Summary
समय चूक माइक्रोस्कोपी विकास की प्रक्रिया की अनुमति देता है. छवि अधिग्रहण के दौरान विकास या नमूनों का बहाव सही पालन और विकास के दौरान सेल आंदोलनों को मापने की क्षमता कम कर देता है. हम समय के साथ तीन आयामी नमूना बहाव के लिए सही करने के लिए खुला स्रोत इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन.
Abstract
चार आयामी (4D) confocal डेटासेट की पीढ़ी; समय के साथ 3 डी छवि दृश्यों से मिलकर; विकास की प्रक्रिया में शामिल सेलुलर व्यवहार पर कब्जा करने के लिए एक उत्कृष्ट कार्यप्रणाली प्रदान करता है. सेल गतिविधियों पर नज़र रखने और पालन करने की क्षमता छवि अधिग्रहण के दौरान नमूने के बहाव या, कुछ मामलों में, विकास की वजह से होती है कि नमूना आंदोलनों के द्वारा सीमित है. बहाव और / या विकास से प्रभावित डेटासेट में ट्रैकिंग कोशिकाओं सेल की स्थिति के किसी भी विश्लेषण में इन आंदोलनों को शामिल करेंगे. इस नमूने के भीतर स्थिर संरचनाओं के स्पष्ट आंदोलन में हो सकता है. इसलिए पूर्व सेल ट्रैकिंग करने के लिए, किसी भी नमूने बहाव सही किया जाना चाहिए. ImageJ 2,3 के खुले स्रोत फिजी वितरण 1 और शामिल loci उपकरण 4 का उपयोग कर, हम confocal डेटासेट में गलत नमूना आंदोलन को दूर करने के लिए सही 3 डी बहाव प्लग में विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से फोकल पुलिस में नमूना अनुवाद या परिवर्तन के लिए क्षतिपूर्तिविस्तारित समय चूक प्रयोगों से अधिक सेल आंदोलनों कल्पना और उपाय करने की क्षमता को बनाए रखते हुए एक चार आयामी confocal डेटासेट का प्रत्येक समय बिंदु रजिस्टर करने के लिए चरण सहसंबंध का उपयोग करके विपक्षी.
Introduction
Confocal इमेजिंग व्यापक रूप आकारिकी में सेल आंदोलनों और परिवर्तनों का पालन करने के लिए सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. विभिन्न फोकल विमानों पर ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला पर कब्जा करने की अनुमति देता है तो 3 डी डेटासेट का एक समय चूक श्रृंखला बनाकर चार आयाम (4D) में बढ़ाया जा सकता है जो एक नमूना के एक तीन आयामी (3 डी) मॉडल, की पीढ़ी. 4D डेटासेट की पीढ़ी सेल आंदोलनों और व्यवहार की विस्तृत माप की अनुमति देता है. लंबी अवधि के समय चूक प्रयोगों में यह नमूना आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए आम है. इस हार्डवेयर को नियंत्रित करने के चरण में है और केंद्र की स्थिति में मामूली अशुद्धियों के कारण हो सकता है. दूसरों के मामलों में, बहाव नमूना बढ़ते मीडिया के भीतर नमूना विकास या लचीलापन द्वारा प्रेरित आंदोलनों का एक परिणाम है. तरीके हार्डवेयर ध्यान केंद्रित सिस्टम में सुधार और बढ़ते मध्यम की वृद्धि की कठोरता सहित इन आंदोलनों क्षतिपूर्ति या सीमित करने के लिए मौजूद हैं. हालांकि, इन तरीकों के कारण इमेजिंग के लिए कई मामलों में लागू नहीं किया जा सकता हैएट ऊपर नमूने रखरखाव और विकास के लिए उपयुक्त स्थितियां प्रदान करने की आवश्यकता है. ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर समाधान ImageJ या फिजी में StackReg और TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins के उपयोग के माध्यम से, समय के साथ 2 डी में आंदोलन के सुधार के लिए मौजूद है, लेकिन इन नहीं कर सकते 4D डेटासेट के लिए लागू किया.
नमूना बहाव के लिए सही करने के लिए हम खुले स्रोत इमेजिंग प्रसंस्करण मंच, फिजी 1 उपयोग करने के लिए एक प्लग में (सही 3 डी बहाव) विकसित किया है. हमारे प्लग में तीन आयामी समय चूक प्रयोगों में नमूना बहाव का एक परिणाम के रूप में होता है कि आंदोलन को सही करने के चरण सहसंबंध पंजीकरण प्रदर्शन करने में सक्षम है. चरण सहसंबंध 6 छवियों के बीच अनुवाद निर्धारित करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल कारगर तरीका है. यहाँ वर्णित प्लग में Preibisch एट अल. 7 द्वारा विकसित चरण सहसंबंध पुस्तकालय का इस्तेमाल करता. मल्टी चैनल प्रयोगों में, प्लग में determi के लिए एक चैनल का इस्तेमालअपेक्षित सुधार NE. यह सुधार तो 4D डाटासेट के पंजीकरण में जिसके परिणामस्वरूप किसी भी अतिरिक्त चैनलों के लिए आवेदन किया है.
Zebrafish मॉडल प्रणाली में यह कई घंटे, या यहाँ तक कि कई दिन 8 की अवधि में समय चूक इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए संभव है. Zebrafish बढ़ते के लिए एक आम तरीका अपने आंदोलन 9-11 सीमित है, कम पिघलने बिंदु agarose (0.8-1.5%) में anaesthetized लाइव भ्रूण एम्बेड करने के लिए है. आंदोलन सीमित है जबकि नमूना का विकास अभी भी स्थिति बदलता देखने के क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप होता है. भ्रूण के भीतर कोशिकाओं के आंदोलन का पालन करने के लिए आदेश में यह पहली बार पूरे नमूना के आंदोलन के लिए सही करने के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल zebrafish नमूनों के साथ विकसित किया गया था, और छवि विखंड विकास 12 का उपयोग किया गया है, लेकिन किसी भी 4D confocal डाटासेट करने के लिए लागू किया जा सकता है.
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Protocol
1. 4D समय चूक इमेजिंग प्रयोगों
छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स उपयोग उपकरणों के आधार पर अलग होगा. उत्तेजना, पिनहोल आकार, उद्देश्य की संख्यात्मक एपर्चर, नमूना के अपवर्तनांक और नमूना एम्बेडेड है जिसमें मध्यम की वेवलेंथ: ऑप्टिकली अनुभाग एक नमूना करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी की क्षमता के लिए कई कारकों पर निर्भर करता है. चयनित confocal पिनहोल के आकार एकत्र ऑप्टिकल अनुभाग की मोटाई का निर्धारण करेगा. एक छोटे पिनहोल एक पतली ऑप्टिकल खंड z-अक्ष संकल्प बढ़ रही है, लेकिन कब्जा कर लिया प्रकाश की मात्रा को कम करने का उत्पादन होगा. एक बड़ा पिनहोल Z-अक्ष प्रस्ताव को कम करने, लेकिन कब्जा कर लिया प्रकाश की मात्रा में वृद्धि, ऑप्टिकल अनुभाग की मोटाई में वृद्धि होगी.
पूर्व सुधार करने 4D डेटा के संग्रह के दौरान विचार करने के लिए अतिरिक्त कारकों में शामिल हैं:
- डी हटाने, या सीमा, बहाव स्कैनिंग गति का अनुकूलनएक ही समय बिंदु का कब्जा uring. इसलिए छवि संग्रह के लिए लिया गया समय समय अंक के बीच अंतराल का एक छोटा सा अंश होना चाहिए.
- यह आवश्यक सुधार निर्धारित करना संभव नहीं है के रूप में पूरी तरह से दोहराई जाने वाली संरचनाओं, या ग्रिड, पंजीकरण के लिए संरचनाओं के रूप में उपयुक्त नहीं हैं. बेतरतीब ढंग से वितरित मोती या असमान संरचनाओं स्पष्ट पंजीकरण की अनुमति देगा.
- बहाव की उम्मीद है, तो ब्याज के क्षेत्र छवि ढेर के भीतर रहता है यह सुनिश्चित करने के क्रम में स्कैनिंग क्षेत्र और ऊपरी और निचले फोकस सीमा बढ़ा सकते हैं.
- यह सुनिश्चित करने के अलावा, ब्याज की संरचनाओं को सुलझाने का अध्ययन किया जा रहा है गतिशील घटनाओं के लिए अस्थायी समाधान प्रदान करने के लिए नमूना दर निर्धारित करने के लिए उचित स्थानिक संकल्प है.
नोट: छवि समय अंक के बीच का समय इसलिए नियमित रूप से दोहराए जाने की घटनाओं के बीच कम से कम आधे समय अंतराल हो सकता है और अनियमित घटनाओं के लिए कम करना चाहिए.
2. Confocal डी खुलनेataset
खुला स्रोत पैकेज फिजी माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से एकत्र आंकड़ों पर कई प्रक्रियाओं को करने के लिए पहले से स्थापित प्लग इन शामिल हैं जो ImageJ कार्यक्रम के एक वितरण है. सॉफ्टवेयर आसान प्लग में अद्यतन वास्तुकला प्रदान करता है और इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल सही 3 डी बहाव प्लग की एक प्रतिलिपि भी शामिल है. सॉफ्टवेयर खुला माइक्रोस्कोपी पर्यावरण जैव प्रारूप आयात प्लग के उपयोग के माध्यम से मालिकाना माइक्रोस्कोपी छवि प्रारूप का एक विशाल सरणी के आयात का समर्थन करता है.
- फिजी प्रोग्राम स्थापित (http://fiji.sc/Downloads).
- Loci जैव स्वरूप आयातक प्लगइन का उपयोग कर हासिल डाटासेट लोड करें.
- डाटासेट कार्यक्रम के लिए आवंटित स्मृति से बड़ा है, स्मृति प्रबंधन अनुभाग के भीतर "का प्रयोग आभासी ढेर विकल्प" का चयन करें.
3. पोस्ट प्रोसेसिंग में एक 3D वस्तु की दिशा सही
एक विस्तारित समय चूक के दौरानएम्बेडेड भी जब एक नमूना स्थानांतरित कर सकते हैं प्रयोग. किसी भी आंदोलन को ठीक करने और imaged प्रवास घटनाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए, छवियों के पद प्रसंस्करण किया जा सकता है. सभी छवि पोस्ट प्रोसेसिंग स्पष्ट रूप से इस काम से प्राप्त किसी भी विश्लेषण की पद्धति में वर्णित किया जाना चाहिए.
- डाटासेट भरी हुई है, एक बार सही 3 डी बहाव प्लगइन चलाते हैं.
- एकाधिक छवि चैनल हैं, तो छवियों रजिस्टर करने के लिए प्रयोग की जाने वाली चैनल का चयन करें. यह आदर्श नहीं बल्कि किसी भी प्रवासी या मोबाइल तत्वों से नमूना भीतर एक स्थिर संरचना का प्रतिनिधित्व करना चाहिए. यह संभव नहीं है हालांकि, अगर कम से कम आंदोलन के साथ चैनल से चुना जाना चाहिए.
- इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल सिस्टम पर उपलब्ध रैम मूल डाटासेट की कम दो बार की तुलना में आकार है, तो उपयोग आभासी ढेर विकल्प का चयन करें. इस बल्कि राम को फ़ाइल बचत की तुलना में, एक छवि अनुक्रम के रूप में पंजीकृत hyperstack की दुकान है.
- उत्पादन व्यक्ति के लिए प्लग के लिए एक फ़ोल्डर का चयन भारतीय सैन्य अकादमी को सहीGES फ़ाइलें. एक अलग छवि फ़ाइल प्रत्येक Z स्थिति में प्रत्येक चैनल के लिए बनाया जाएगा.
- प्लगइन तो फिर डाटासेट करने के लिए लागू किया जाता है, जो आवश्यक सुधार का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक समय बिंदु के बीच एक जोड़ी वार चरण सहसंबंध विश्लेषण का संचालन करेंगे.
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Representative Results
13 - विकासशील zebrafish में, तेजी से मांसपेशियों की कोशिकाओं 19 घंटे के बाद निषेचन (विखंड चरण 20) से multinucleated तंतुओं में फ्यूज. नाभिक के आंदोलन और हम पेशी के सभी लेबल कंकाल α actin के प्रमोटर के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक तनाव का उपयोग 4D confocal समय चूक इमेजिंग बाहर किया मांसपेशियों की कोशिकाओं के विलय कल्पना करने के लिए आदेश में 14 कोशिकाओं और mCherry नाभिक लेबल करने के लिए, एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम के साथ टैग लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग शाही सेना इंजेक्शन. इंजेक्शन ट्रांसजेनिक भ्रूण कम पिघलने बिंदु agarose और एक 2 घंटे समय की अवधि में 2.0 माइक्रोन अंतराल हर 20 मिनट पर कब्जा कर 71 ऑप्टिकल वर्गों से मिलकर एक छवि अनुक्रम में रखा गया. लगभग 7 माइक्रोन का नमूना बहाव छा छवियों के (चित्रा 1 ए) और Nucl के स्पष्ट आंदोलन धुंधला में जिसके परिणामस्वरूप, समय चूक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर मनाया गयाEI समय के साथ (चित्रा 1 बी). प्लगइन का आवेदन एक पंजीकृत छवि अनुक्रम (आंकड़े 1 सी और 1 डी) में परिणाम को देखा जा सकता है.
चित्रा 1:. प्रोटोकॉल तीन आयामी अंतरिक्ष में छवि अधिग्रहण मांसपेशी विशिष्ट GFP अभिव्यक्ति (ए) और mCherry (बी) के लिए जुड़े हुए परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम दिखा uncorrected डाटासेट से हर समय बिंदु से अधिकतम अनुमानों का औसत प्रक्षेपण छवि दौरान नमूना आंदोलन rectifies. इस आंदोलन की हद मांसपेशी नाभिक और फ्यूजन ट्रैक करने की क्षमता कम कर देता है, और GFP छवि के धुंधला स्पष्ट है. परिणामस्वरूप सही छवियों डाटासेट के पंजीकरण का प्रदर्शन, (सी) और (डी) में दिखाया गया.
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Discussion
विस्तारित समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से व्युत्पन्न डेटासेट का नमूना बहाव को दूर करने के बाद प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए हमारी क्षमता कारकों की एक संख्या से प्रतिबंधित है. एक नमूना के प्रवासी आंदोलन बनाम बहाव विचार करने के लिए क्षमता का इस्तेमाल किया सेलुलर मार्कर पर निर्भर है. या तो व्यापक रूप से एक नमूना भीतर व्यक्त कर रहे हैं या छवि अधिग्रहण के दौरान प्रवासी घटनाओं में शामिल नहीं कर रहे हैं कि सेलुलर मार्कर बहाव सुधार के लिए सबसे अच्छा स्रोत प्रदान करते हैं. प्लगइन समय अंक के बीच आंदोलन रजिस्टर करने के लिए एक चैनल का उपयोग करता है और फिर एकत्र छवि के सभी चैनलों के लिए यह पंजीकरण लागू होता है. इसलिए, यह ब्याज के नमूने में दो फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. प्रयोग के दौरान बहाव से विस्थापित करने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं कि लेबल संरचनाओं को एक नज़र रखी जाएगी कि कोशिकाओं या संरचनाओं के लिए मार्कर और एक दूसरे मार्कर,. पंजीकरण एक चैनल के साथ डेटासेट पर आयोजित किया जा सकता है, इसलिए यदि वीं के बहुमतई डेटा स्थानांतरित करने के लिए उम्मीद की केवल एक छोटे से अनुपात के साथ छवि में स्थिर होना चाहिए. छवि का एक बड़ा हिस्सा आंदोलन मापा आंदोलन में कमी, जिसके परिणामस्वरूप में किसी भी बहाव के अलावा, के लिए सही हो जाएगा कि समय अंक के बीच चलता है.
इस पांडुलिपि में स्थापित प्रोटोकॉल कोई आंदोलन प्रत्येक व्यक्ति समय सूत्री की पहली और आखिरी ऑप्टिकल खंड के बीच है कि वहाँ हो जाती है. यह स्कैन किया जा रहा वस्तु के आकार के रूप में मान्यताओं बनाने के बिना एक भी समय बिंदु के भीतर हो सकता है कि बहाव के लिए सही करने के लिए संभव नहीं है. आदर्श रूप में छवि संग्रह के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मापदंडों आंदोलन पर कब्जा कर लिया प्रत्येक समय बिंदु के भीतर होने के लिए क्षमता की सीमा होगी. इस प्रकार की छवि अनुक्रम कब्जा करने के लिए लगने वाले समय के रूप में संभव के रूप में कम किया जाना चाहिए. एक ही समय बिंदु अधिग्रहण का कुल समय समय अंक के बीच अंतराल का एक छोटा सा अंश होना चाहिए.
चरण सहसंबंध विधि, जोप्रक्रिया का आधार बनाता है, अगले के साथ एक समय बिंदु संरेखित करने के लिए आवश्यक अनुवाद निर्धारित करता है. महत्वपूर्ण बात केवल translational आंदोलनों के लिए सही कर रहे हैं और इसलिए अक्ष (एक्स, वाई, जेड) के किसी भी चारों ओर रोटेशन सही नहीं होगा. ऐसे फोकल बहाव, चरण स्थिति बदलाव के रूप में बहाव के कारण संभव हो, के कई लोगों के लिए, एक अनुवाद पूरी तरह से आंदोलन का वर्णन करेंगे. नमूना आंदोलन रोटेशन शामिल है हालांकि, अगर एक अनुवाद आवश्यक सुधार का वर्णन करने में सक्षम नहीं होगा. चरण सहसंबंध अभी भी सबसे अधिक इसी तरह की स्थिति निर्धारित करने की अनुमति दे और पंजीकरण में कुछ सुधार में जिसके परिणामस्वरूप, सबसे अच्छा अनुवाद का उपयोग, लेकिन छवि में स्थलों के उपयोग की अनुमति महत्वपूर्ण रोटेशन वैकल्पिक तरीके नहीं हैं, तो अधिक उपयुक्त होगा होगा.
प्लग में उपलब्ध स्मृति की तुलना में फ़ाइलों को देखने और पंजीकरण बड़ा इजाजत दी आभासी ढेर के साथ काम करने के लिए डिजाइन किया गया है. फ़ाइलें इसकी वजह हैंविश्लेषण और नहीं बल्कि एक छवि फ़ाइल से एक छवि अनुक्रम के रूप में डिस्क को बचाया पंजीकरण के परिणामों के लिए आवश्यकता के रूप में डिस्क से डी. इस डेटा सेट के कुल आकार से कम राम के साथ एक कंप्यूटर का उपयोग, डाटासेट का अधिकतम आकार के बजाय उपलब्ध हार्ड डिस्क स्थान द्वारा सीमित किया जा रहा है की अनुमति देता है. हर बार सूत्री बाद समय बिंदु के साथ गठबंधन किया है के रूप में कंप्यूटर दो समय अंक खुला और चरण सहसंबंध विश्लेषण पूरा करने के लिए उपलब्ध स्मृति पर्याप्त होना चाहिए. सीमित संसाधनों के साथ सिस्टम पर, आसानी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उन्नत पंजीकरण और नमूना सुधार विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता, एक बहुत व्यापक वैज्ञानिक दर्शकों को परिष्कृत बाद के प्रसंस्करण की क्षमता को खोलता है.
हम zebrafish confocal डेटासेट में बहाव सही करने के लिए प्रोटोकॉल के उपयोग का वर्णन किया है, लेकिन दृष्टिकोण किसी भी नमूने के प्रकार या 3 डी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के लिए लागू किया जा सकता है. भविष्य में एक परिणाम के रूप में इस तकनीक को भी एक हो सकता हैचुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी, एक्स - रे कंप्यूटर टोमोग्राफी, और प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी, और अन्य उभरती इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर प्राप्त डेटासेट के लिए pplied.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम भोला आदमी मार्टिंस और यह काम शुरू किया और फिजी और ImageJ परियोजनाओं के लिए योगदानकर्ताओं के सभी जहां EMBO2010 3D विकास इमेजिंग कार्यशाला के आयोजकों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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