muss deutlich in der Methodik der Analysen aus dieser Arbeit abgeleitet beschrieben werden.
- Sobald der Datensatz geladen wurde, führen Sie die korrekte 3D-Drift-Plugin.
- Wenn es mehrere Bildkanäle, wählen Sie die zu verwendenden Kanal, um die Bilder zu registrieren. Dies sollte idealerweise stellen eine statische Struktur innerhalb der Probe eher als alle Zugvögel oder mobile Elemente. Jedoch, wenn dies nicht möglich ist der Kanal mit der geringsten Bewegung gewählt werden.
- Wenn der verfügbare RAM auf dem für diese Analyse verwendete System ist weniger als doppelt so groß wie die ursprüngliche Datenmenge, wählen Sie die Option Gebrauch virtuellen Stack. Dies wird die registrierte Hyperstack als Bildsequenz zu speichern, anstatt die Datei in den Arbeitsspeicher.
- Wählen Sie einen Ordner für das Plug-in die Ausgabe einzelner korrigiert images-Dateien. Eine separate Bilddatei wird für jeden Kanal an jeder z-Position erstellt werden.
- Das Plugin wird dann führen eine paarweise Phasenkorrelationsanalyse zwischen den einzelnen Zeitpunkt, um die erforderliche Korrektur, die dann auf den Datensatz angewandt bestimmen.
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Representative Results
In der sich entwickelnden Zebrafisch, verschmelzen schnellen Muskelkernige Zellen in Fasern von 19 Stunden nach der Befruchtung (20 - Somitenstadium) 13. Um die Bewegung der Kerne und Fusion von Muskelzellen führten wir 4D konfokalen Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung eines transgenen Stamm, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle des α-Skelett-Aktin-Promotors exprimiert, um alle Muskeln kenn visualisieren Zellen 14 und injizierten RNA die rote fluoreszierende Protein mCherry markiert mit einer Kernlokalisierungssequenz, um Kerne zu beschriften kodiert. Eingespritzte transgenen Embryonen wurden in niedrigen Schmelzpunkt Agarose und einer Bildsequenz, bestehend aus 71 optischen Schnitten bei 2,0 um Abständen alle 20 Minuten über eine 2-Stunden-Zeitperiode erfasst montiert. Probendrift von ungefähr 7 um wurde im Verlauf des Zeitraffer-Experiment beobachtet, was zu einer Verwischung der überlappenden Bilder (Fig. 1A) und die scheinbare Bewegung des NuclEI über die Zeit (Abbildung 1B). Anwendung des Plug-In kann gesehen werden, in einem registrierten Bildsequenz (Fig. 1C und 1D) führen.
Figur 1: Das Protokoll richtet Probenbewegung während der Bildaufnahme in einem dreidimensionalen Raum Schnittsprojektionsbild des maximalen Projektionen von jedem Zeitpunkt des unkorrigierten Datenmenge, die muskelspezifische GFP-Expression (A) und Kernlokalisierungssequenz mCherry (B) fusioniert.. Das Ausmaß dieser Bewegung verringert die Fähigkeit, die Muskelzellkerne und Fusions verfolgen und Unschärfe des Bildes GFP ist offensichtlich. Die resultierenden korrigierten Bilder in (C) und (D) gezeigt ist, was die Registrierung des Datensatzes.
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Discussion
Unsere Fähigkeit, Post-Processing-Software verwenden, um Probendrift von Datensätzen aus erweiterten Zeitraffer-Mikroskopie Experimente abgeleitet korrigieren wird durch eine Reihe von Faktoren eingeschränkt. Die Fähigkeit, gegenüber Drift Wanderungs einer Probe zu erkennen ist abhängig von den zellulären Marker verwendet. Cellular Marker, die entweder weit innerhalb einer Probe ausgedrückt sind oder während der Bildaufnahme nicht in Migrations Veranstaltungen beteiligt bieten die beste Quelle für Driftkorrektur. Das Plugin verwendet einen einzelnen Kanal, um die Bewegung zwischen den Zeitpunkten registrieren und wendet diese Registrierung, um alle Kanäle des gesammelten Bild dann. Daher kann es vorteilhaft sein, zwei Fluoreszenzmarker in Proben von Interesse zu verwenden. Ein Marker für die Zellen oder Strukturen, die verfolgt werden, und eine zweite Markierung, Etiketten Strukturen, die nicht erwartet werden, während des Experiments abgesehen von Drift migrieren. Die Anmeldung kann auf Datensätze mit einem einzigen Kanal durchgeführt werden, aber wenn so die Mehrheit der thE Daten sollten nur mit einem kleinen Anteil voraussichtlich bewegen stationär im Bild. Wenn ein großer Teil des Bildes bewegt sich zwischen den Zeitpunkten, die Bewegung korrigiert werden, zusätzlich zu einer Drift, was zu einer Verringerung der Bewegung gemessen.
Die in diesem Manuskript etablierten Protokoll nimmt an, dass es keine Bewegung zwischen der ersten und der letzten optischen Schnitt jedes einzelnen Zeitpunkt. Es ist nicht möglich, um die Drift, die innerhalb einer Zeitpunkt ohne Annahmen über die Form des Objekts, das abgetastet auftreten können korrigieren. Idealerweise werden die für die Bildsammlung verwendet experimentellen Parameter würde das Potenzial für eine Bewegung innerhalb jedes aufgenommene Zeitpunkt auftreten begrenzen. Somit ist die Zeit, um die Bildsequenz erfassen sollte so kurz wie möglich sein. Die Gesamtzeit eines einzelnen Zeitpunkterfassung sollte ein kleiner Bruchteil des Intervalls zwischen den Zeitpunkten sein.
Der Phasenkorrelationsverfahren, diebildet die Grundlage des Verfahrens bestimmt die erforderlich ist, um einen Zeitpunkt mit dem nächsten Übersetzungs auszurichten. Wichtig ist nur Translationsbewegungen werden korrigiert und dadurch die Drehung um jede der Achsen (x, y, z) wird nicht korrigiert. Für viele der möglichen Ursachen der Drift, wie im Brennpunkt Drift, Bühne Positionsänderung wird eine Übersetzung perfekt beschreiben die Bewegung. Wenn jedoch die Bewegung der Probe umfasst Drehung eine Übersetzung nicht in der Lage, die notwendige Korrektur zu beschreiben. Die Phasenkorrelation wird immer noch erlauben, die meisten ähnlichen Positionen zu bestimmen und zu nutzen, die beste Übersetzung, was zu einer gewissen Verbesserung der Registrierung, aber wenn es erhebliche Dreh alternative Methoden, die die Verwendung von Landmarken im Bild, wäre besser geeignet.
Das Plug-in wurde entwickelt, um mit virtuellen Stacks ermöglicht die Anzeige und Registrierung von Dateien, die größer als der verfügbare Speicher zu arbeiten. Die Dateien sind read von der Platte, wie für die Analyse und die Ergebnisse der auf der Festplatte als Bildsequenz, anstelle einer einzigen Bilddatei gespeichert Anmeldung erforderlich. Dies ermöglicht die Verwendung eines Computers mit weniger RAM als die Gesamtgröße der Datenmenge, die maximale Größe der Datenmenge anstelle von Festplattenspeicherplatz begrenzt ist. Da jeder Zeitpunkt wird mit der nachfolgenden Zeitpunkt ausgerichtet ist, muss der Computer über genügend Speicher zur Verfügung zu zwei Zeitpunkten öffnen und schließen Sie die Phasenkorrelationsanalyse. Die Fähigkeit, erweiterte Registrierung und Probenanalyse Korrektur auf Systemen mit beschränkten Ressourcen durchführen mit frei verfügbarer Software, eröffnet sich die Möglichkeit, anspruchsvolle Nachbearbeitung zu einem viel breiteren wissenschaftlichen Publikum.
Wir haben die Verwendung des Protokolls beschrieben Drift im Zebrafisch konfokalen Datensätze zu korrigieren, aber der Ansatz auf Ergebnisse, die mit jeder Art von Probe-oder 3D-Bilderzeugungssystem angewandt werden. Als Ergebnis in der Zukunft diese Technik auch einDatasets mit der Magnetresonanztomographie, optischen Projektionstomographie, Röntgen-Computertomographie, und Lichtbogen-Mikroskopie und anderen Schwellenbildgebenden Verfahren erhalten ngewandte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir möchten Gaby Martins und die Organisatoren der EMBO2010 3D Imaging Entwicklungs Werkstatt, in der diese Arbeit begann und alle von den Beitragszahlern der Fidschi und ImageJ Projekte danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
