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Bioengineering

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

doi: 10.3791/51086 Published: April 12, 2014

Summary

Time-lapse microscopía permite la visualización de los procesos de desarrollo. El crecimiento o la deriva de las muestras durante la adquisición de imágenes se reduce la capacidad de seguir y medir los movimientos de las células durante el desarrollo precisión. Se describe el uso de software de procesamiento de imagen de código abierto para corregir la deriva de tres dimensiones de la muestra con el tiempo.

Abstract

La generación de cuatro dimensiones (4D) de datos confocal; que consiste en secuencias de imágenes en 3D a través del tiempo; proporciona una excelente metodología para capturar comportamientos celulares implicados en los procesos de desarrollo. La capacidad de rastrear y seguir los movimientos de células está limitado por los movimientos de la muestra que se producen debido a la deriva de la muestra o, en algunos casos, el crecimiento durante la adquisición de la imagen. Células de seguimiento en los conjuntos de datos afectados por la deriva y / o el crecimiento incorporarán estos movimientos en cualquier análisis de la posición de la célula. Esto puede resultar en el movimiento aparente de las estructuras estáticas dentro de la muestra. Por lo tanto antes de la célula de seguimiento, la deriva de la muestra debe ser corregida. Usando el código abierto de distribución de Fiji 1 de ImageJ 2,3 y las herramientas incorporadas LOCI 4, hemos desarrollado el 3D correcta deriva plug-in para eliminar el movimiento de la muestra errónea en los conjuntos de datos confocal. Este protocolo compensa con eficacia para la traducción de la muestra o alteraciones en po focalción mediante la utilización de correlación de fase que registrarse en cada punto de una de cuatro dimensiones de datos confocal, manteniendo la capacidad de visualizar y medir los movimientos celulares sobre experimentos con lapso de tiempo prolongados.

Introduction

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De formación de imágenes confocal es ampliamente utilizado en biología celular y del desarrollo de seguir los movimientos celulares y cambios en la morfología. La captura de una serie de secciones ópticas en diferentes planos focales permite la generación de un modelo tridimensional (3D) de una muestra, que luego se puede extender en cuatro-dimensiones (4D) mediante la creación de una serie de lapso de tiempo de conjuntos de datos 3D. La generación de bases de datos 4D permite la medición detallada de los movimientos celulares y comportamientos. En experimentos con lapso de tiempo a largo plazo, es común observar el movimiento de la muestra. Esto puede ser causado por ligeras imprecisiones en el control de la etapa de hardware y posiciones focales. Mientras que en otros casos, la deriva es un resultado de los movimientos inducidos por el crecimiento de la muestra o la flexibilidad dentro de los medios de montaje de la muestra. Existen métodos para compensar o limitar estos movimientos incluyendo mejoras en sistemas de enfoque de hardware y aumento de la rigidez del medio de montaje. Sin embargo, estos enfoques no pueden aplicarse en muchos casos debido a la s de formación de imágenesuesta obligada a proporcionar las condiciones adecuadas para el mantenimiento y crecimiento de las muestras. Soluciones de software de código abierto no existir para la corrección de movimiento en 2D con el tiempo, a través del uso de las StackReg y TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins en ImageJ o Fiji, pero éstos no pueden ser aplicado a conjuntos de datos 4D.

Para corregir la deriva de la muestra se ha desarrollado un plug-in (deriva 3D correcta) para utilizar la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji 1. Nuestro plug-in es capaz de realizar el registro de correlación de fase para corregir el movimiento que se produce como resultado de la deriva de la muestra en los experimentos de lapso de tiempo de tres dimensiones. Fase 6 de correlación es un método eficiente de cálculo para determinar la traducción entre imágenes. El plug-in se describe aquí utiliza la biblioteca fase de correlación desarrollada por Preibisch et al. 7. En experimentos de varios canales, el plug-in utiliza un canal a determine la corrección requerida. Esta corrección se aplica entonces a los canales adicionales resultantes en el registro de la base de datos 4D.

En el sistema modelo de pez cebra es posible llevar a cabo de imagen de lapso de tiempo durante un período de muchas horas, o incluso varios días 8. Un método común para el montaje del pez cebra es la de insertar el embrión vivo anestesiado en agarosa de bajo punto de fusión (0,8-1,5%), lo que restringe su movimiento 9-11. Mientras que el movimiento se restringe el crecimiento de la muestra aún se produce, lo que resulta en las células dentro del campo de visión posición de cambio. Con el fin de seguir el movimiento de las células en el embrión es necesario para corregir primera para el movimiento de toda la muestra. Este protocolo fue desarrollado con especímenes de pez cebra, y se ha utilizado para el desarrollo de la imagen somite 12, pero puede ser aplicada a cualquier conjunto de datos confocal 4D.

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Protocol

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1. 4D Time-lapse experimentos de imagen

La configuración utilizada para la adquisición de la imagen serán diferentes dependiendo del equipo utilizado. La capacidad de la microscopía confocal para la sección ópticamente una muestra depende de un número de factores: la longitud de onda de excitación, el tamaño del agujero de alfiler, la apertura numérica del objetivo, el índice de refracción de la muestra y el medio en el que se incrusta la muestra. El tamaño del agujero de alfiler de la confocal seleccionado determinará el espesor de la sección óptica recogido. Un agujero de alfiler más pequeño producirá una sección óptica más delgada aumento de la resolución del eje z, pero reduciendo la cantidad de luz capturada. Un agujero de alfiler grande aumentará el espesor de la sección óptica, la reducción de la resolución del eje z, pero el aumento de la cantidad de luz capturada.

Otros factores a tener en cuenta durante la recolección de datos 4D anteriores a la corrección incluyen:

  1. Optimizar la velocidad de exploración para eliminar o limitar la deriva durante la captura de un solo punto de tiempo. Por lo tanto el tiempo necesario para la colección de la imagen debe ser una pequeña fracción del intervalo entre los puntos de tiempo.
  2. Perfectamente estructuras de repetición, o rejillas, no son adecuados como estructuras para el registro, ya que no es posible determinar la corrección requerida. Perlas distribuidas aleatoriamente o estructuras desiguales permitirán registro inequívoco.
  3. Si se espera que la deriva, aumentar el área de escaneado y los límites superior e inferior de enfoque con el fin de asegurar que el área de interés se mantiene dentro de la pila de imágenes.
  4. Además de asegurar que hay una resolución espacial adecuada para resolver las estructuras de interés, establecer la frecuencia de muestreo para proporcionar resolución temporal de los eventos dinámicos que se están estudiando.
    Nota: Por consiguiente, el tiempo entre la imagen los puntos de tiempo debe ser por lo menos la mitad del intervalo de tiempo entre los eventos que se repiten regularmente y reducir los eventos irregulares.

2. Abrir la Confocal Dataset

El paquete de código abierto Fiji es una distribución del programa ImageJ, que contiene los plug-ins instalados previamente para realizar numerosos procesos en los datos obtenidos a partir de experimentos de microscopía. El software proporciona fácil actualización arquitectura plug-in e incluye una copia del plug-in de deriva 3D correcta utilizado para este protocolo. El software es compatible con la importación de una amplia gama de formatos de imágenes de microscopía de propiedad a través del uso del Open Microscopía Medio Ambiente Bio-Formatos de importación plug-in.

  1. Instale el programa de Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Cargue el conjunto de datos adquiridos mediante el Importador Plugin LOCI Bio-Formats.
  3. Si el conjunto de datos es mayor que la memoria asignada al programa, seleccione la opción "Usar la opción de pila virtual" dentro de la sección de gestión de memoria.

3. Corrección de la deriva de un objeto 3D en el procesamiento posterior

Durante el transcurso de un lapso de tiempo prolongadoexperimentar una muestra puede moverse incluso cuando incrustado. Para corregir cualquier movimiento y permitir que los eventos de migración fotografiados a analizar, el procesamiento posterior de las imágenes se puede realizar. Todo el procesamiento posterior de las imágenes debe estar claramente descrito en la metodología de cualquier análisis derivado de este trabajo.

  1. Una vez que el conjunto de datos se ha cargado, ejecute la correcta plugin de deriva 3D.
  2. Si hay varios canales de imagen, seleccione el canal que se utilizará para registrar las imágenes. Esto debería representar idealmente una estructura estática dentro de la muestra en lugar de los elementos migratorias o móviles. Sin embargo, si esto no es posible el canal con el menor movimiento debe ser elegido.
  3. Si la memoria RAM disponible en el sistema utilizado para este análisis es inferior a dos veces el tamaño del conjunto de datos original, seleccione la opción pila virtual uso. Esto almacenará la HyperStack registrada como una secuencia de imágenes, en lugar de guardar el archivo en la memoria RAM.
    1. Seleccione una carpeta para el plug-in a individuo salida corregida imaarchivos Ges. Un archivo de imagen independiente se creará para cada canal en cada posición de z.
  4. El plugin luego realizar un análisis de correlación de fase por pares entre cada punto de tiempo para determinar la corrección requerida, que se aplica a la base de datos.

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Representative Results

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En el pez cebra en desarrollo, las células musculares rápidas funden en fibras multinucleadas de 19 horas después de la fertilización (20 - somite etapa) 13. Con el fin de visualizar el movimiento de los núcleos y la fusión de las células musculares que llevamos a cabo 4D de lapso de tiempo de formación de imágenes confocal utilizando una cepa transgénica que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de α-actina de músculo esquelético para etiquetar todo el músculo las células 14 y se inyecta ARN que codifica la proteína fluorescente de color rojo mCherry etiquetado con una secuencia de localización nuclear, para etiquetar los núcleos. Embriones transgénicos inyectados se montan en un bajo punto de fusión de agarosa y una secuencia de imágenes que consta de 71 secciones ópticas capturadas en intervalos 2.0 micras cada 20 minutos durante un período de tiempo de 2 horas. Se observó la deriva de muestra de aproximadamente 7 micras en el transcurso del experimento de lapso de tiempo, lo que resulta en borrosidad de las imágenes superpuestas (Figura 1A) y movimiento aparente del NuclEI con el tiempo (Figura 1B). Aplicación de la extensión puede ser visto a resultar en una secuencia de imágenes registrada (Figuras 1C y 1D).

Figura 1
Figura 1: El protocolo rectifica movimiento de la muestra durante la adquisición de la imagen en el espacio de tres dimensiones de la imagen de proyección media de las proyecciones de máxima de cada punto del conjunto de datos sin corregir mostrando la expresión de GFP músculo específica (A) y la secuencia de localización nuclear fusionada a mCherry (B) el tiempo.. La extensión de este movimiento reduce la capacidad de seguir los núcleos musculares y de fusión, y el desenfoque de la imagen de GFP es evidente. Las imágenes corregidas resultantes se muestran en (C) y (D), lo que demuestra el registro del conjunto de datos.

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Discussion

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Nuestra capacidad de utilizar el software de post-procesamiento para corregir la deriva de la muestra de los conjuntos de datos derivados de experimentos de microscopía de lapso de tiempo prolongados está restringida por una serie de factores. La capacidad de discernir la deriva frente a movimiento migratorio de una muestra depende de los marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que se expresan ampliamente, ya sea dentro de una muestra o no participan en eventos migratorias durante la adquisición de imágenes proporcionan la mejor fuente para la corrección de la deriva. El plugin utiliza un solo canal para registrar el movimiento entre los puntos de tiempo y luego se aplica este registro a todos los canales de la imagen recogida. Por lo tanto, puede ser ventajoso utilizar dos marcadores fluorescentes en muestras de interés. Un marcador para las células o estructuras que se llevará un seguimiento y un segundo marcador, a estructuras de etiqueta que no se espera que migrar aparte de la deriva durante el experimento. La inscripción se llevará a cabo en los conjuntos de datos con un solo canal, pero si lo que la mayoría de thdatos electrónicos deben ser estacionario en la imagen con sólo una pequeña proporción esperada para moverse. Si una gran proporción de la imagen se mueve entre los puntos de tiempo que el movimiento será corregido para, además de cualquier deriva, lo que resulta en una reducción en el movimiento medido.

El protocolo establecido en este manuscrito asume que no hay movimiento entre la primera y última sección óptica de cada punto de tiempo individual. No es posible corregir la deriva que puede ocurrir dentro de un solo punto de tiempo sin hacer suposiciones como a la forma del objeto que está siendo escaneada. Lo ideal sería que los parámetros experimentales utilizados para la recolección de la imagen limitarían las posibilidades de movimiento que se produzca en cada punto temporal capturado. Por lo tanto el tiempo necesario para capturar la secuencia de imágenes debe ser tan corto como sea posible. El tiempo total de un tiempo de adquisición de un solo punto debe ser una pequeña fracción del intervalo entre los puntos de tiempo.

El método de correlación de fase, el cualconstituye la base del procedimiento, determina la traducción requerida para alinear un punto de tiempo con la siguiente. Es importante destacar que sólo movimientos de traslación se corrigen para y por lo tanto la rotación alrededor de cualquiera de los ejes (x, y, z) no serán corregidos. Para muchas de las posibles causas de la deriva, como la deriva focal, la variación de posición de fase, una traducción se describen perfectamente el movimiento. Sin embargo, si el movimiento de la muestra incluye la rotación de una traducción no será capaz de describir la corrección necesaria. La fase de correlación todavía permitirá que las posiciones más similares a determinar y utilizar la mejor traducción, lo que resulta en una cierta mejora en el registro, pero si había alternativas metodológicas rotación significativos que permiten el uso de puntos de referencia en la imagen, sería más adecuado.

El plug-in ha sido diseñado para funcionar con pilas virtuales que permiten la visualización y registro de los archivos más grandes de la memoria disponible. Los archivos son read desde el disco como se requiere para el análisis y los resultados del registro guardado en el disco como una secuencia de imágenes, en lugar de un solo archivo de imagen. Esto permite el uso de un equipo con menos memoria RAM que el tamaño total del conjunto de datos, el tamaño máximo del conjunto de datos en lugar de ser limitado por el espacio disponible en disco duro. A medida que cada punto de tiempo se alinea con el punto de tiempo posterior, el equipo debe tener suficiente memoria disponible para abrir dos puntos de tiempo y completar el análisis de correlación de fase. La capacidad de realizar el registro y análisis avanzados de corrección de la muestra utilizando un software de libre disposición, en sistemas con recursos limitados, se abre la posibilidad de sofisticados post-procesamiento para una audiencia científica mucho más amplia.

Hemos descrito el uso del protocolo para corregir la deriva en los conjuntos de datos confocal de pez cebra, pero el enfoque se puede aplicar a los resultados obtenidos utilizando cualquier tipo de muestra o sistema de imágenes 3D. Como resultado, en el futuro esta técnica también podría ser unapplied a conjuntos de datos obtenidos mediante imágenes de resonancia magnética, tomografía de proyección óptica, la tomografía computerizada de rayos X y microscopía de lámina de luz, y otras técnicas de imagen emergentes.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Gaby Martins y los organizadores del taller EMBO2010 3D Developmental Imaging donde comenzó este trabajo y todos los colaboradores de los proyectos de Fiyi y ImageJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Low gelling temperature agarose Sigma-Aldrich A9414-25G
Dumont #4 Forceps Electron Microscopy Sciences 0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated Samco 212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes Greiner Bio One 632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing Bola S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective Zeiss 421452-9600-000

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References

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  2. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, (7), 42-42 (2004).
  3. Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43, (S1), 25-30 (2007).
  4. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  5. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, (1), 27-41 (1998).
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  7. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25, (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
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  9. Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
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Cite this Article

Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51086, doi:10.3791/51086 (2014).More

Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51086, doi:10.3791/51086 (2014).

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