Summary
Time-lapse mikroskopi tillater visualisering av utviklingsprosesser. Vekst eller drift av prøvene under bildet oppkjøpet reduserer evnen til å nøyaktig følge og måle celle bevegelser under utvikling. Vi beskriver anvendelse av åpen bildebehandling for å korrigere for tredimensjonale prøve drift over tid.
Abstract
Den generasjonen av fire-dimensjonale (4D) confocal datasett; bestående av 3D-bildesekvenser over tid; gir en utmerket metode for å fange cellulære atferd som er involvert i utviklingsprosesser. Evnen til å spore og følge cellebevegelser begrenses av eksempel bevegelser som oppstår på grunn av drift av prøven eller, i noen tilfeller, vekst under bildeopptak. Sporing celler i datasett rammet av drift og / eller vekst vil innlemme disse bevegelsene inn i noen analyse av celle posisjon. Dette kan føre til at den tilsynelatende bevegelse av statiske strukturer i prøven. Derfor før celle sporing, bør noen prøve drift bli rettet. Bruk av åpen kildekode Fiji distribusjon en av ImageJ 2,3 og innlemmet loci verktøy 4, utviklet vi riktig 3D drift plug-in for å fjerne feilaktige prøve bevegelse i confocal datasett. Denne protokollen effektivt kompenserer for prøveoversettelse eller endringer i fokus posammensetningen ved å utnytte fasekorrelasjons å registrere hver gang-punktet i en fire-dimensjonale datasett confocal samtidig som evnen til å visualisere og måle celle bevegelser over lange tidsintervall eksperimenter.
Introduction
Confocal bildebehandling er mye brukt i celle-og utviklingsbiologi å følge celle bevegelser og endringer i morfologi. Fange en serie av optiske seksjoner ved forskjellige brennplan tillater generering av et tredimensjonalt (3D)-modell av en prøve, som deretter kan forlenges inn i fire dimensjoner (4D) ved å opprette en tidsintervallserie av 3D datasett. Den generasjonen av 4D datasett gir detaljert måling av celle bevegelser og atferd. I langvarige time-lapse eksperimenter er det vanlig å observere prøve bevegelse. Dette kan være forårsaket av små unøyaktigheter i maskinvare styre fasen og kontaktstillinger. Mens i andre tilfeller er drift på grunn av bevegelsene indusert av prøven vekst eller fleksibilitet i prøven festemateriale. Metoder eksisterer for å kompensere eller begrense disse bevegelsene herunder forbedringer i metallfokuseringssystemer og øker stivheten av monteringsmedium. Imidlertid kan disse metodene ikke kan anvendes i mange tilfeller på grunn av den avbildning set opp pålagt å gi gode vilkår for prøvene vedlikehold og vekst. Åpen kildekode programvare løsninger finnes for korreksjon av bevegelse i 2D over tid, gjennom bruk av StackReg og TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins i ImageJ eller Fiji, men disse kan ikke anvendes på 4D-datasett.
For å korrigere for prøven drift har vi utviklet en plug-in (Riktig 3D drift) for å utnytte open-source bildebehandling-prosessplattform, Fiji en. Vår plug-in er i stand til å utføre fasekorrelasjons registrering for å korrigere bevegelsen som oppstår som et resultat av prøven drift i tredimensjonale time-lapse eksperimenter. Fase korrelasjon 6 er en beregnings effektiv metode for å bestemme oversettelse mellom bildene. Den plug-in som er beskrevet her utnytter fase-korrelasjon bibliotek utviklet av Preibisch et al. 7. I multi-kanal eksperimenter, utnytter plug-in én kanal til fastsettelsenne den nødvendige korreksjon. Denne korreksjonen blir deretter påført noen ekstra kanaler som resulterer i registreringen av 4D datasett.
I sebrafisk modellsystemet er det mulig å utføre tidsforsinkelse avbildning over et tidsrom på flere timer eller til og med flere dager 8. En vanlig metode for montering av sebrafisk er å bygge inn den bedøvet levende embryo i lavt smeltepunkt agarose (0,8-1,5%), begrense bevegelsen 9-11. Mens bevegelsen er begrenset vekst av prøven alltid forekommer, noe som resulterer i at cellene innenfor synsfeltet skiftende stilling. For å følge bevegelsen av cellene i løpet av embryoet er det nødvendig først å korrigere for bevegelsen av hele prøven. Denne protokollen ble utviklet med sebrafisk eksemplarer, og har vært benyttet til bilde somitt utvikling 12, men kan brukes på alle 4D confocal datasett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. 4D Time-lapse bildebehandling eksperimenter
Innstillingene som brukes for bildeopptak vil variere avhengig av utstyret som brukes. Muligheten av konfokal mikroskopi til optisk seksjon en prøve er avhengig av en rekke faktorer: den bølgelengde på eksitasjon, pinhole størrelse, numerisk apertur på målet, brytningsindeks for prøven og det medium hvori prøven er innleiret. Størrelsen av konfokal pinhole valgt, vil bestemme tykkelsen av den optiske delen oppsamlet. En mindre pinhole vil produsere en optisk tynnere seksjon øker z-aksen oppløsning, men reduserer mengden av lys som fanges. En større pinhole vil øke tykkelsen av den optiske delen, noe som reduserer z-aksen oppløsning, men øke mengden av lys som fanges.
Andre faktorer å vurdere under innsamling av 4D-data før korreksjon inkluderer:
- Optimalisere skannehastighet for å fjerne, eller begrense, drive during fangst av en enkelt tids-punkt. Derfor er den tid det tar for det bilde samlingen skal være en liten brøkdel av intervallet mellom tids-punktene.
- Helt gjentatte strukturer, eller gittere, er ikke egnet som strukturer for registrering som det ikke er mulig å bestemme den nødvendige korreksjon. Tilfeldig fordelt perler eller ujevne strukturer vil tillate entydig registrering.
- Ved drift er forventet, øke skanneområdet og øvre og nedre fokus grenser for å sikre at det området av interesse forblir innenfor den bildestabel.
- I tillegg til å sikre det er hensiktsmessig romlig oppløsning for å løse strukturer av interesse, sette samplingsfrekvensen for å gi tidsmessig oppløsning for de dynamiske hendelser som blir studert.
Merk: Tiden mellom bilde tidspunkter bør derfor være minst halvparten av tiden-intervallet mellom vanlige gjentatte hendelser og redusere for uregelmessige hendelser.
To. Åpne Confocal Dataset
Den åpne kildepakke Fiji er en fordeling av ImageJ programmet, som inneholder pre-installert plug-ins for å utføre en rekke prosesser på data samlet inn fra mikroskopi eksperimenter. Programvaren gir enklere plug-in oppdatering arkitektur og inkluderer en kopi av Korrekt 3D drift plug-in som brukes for denne protokollen. Programvaren støtter import av en lang rekke proprietære mikrosbildeformater gjennom bruk av Open Mikrosmiljøvern Bio-formater import plug-in.
- Installer Fiji program (http://fiji.sc/Downloads).
- Legg den oppkjøpte datasett bruker Loci Bio-formater Importør plugin.
- Hvis datasettet er større enn minnet allokert til programmet, velg "Bruk virtuell stabel alternativet" innenfor Minnehåndtering delen.
Tre. Rette Drift av et 3D-objekt i Post Processing
I løpet av en utvidet time-lapseeksperimentere en prøve kan bevege seg selv når innebygd. For å korrigere noen bevegelse og å tillate migrasjons hendelser avbildes som skal analyseres, kan etterbehandling av bildene skal utføres. Alle bildeetterbehandling må være tydelig beskrevet i metodikken i enhver analyse avledet fra dette arbeidet.
- Når datasettet er lastet, kjøre Korrekt 3D drift plugin.
- Hvis det er flere bilde kanaler, velge kanalen som skal brukes for å registrere bildene. Det bør ideelt representerer en statisk struktur i prøven i stedet for migrerende eller mobile elementer. Men hvis dette ikke er mulig på kanalen med minst bevegelse bør velges.
- Hvis den tilgjengelige RAM på systemet som brukes for denne analysen er mindre enn dobbelt så stort som det opprinnelige datasettet, velg bruk virtuell stabel alternativet. Dette vil lagre den registrerte hyperstack som en bildesekvens, snarere enn å lagre filen til RAM.
- Velg en mappe for plug-in for å sende ut enkelte korrigert imaGES filer. En egen bildefilen vil bli opprettet for hver kanal på hver z posisjon.
- Det plugg vil da utføre et parvis fasekorrelasjonsanalyse mellom hver gang-punkt for å bestemme den nødvendige korreksjon som påføres deretter til datasettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utviklingssebrafisk, raske muskelceller smelter sammen i multinucleated fibre fra 19 timer etter befruktning (20 - somitt scenen) 13. For å visualisere bevegelsen av kjerner og sammensmelting av muskelceller vi utført 4D konfokal time-lapse avbildning ved hjelp av et transgent stamme som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av den skjelett α-actin promoter for å merke alle muskelen cellene 14 og injisert RNA som koder for det røde fluorescerende protein mCherry merket med et atomlokaliseringssekvens, å merke kjerner. Injiserte transgene embryoer ble montert på lavt smeltepunkt agarose og en bildesekvens som består av 71 optiske seksjoner digitalisert med 2,0 mikrometer intervaller hvert 20. minutt i løpet av en 2 timers tidsrom. Eksempel på drift på ca 7 mikron ble observert i løpet av den time-lapse forsøket, noe som resulterer i uskarphet av de overlappende bilder (figur 1A) og tilsynelatende bevegelse av Nuclei over tid (Figur 1B). Anvendelse av det plugg kan ses å gi et registrert bilde-sekvens (figurene 1C og 1D).
Figur 1: Protokollen korrigerer prøven bevegelse under bildet oppkjøpet i tredimensjonalt rom Gjennomsnittlig projeksjon bilde av maksimalt anslag fra hvert tidspunkt av ukorrigert datasett viser muskler spesifikk GFP uttrykk (A) og kjernefysiske lokalisering sekvens smeltet til mCherry (B).. Omfanget av denne bevegelsen minsker evnen til å spore de muskel kjerner og fusjon, og uskarphet i GFP bilde er tydelig. De resulterende korrigerte bilder er vist i (C) og (D), noe som viser registreringen av datasettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår evne til å bruke post-prosessering programvare for å rette prøven drift av datasett avledet fra lengre tid-lapse mikroskopi eksperimenter er begrenset av en rekke faktorer. Evnen til å skjelne drift versus trekkende bevegelse av en prøve er avhengig av de cellulære markører brukes. Cellular markører som enten er allment uttrykt i en prøve eller ikke er involvert i trekkende hendelser under bildet oppkjøpet gir den beste kilden for korreksjon av drifting. Det plugg bruker en enkelt kanal for å registrere bevegelsen mellom tids-punktene og deretter anvender denne registrering for alle kanalene av bildet oppsamlet. Derfor kan det være en fordel å bruke to fluorescerende markører i prøver av interesse. En markør for celler eller strukturer som skal spores og en andre markør, til etikett strukturer som ikke antas å migrere bortsett fra drift i løpet av eksperimentet. Registrering kan bli gjennomført på datasett med en enkelt kanal, men i så fall de fleste av thdata bør være stillestående i bildet med bare en liten andel forventes å bevege seg. Hvis beveger seg en stor del av bildet mellom tids-punktene for at bevegelsen blir korrigert for, i tillegg til eventuell avdrift, noe som resulterer i en reduksjon av bevegelsen måles.
Den protokoll etablert i dette manuskriptet forutsetter at det ikke er noen bevegelse mellom den første og siste optiske delen av hver enkelt tids-punkt. Det er ikke mulig å korrigere for drift som kan oppstå i løpet av en enkelt tids-punkt uten å gjøre antagelser med hensyn til formen på gjenstanden som skal skannes. Ideelt de eksperimentelle parametere som benyttes for bilde samling ville begrense potensialet for bevegelse til å oppstå i løpet av hvert tidspunkt fanget. Således tiden det tar for å ta bildet sekvensen bør være så kort som mulig. Den totale tiden for en eneste gang punkt anskaffelse skulle være en liten brøkdel av intervallet mellom tids-punktene.
Den fasekorrelasjonsmetode, noeligger til grunn for fremgangsmåten, bestemmer oversettelse som kreves for å justere en tid-punkt med den neste. Viktigere bare translasjonelle bevegelser er korrigert for, og derfor rotasjon rundt en hvilken som helst av aksen (x, y, z) blir ikke korrigert. For mange av de mulige årsakene til drift, for eksempel fokus drift, scene posisjon variasjon, vil en oversettelse perfekt beskrive bevegelsen. Dersom prøven inneholder rotasjonsbevegelse en oversettelse ikke vil være i stand til å beskrive den nødvendige korreksjon. Den fase-korrelasjon vil fortsatt tillate de tilsvarende stillinger som skal bestemmes og utnytte best translasjon, noe som resulterer i en viss forbedring i registreringen, men hvis det var signifikante rotasjon alternative metoder som tillater bruk av landemerker i bildet, ville være mer passende.
Den plug-in har blitt utviklet for å fungere med virtuelle stabler tillater visning og registrering av filer som er større enn det tilgjengelige minnet. Filene er read fra disken som er nødvendig for analysen og resultatet av registreringen lagret på disken i en bildesekvens, i stedet for en enkelt bildefil. Dette tillater bruk av en maskin med mindre minne enn den totale størrelse av datasettet er den maksimale størrelsen av datasett istedenfor å være begrenset av hard-diskplass. Som hver gang-punktet er på linje med den etterfølgende tid-punkt datamaskinen må ha nok minne til å åpne to time-poeng og fullføre fase korrelasjonsanalyse. Evnen til å utføre avansert registrering og prøve korreksjon analyse ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare, på systemer med begrensede ressurser, åpner opp muligheten for avansert etterbehandling til et mye bredere vitenskapelig publikum.
Vi har beskrevet anvendelse av protokollen for å korrigere drift i sebrafisk confocal datasett men fremgangsmåten kan anvendes på resultatene som oppnås ved bruk av hvilken som helst type av prøve-eller 3D-avbildningssystem. Som et resultat i fremtiden denne teknikken kan også være enpplied til datasett innhentet ved hjelp av magnetisk resonans imaging, optisk projeksjon tomografi, x-ray datamaskin tomografi, og lys ark mikroskopi, og andre fremvoksende imaging teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Gaby Martins og arrangørene av EMBO2010 3D Developmental Imaging workshop hvor dette arbeidet begynte og alle bidragsytere til Fiji og ImageJ prosjekter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
