Summary
Time-lapse mikroskopi gelişimsel süreçlerin görselleştirme sağlar. Görüntü alımı sırasında büyüme veya örneklerin sürüklenme doğru takip ve gelişim sırasında hücre hareketlerini ölçmek için yeteneğini azaltır. Biz zamanla üç boyutlu örnek kaymalarını düzeltmek için açık kaynak kodlu bir resim işleme yazılımı kullanımını tanımlamak.
Abstract
Dört boyutlu (4D) konfokal veri setlerinin üretimi; zaman 3D görüntü sekansların oluşturduğu; gelişim süreçleri dahil hücresel davranışları yakalamak için mükemmel bir yöntem sağlar. Hücre hareketlerini izlemek ve takip yeteneği görüntü alımı sırasında numunenin kayması ya da, bazı durumlarda, bir büyüme nedeniyle meydana örnek hareketleri ile sınırlıdır. Sürüklenme ve / veya büyüme etkilenen veri kümelerinde Takip hücrelerin hücre konumundaki herhangi bir analiz içine bu hareketleri dahil edecektir. Bu durum, numune içindeki statik yapıların görünür hareketi neden olabilir. Bu nedenle önce hücre izleme, herhangi bir numune sürüklenme düzeltilmelidir. ImageJ 2,3 açık kaynak Fiji dağıtımı 1 ve dahil LOCI araçlarını kullanma 4, biz konfokal veri setlerinin hatalı örnek hareketi kaldırmak için Doğru 3D sürüklenme plug-in geliştirdi. Bu protokol etkin odak po örnek çeviri veya değişiklikler dengeleruzun time-lapse deneyler üzerinde hücre hareketleri görselleştirmek ve ölçmek için yeteneğini korurken dört boyutlu konfokal veri setlerinin her zaman noktasını kaydetmek için faz korelasyonu kullanarak sition.
Introduction
Konfokal görüntüleme yaygın morfolojisi hücre hareketleri ve değişiklikleri takip etmek, hücre ve gelişim biyolojisi kullanılır. Farklı odak düzlemleri optik bölümleri bir dizi yakalama sağlar, sonra 3D veri setlerinin bir time-lapse serisi oluşturarak dört boyutlu (4D) içine uzatılabilir bir örnek üç boyutlu (3D) modelinin üretimi. 4D veri setlerinin nesil cep hareketlerin ve davranışların detaylı ölçümünü sağlar. Uzun vadeli time-lapse deneylerde örnek hareketini gözlemlemek yaygındır. Bu donanım kontrol aşamasında ve fokal pozisyonlarda hafif yanlışlıklar neden olabilir. Başkaları durumlarda, sürüklenme örnek montaj medya içinde örnek büyümesi ya da esneklik tarafından uyarılan hareketlerin bir sonucu iken. Yöntemler donanım odaklama sistemlerine iyileştirmeler ve montaj orta artırılmış sertlik dahil, bu hareketleri telafi ya da sınırlamak için vardır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar nedeniyle görüntüleme s birçok durumda uygulanamamaktadırve yukarı numuneler bakım ve büyümesi için uygun koşullar sağlamak için gereklidir. Açık kaynak yazılım çözümleri ImageJ veya Fiji StackReg ve TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 eklentileri kullanımı yoluyla, zamanla 2D hareketin düzeltilmesi için var, ama bu olamaz 4D veri setlerine uygulanabilir.
Örnek sürüklenme düzeltmek için biz açık kaynak görüntüleme işleme platformu, Fiji 1 kullanmak için bir plug-in (Doğru 3D sürüklenme) geliştirdik. Bizim plug-in üç boyutlu time-lapse deneylerde örnek sürüklenmesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar hareketi düzeltmek için faz korelasyon kaydını gerçekleştirmek mümkün değildir. Faz korelasyon 6 görüntüleri arasında çeviri belirlemek için bir hesaplama etkili bir yöntemdir. Burada açıklanan plug-in Preibisch vd. 7 tarafından geliştirilen faz-korelasyon kütüphane kullanır. Çok kanallı deneylerde, plug-in saptamaya bir kanal kullanırGerekli düzeltme ne. Bu düzeltme, daha sonra 4D kümesi kayıt ile sonuçlanan herhangi bir ek kanal tatbik edilir.
Zebra balığı model sistemde birçok saatlerce, hatta birkaç gün 8 bir süre içinde zaman atlamalı görüntüleme yürütmek mümkündür. Zebrafish monte etmek için yaygın bir yöntem, hareketini kısıtlayan 9-11, düşük erime noktasına sahip agaroz (% 0.8-1.5) 'de anestezi canlı embriyo gömmek etmektir. Hareket sınırlı iken numunenin büyüme hala konumu kaydırılarak görüş alanı içindeki hücrelerin sonuçlanan oluşur. Embriyonun içindeki hücrelerin hareketini takip etmek için ilk olarak Numunenin tamamının hareket düzeltmek için gereklidir. Bu protokol, zebra balığı numuneler ile geliştirilen, ve görüntü hücre gruplarının geliştirme 12 için kullanılmıştır fakat herhangi bir 4D konfokal kümesi uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. 4D Time-lapse Görüntüleme Deneyleri
Görüntü elde etmek için kullanılan ayarları kullanılan donanıma bağlı olarak farklılık gösterecektir. Uyarma, iğne deliği boyutunu, hedef sayısal açıklık, numunenin kırılma endeksi ve örnek gömülü olduğu orta dalga boyu: optik bölümünde bir örnek için eş odaklı mikroskopi kabiliyeti bir dizi faktöre bağlıdır. Seçilen konfokal iğne deliği boyutunu toplanmış optik kısmın kalınlığını belirleyecektir. Daha küçük bir iğne deliği ince bir optik bölüm z ekseni artan çözünürlük, ancak yakalanan ışık miktarını azaltmak üretecektir. Daha büyük bir z-ekseni iğne deliği çözünürlüğünü azaltan fakat yakalanan ışık miktarını artırarak, optik kısmın kalınlığı artacaktır.
Önce düzeltme 4D veri toplama sırasında dikkate ek faktörler şunlardır:
- D kaldırmak veya limit, sürüklenmeye tarama hızı optimizetek bir zaman noktası yakalama uring. Bu nedenle görüntü toplama için alınan zaman zaman noktaları arasındaki aralığın küçük bir bölümü olması gerekir.
- Bu, gerekli düzeltme tespit etmek mümkün değil gibi mükemmel tekrar eden yapılar, ya da ızgaralar, kayıt için yapılar gibi uygun değildir. Rastgele dağıtılan boncuklar veya düzensiz yapılar kesindir kayıt sağlayacaktır.
- Sürüklenme beklenen ise, ilgi alanı görüntü yığını içinde kalmasını sağlamak amacıyla tarama alanını ve üst ve alt odak sınırlarını artırmak.
- Sağlamanın yanı sıra, ilgi yapılarını çözmek çalışılan dinamik etkinlikler için temporal çözünürlük sağlamak için örnekleme oranını ayarlamak için uygun mekansal çözünürlüğü var.
Not: Görüntü zaman noktaları arasındaki süre nedenle düzenli tekrarlanan olaylar arasında en az yarım zaman aralığı olması ve düzensiz olaylar için düşmelidir.
2.. Eşodaklı D Açılışataset
Açık kaynak paketi Fiji mikroskobu deneylerden toplanan veriler üzerinde çeşitli işlemleri gerçekleştirmek için önceden yüklenmiş eklentileri içeren ImageJ programı, bir dağılımıdır. Yazılım kolay eklentisi güncelleme mimarisi sağlar ve bu protokol için kullanılan Doğru 3D sürüklenme plug-in bir kopyasını içerir. Yazılım Açık Mikroskopi Environment Bio-Biçimleri ithalat plug-in kullanımı yoluyla mülkiyet mikroskopi görüntü biçimlerinin geniş bir dizi ithalat destekler.
- Fiji programı yükleyin (http://fiji.sc/Downloads).
- LOCI Bio-Biçimleri İthalatçı eklentisi kullanarak edinilen veri kümesi yükleyin.
- Veri kümesi program için ayrılan bellek büyükse, Bellek yönetimi bölümünde "Use sanal yığın seçeneğini" seçin.
3.. Mesaj İşleme 3D Nesne Drift düzeltme
Uzun bir zaman sukut sırasındagömülü bile örnek bir hareket edebilir deneme. Herhangi bir hareketi düzeltmek için ve görüntülü göç olayları analiz edilecek izin, görüntü işleme sonrası yapılabilir. Tüm görüntü işleme açıkça bu işten elde edilen herhangi bir analizin metodolojisi tarif edilmelidir.
- Veri kümesi yüklendikten sonra, Doğru 3D sürüklenme eklentisi çalıştırmak.
- Birden fazla görüntü kanalları varsa, görüntüleri kaydetmek için kullanılacak kanalı seçin. Bu ideal değil, herhangi bir göçmen veya mobil elemanların daha örnek içinde statik bir yapıyı temsil etmelidir. Eğer bu mümkün değilse, ancak, en az bir hareket ile kanal seçilmelidir.
- Bu analiz için kullanılan sistemde mevcut RAM orijinal veri kümesi iki katından az boyut ise, kullanımı sanal yığın seçeneğini seçin. Bu oldukça RAM'de dosya kaydetme yerine, bir görüntü dizisi olarak kayıtlı hyperstack depolar.
- Çıkış bireye plug-in için bir klasör seçin ima düzeltilmişGes dosyaları. Ayrı bir resim dosyası, her z pozisyonunda her kanal için oluşturulur.
- Eklenti daha sonra kümesi uygulanır gerekli düzeltme belirlemek için her zaman noktası arasında bir çift-bilge faz korelasyon analizi yapacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
13 - Gelişmekte olan Zebra balığı, hızlı kas hücreleri 19 saat sonrası fertilizasyon (somite aşama 20) adlı çok çekirdekli fiberlerin kaynaşmasına. Çekirdeklerin hareketini ve kas her etiket için iskelet α-aktin promoterinin kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik suşu kullanılarak 4D konfokal zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirilir kas hücrelerinin füzyon görselleştirmek amacıyla Hücreler 14 ve MCherry çekirdekleri etiketlemek için, bir nükleer lokalizasyon dizisi ile etiketlendi kırmızı floresan proteini kodlayan RNA enjekte edilmiştir. Enjekte Transgenik embriyolar, düşük erime noktasına sahip agaroz ve 2 saatlik bir zaman süresi boyunca 2.0 um aralıklarla her 20 dakikada bir 71 çekilen optik bölümden oluşan bir görüntü dizisi monte edilmiştir. Yaklaşık 7 um örnek sürüklenme üst üste binen görüntülerin (Şekil 1A) ve Nucl belirgin hareket bulanıklık ile sonuçlanan, zaman atlamalı deney boyunca gözlendiei zaman (Şekil 1 B). Eklenti uygulama kayıtlı görüntü dizisi (Şekil 1C ve 1D) neden olduğu görülebilir.
Şekil 1:. Protokolü, üç boyutlu uzayda görüntü alımı kas spesifik GFP (A) ve mCherry (B) erimiş nükleer lokalizasyon sırasını gösteren düzeltilmemiş kümesi her zaman noktasında maksimum projeksiyonlar Ortalama projeksiyon görüntü sırasında örnek hareketini düzeltir. Bu hareketin ölçüde kas çekirdek ve füzyon izlemek için yeteneğini azaltır ve GFP görüntünün bulanık belirgindir. Elde edilen düzeltilmiş görüntü veri kümesi kaydını gösteren, (C) ve (D) 'de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uzun zaman atlamalı mikroskopi deneylerden elde edilen veri örnek kaymasını düzeltmek için post-işleme yazılımı kullanmak için yeteneği bir dizi faktöre ile sınırlıdır. Bir numunenin göç hareketine karşı sürüklenme ayırt yeteneği kullanılan hücresel belirteçleri bağlıdır. Ya yaygın bir örnek içinde ifade edilir veya görüntü alımı sırasında göç olayları dahil olmayan hücresel belirteçleri sürüklenme düzeltilmesi için en iyi kaynağı sağlamak. Eklenti zaman noktaları arasındaki hareketi kaydetmek için bir tek kanal kullanır ve daha sonra toplanır görüntünün tüm kanallar için bu kaydı geçerlidir. Bu nedenle, bu ilgi örneklerinde iki fluoresan işaretleri kullanmak avantajlı olabilir. Deney sırasında ayrı sürüklenme göç beklenmemektedir etiket yapıları için bir izlenir hücreler ya da yapıların için bir gösterge ve bir ikinci işaretleyici. Kayıt tek bir kanaldan veri setleri üzerinde yapılan edilebilir ama eğer öyleyse inci çoğunluğue veri taşımak için beklenen sadece küçük bir oranda görüntüde sabit olmalıdır. Görüntünün büyük bir kısmı hareketin ölçülen hareketinde bir azalma ile sonuçlanan, herhangi bir kayma ilave olarak, düzeltilmiş olacaktır zaman noktaları arasında hareket ederse.
Bu yazıda kurulan protokol hiçbir hareket her zaman noktası ilk ve son optik bölümde arasında olduğunu varsayar. Bu, taranan nesnenin şekline olarak varsayımlara olmadan tek bir zaman noktası içinde oluşabilecek kaymalarını doğru mümkün değildir. İdeal olarak görüntü toplama için kullanılan deney parametreleri hareket çekilen her zaman noktası içinde meydana gelmesi için potansiyel sınırı olacaktır. Böylece görüntü dizisini yakalamak için alınan süre mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Tek zaman noktalı satın alma toplam zaman zaman noktaları arasındaki aralığın küçük bir bölümü olması gerekir.
Faz ilişki metod olup, kiprosedürünün temelini oluşturur, daha sonra bir zaman noktası hizalamak için gerekli olan çeviri belirler. Daha da önemlisi, yalnızca öteleme hareketleri için düzeltilir ve bu nedenle eksen (x, y, z) herhangi bir etrafında döndürme düzeltilmeyecektir. Bu tür odak kayması, sahne pozisyon değişikliği gibi kayması olası nedenleri, çoğu için, bir çeviri mükemmel hareketi anlatacağız. Örnek hareket dönüşünü içerir Ancak, bir çeviri gerekli düzeltme açıklamak mümkün olmayacaktır. Faz-korelasyon hala en benzer pozisyonları belirlenecek izin ve tescil bazı iyileşme ile sonuçlanan, en iyi çeviri kullanmak, ancak görüntüdeki yerlerinden kullanımına izin veren önemli bir rotasyon alternatif yöntemler olsaydı, daha uygun olurdu olacaktır.
Plug-in mevcut hafızanın daha dosyaları görüntüleme ve kayıt geniş sağlayan sanal yığınları ile çalışmak üzere dizayn edilmiştir. Dosyalar rea vardıranaliz ve yerine tek bir görüntü dosyası daha bir görüntü dizisi olarak diske kaydedilmiş kayıt sonuçları için gerektiği gibi diskten d. Bu veri setinin toplam boyutundan daha az RAM ile bir bilgisayar kullanımı, veri kümesi maksimum boyutu yerine kullanılabilir sabit disk alanı ile sınırlı olmak sağlar. Her zaman noktası sonraki zaman noktası ile uyumlu olarak bilgisayarda iki zaman-noktalarını açın ve faz korelasyon analizi tamamlamak için yeterli bellek olmalıdır. Sınırlı kaynaklarla sistemlerde, serbestçe kullanılabilir yazılımı kullanarak gelişmiş kayıt ve düzeltme örnek analiz gerçekleştirmek için yeteneği, daha geniş bir bilimsel kitleye gelişmiş post-işleme yeteneği açılır.
Biz, zebra balığı konfokal veri setleri de sürüklenme düzeltmek için protokolünün kullanılmasını tarif etmiştir, ancak yaklaşım her numunenin bir tür ya da 3 boyutlu görüntüleme sistemi kullanılarak elde edilen sonuçlar ile uygulanabilir. Gelecekte bir sonucu olarak, bu teknik, olabilirmanyetik rezonans görüntüleme, optik projeksiyon tomografi x-ışını bilgisayar tomografisi ve hafif levha mikroskobu ve diğer gelişmekte olan görüntüleme teknikleri kullanılarak elde edilen veri setlerine pplied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz Gaby Martins ve bu çalışma başladı ve Fiji ve ImageJ projelere katkıda tüm EMBO2010 3D Gelişimsel Görüntüleme atölye düzenleyenlere teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
