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अनुकूलित नकारात्मक धुंधला: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा लघु और असममित प्रोटीन संरचना की जांच के लिए एक उच्च throughput प्रोटोकॉल

Published: August 15, 2014 doi: 10.3791/51087
Automatic Translation
1, 1, 1
1Lawrence Berkeley National Laboratory, The Molecular Foundry

Summary

अधिक प्रोटीन की तुलना में आधे से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग और तीन आयामी पुनर्निर्माण दोनों के लिए चुनौती दे रहे हैं कि छोटे प्रोटीन (आणविक जन <200 केडीए) कर रहे हैं. अनुकूलित नकारात्मक धुंधला उच्च विपरीत और अपेक्षाकृत उच्च संकल्प (~ 1 एनएम) विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत छोटे असममित प्रोटीन या परिसरों की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक मजबूत और उच्च throughput प्रोटोकॉल है.

Abstract

200 केडीए - प्रोटीन की स्ट्रक्चरल दृढ़ संकल्प बल्कि 40 के बीच आणविक जनता के साथ प्रोटीन के लिए चुनौती है. प्राकृतिक प्रोटीन के आधे से अधिक 40 के बीच एक आणविक द्रव्यमान है यह देखते हुए कि - 200 केडीए 1,2, एक नैनोमीटर संकल्प की क्षमता के साथ एक मजबूत और उच्च throughput विधि की जरूरत है. नकारात्मक धुंधला (एन) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) अक्सर प्रोटीन संरचना और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है जो एक आसान, तेजी से, और गुणात्मक दृष्टिकोण है. दुर्भाग्य से, परंपरागत एन एस प्रोटोकॉल अक्सर विशेष रूप से आमतौर पर rouleaux कलाकृतियों पेश कि फार्म लिपो प्रोटीन के साथ, प्रोटीन पर संरचनात्मक कलाकृतियों उत्पन्न करते हैं. एक मानक के रूप में क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) से लिपो प्रोटीन की छवियों का उपयोग करके, एन एस नमूना तैयार करने की स्थिति में मुख्य मापदंडों हाल ही में जांच की गई और अनुकूलित एन एस प्रोटोकॉल (OpNS), एक संशोधित पारंपरिक एन एस प्रोटोकॉल 3 के रूप में की सूचना दी. आरओ तरह कलाकृतियोंuleaux बहुत अतिरिक्त (1 एनएम के पास) यथोचित उच्च संकल्प के साथ उच्च विपरीत छोटे और विषम प्रोटीन की छवियों को उपलब्ध कराने, OpNS द्वारा सीमित किया जा सकता है. इन उच्च संकल्प और उच्च विपरीत छवियों इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 4,5 की विधि के माध्यम से, इस तरह के एक 160 केडीए एंटीबॉडी के रूप में एक व्यक्ति प्रोटीन (एक भी वस्तु, कोई औसत) 3 डी पुनर्निर्माण के लिए भी अनुकूल हैं. इसके अलावा, OpNS छोटे प्रोटीन के नमूने के सैकड़ों की जांच के लिए एक उच्च throughput उपकरण हो सकता है. उदाहरण के लिए, 53 केडीए cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन के पहले प्रकाशित तंत्र (CETP) नमूने 6 के सैकड़ों की स्क्रीनिंग और इमेजिंग शामिल किया गया. को ध्यान में रखते क्रायो ईएम शायद ही कभी सफलतापूर्वक छवियों प्रोटीन कम से कम 200 केडीए एक सौ से अधिक नमूने शर्तों स्क्रीनिंग शामिल किसी भी अध्ययन प्रकाशित करने के लिए अभी तक है, यह OpNS छोटे प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक उच्च throughput विधि कॉल करने के लिए उचित है. उम्मीद है कि यहाँ प्रस्तुत OpNS प्रोटोकॉल ई की सीमाओं को बढ़ाने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता हैएम छोटे प्रोटीन संरचना, गतिशीलता और तंत्र में ईएम पढ़ाई में तेजी लाने और.

Introduction

प्रोटीन समारोह को समझना प्रोटीन संरचना का ज्ञान की आवश्यकता है. 200 केडीए - स्ट्रक्चरल दृढ़ संकल्प जिसका आणविक जनता 40 के भीतर हैं प्रोटीन के लिए चुनौती है. एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण द्वारा सीमित है; क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) आणविक जनता कम कर रहे हैं जो दोनों छवि अधिग्रहण और छोटे प्रोटीन के तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण में कठिनाई है, जबकि परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, 40 केडीए से कम आणविक जनता तक सीमित है 200 केडीए से. विशेष रूप से, 50% से अधिक प्रोटीन 40 की सीमा के भीतर एक आणविक जन - मौजूदा तरीकों इस आकार के प्रोटीन का अध्ययन करने में चुनौती दे रहे हैं, के रूप में 200 केडीए 1,2, एक नई विधि की जरूरत है.

सबसे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) परमाणु संकल्प, यानी, बेहतर 3 से एक प्रस्ताव में सक्षम हैं हालांकि, एक जैविक नमूने से भी एक के पास नैनोमीटर संकल्प संरचना को प्राप्त करने के बजाय challen हैging 7. विकिरण क्षति, कम विपरीत, संरचनात्मक विचलन के साथ ही निर्जलीकरण के रूप में कलाकृतियों सभी उच्च संकल्प मंदिर इमेजिंग 3,8 बाधा.

विभिन्न मंदिर दृष्टिकोण के अलावा, क्रायो ईएम पास शारीरिक स्थितियों 9-12 के तहत अत्यधिक सममित बड़े अणुओं के परमाणु संकल्प संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए एक उन्नत और अत्याधुनिक विधि है. क्रायो ईएम नमूना बाद में इस तरह के तरल नाइट्रोजन या हीलियम तापमान 13 के रूप में क्रायोजेनिक तापमान पर imaged है जो कांच का बर्फ, में बड़े अणुओं एम्बेड, नमूना समाधान ठंड फ़्लैश तैयार किया जाता है. नमूने है कि कोई कलाकृतियों वर्तमान और संरचना 8-12 में लगभग मूल निवासी हैं में क्रायो ईएम फायदेमंद है. अतिरिक्त उपकरणों स्थापित या एक क्रायो ईएम क्षमता के लिए एक मानक मंदिर साधन के उन्नयन के लिए खरीदे जाने की आवश्यकता है मैं): क्रायो ईएम अपने नुकसान है. उपकरण शामिल हैं: विरोधी contaminator, क्रायो धारक, कम खुराक मोड सॉफ्टवेयर और कम खुराक Sensiेश्य सीसीडी कैमरा, इन उपकरणों की कीमतों में मंदिर साधन ही की कीमत से काफी कम हैं, हालांकि; द्वितीय) क्रायो ईएम आपरेशन एन एस आपरेशन की तुलना में अब समय की जरूरत है. एक क्रायो ईएम नमूना जांच अक्सर एन एस की तुलना में मंदिर साधन नमूनों को तैयार करने और संचालित करने के लिए अब समय की आवश्यकता है क्रायो ईएम सहित अतिरिक्त कठिनाइयों को संबोधित आवश्यकता है: तरल नाइट्रोजन तापमान आपरेशन, नमूना चार्ज, इमेजिंग बहाव, तापमान ढ़ाल, कम खुराक मॉडल आपरेशन, नमूना विकिरण संवेदनशीलता और खुराक सीमाओं. कुछ क्रायो EM छवियों निश्चित रूप से एक संतुलित तापमान ढाल के साथ तैयार साधन के साथ क्रायो ईएम विशेषज्ञों द्वारा 1 घंटा या उससे कम समय में प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि इन अतिरिक्त कदम, एन एस डाटा अधिग्रहण की तुलना में उपयोगी डेटा प्राप्त करने की गति धीमी हो जाएगी; iii) उपयोगकर्ताओं ऐसे इमेजिंग proc में, क्रायो EM ग्रिड, कम खुराक आपरेशन, खुराक माप ठंड, तरल नाइट्रोजन से निपटने चार्ज संभाल रही, बहती है और ज्ञान के रूप में अतिरिक्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती हैEssing; विभिन्न मंदिर सत्र के दौरान एक ही क्रायो नमूना के लिए repeatable इमेजिंग के चतुर्थ) की कमी है. क्रायो ईएम नमूनों आसानी मंदिर साधन से / नमूना लदान और उतराई के दौरान बर्फ संदूषण से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. इस नुकसान के नमूने अलग किया जाना मुश्किल हो जाता है जब विशेष रूप से चिंता का विषय है / 14 शुद्ध; v) छोटे प्रोटीन (<200 केडीए आणविक द्रव्यमान) चुनौती दे रहे हैं, क्योंकि कम विपरीत की imaged किया जा; vi) क्रायो EM छवियों के विपरीत कम और उच्च शोर विशेष रूप से संरचनात्मक लचीला कर रहे हैं कि प्रोटीन के लिए प्रोटीन झुकाव, रचना और वर्गीकरण, के निर्धारण में समग्र सटीकता कम है, इसलिए, छवियों के बीच पार सहसंबंध मूल्य कम कर देता है और स्वाभाविक रूप से समाधान में उतार चढ़ाव 4,5.

नकारात्मक धुंधला (एन) किसी भी प्रयोगशाला, किसी भी प्रकार के ईएम के साथ, प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए उपयोग कर सकते हैं जो एक अपेक्षाकृत "प्राचीन" और ऐतिहासिक विधि है. ब्रेनर और हॉर्न पहली अवधारणा ओ विकसितच वायरस 15 की जांच के लिए एक आधी सदी पहले नकारात्मक धुंधला. एन एस आरोप लगाया भारी धातु लवण के साथ नमूना कोटिंग के माध्यम से पूरा किया है. इस अवधारणा मूल रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोपी और नकारात्मक छवि 16 देखते समय उच्च छवि के विपरीत, की अनुमति नमूनों चारों ओर अंधकार उपलब्ध कराने के एक दाग समाधान में बैक्टीरिया embedding के अभ्यास से आ रहा है. भारी धातु आयनों प्रोटीन 17-20 में कम घने परमाणुओं की तुलना में इलेक्ट्रॉनों को फैलाने के लिए एक अधिक से अधिक क्षमता है, और कोटिंग भारी धातु दाग सुधार विपरीत के साथ एक उच्च खुराक सीमा परमिट के बाद से. एन एस नमूना आसान कण उन्मुखीकरण दृढ़ संकल्प और क्रायो ईएम से छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उच्च विपरीत छवियों 8 प्रदान कर सकते हैं.

पारंपरिक एन एस, दुर्भाग्य से, सपाट और 8,21,22 stacking ऐसे सामान्य एकत्रीकरण, आणविक हदबंदी के रूप में दाग, प्रोटीन बातचीत,, द्वारा प्रेरित कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. लिपिड संबंधित prote के लिएऐसे लिपो प्रोटीन 16,23-30 के रूप में इन,, खड़ी और एक rouleaux में एक साथ (चित्रा 1) 31-36 पैक कर रहे हैं कि कणों में एक आम विरूपण साक्ष्य का परिणाम है. ऐसे nondenaturing polyacrylamide ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में कई लिपोप्रोटीन अध्ययन, क्रायो उन्हें सभी शो लिपोप्रोटीन कण अलग कणों के बजाय प्राकृतिक रूप से खड़ी दिखती हैं मास स्पेक्ट्रोमेट्री 39,41, और छोटे कोण एक्स रे विवर्तन डेटा 42, 13,29,37-40 अध्ययन एक साथ एक rouleaux 21,29,30,35,42-45 बनाने. पारंपरिक एन एस द्वारा rouleaux गठन का अवलोकन संभवतः मानक एन एस प्रोटोकॉल का हल 13,29,30,46-49 और संवेदनशीलता में संरचनात्मक लचीला कर रहे हैं कि apolipoproteins (एपीओ) और फॉस्फोलिपिड से बना लिपो प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत के कारण होता है. इस विरूपण साक्ष्य की पहचान करने के लिए, अपोलीपोप्रोटीन E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) नमूना एक परीक्षण नमूना और cryo- के रूप में इस्तेमाल किया गयास्थितियों की एक श्रृंखला के तहत तैयार एन नमूनों स्क्रीनिंग एक artifact मुक्त मानक 29, के लिए EM छवियों. एन एस और क्रायो ईएम से प्राप्त कण आकार और आकार की तुलना करके, धुंधला अभिकर्मक और नमक एकाग्रता के विशिष्ट प्रकार अच्छी तरह से जाना जाता rouleaux घटना के कारण दो मुख्य मापदंडों होना पाया गया. इस प्रकार, एक अनुकूलित नकारात्मक धुंधला (OpNS) प्रोटोकॉल की सूचना मिली थी.

OpNS करके, apoE4 एचडीएल की अच्छी तरह से जाना जाता rouleaux घटना OpNS (2A चित्रा) से हटा दिया गया. सांख्यिकीय विश्लेषण क्रायो ईएम से उन लोगों की तुलना में OpNS पैदावार आकार और आकार में बहुत इसी तरह की छवियों (कम से कम 5% विचलन) का प्रदर्शन किया, लेकिन इसके विपरीत हटा दिया गया. OpNS का सत्यापन लगभग सभी वर्गों या apoA-मैं 7.8 एनएम (चित्रा 2B), 8.4 एनएम सहित लिपोप्रोटीन नमूने 6,29,30,50,51, के उपवर्गों के rouleaux विरूपण साक्ष्य के उन्मूलन का परीक्षण करके प्रदर्शन किया गया (चित्रा -2) , 9.6 एनएम डीiscoidal एचडीएल (rHDL) (चित्रा 2 डी), 9.3 एनएम गोलाकार rHDL (चित्रा 2 ई), मानव प्लाज्मा एचडीएल (चित्रा 2 एफ), लिपिड मुक्त apoA-मैं (चित्रा 2 जी), प्लाज्मा एचडीएल (चित्रा 2H), कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल का पुनर्गठन ) (चित्रा 2I), मध्यवर्ती घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (आईडीएल) (चित्रा 2J), बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (VLDL) (चित्रा 2K), और POPC liposome (चित्रा 2L) 30. (चित्रा -4 ए और बी) 4,5,29 6,29, और अत्यधिक लचीला 160 केडीए आईजीजी एंटीबॉडी - अतिरिक्त सत्यापन, छोटे और विषम प्रोटीन इमेजिंग 53 केडीए cholesteryl एस्टर हस्तांतरण प्रोटीन (CETP) (सी चित्रा 3 ए) सहित द्वारा प्रदर्शन किया गया , 52, और दो ​​संरचनात्मक अच्छी तरह से जाना जाता प्रोटीन, GroEL और एंटीबॉडी (चित्रा 2M और एन). सी से किसी भी अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता के लिएolleagues, हम इस OpNS विधि पर कोई अंधा परीक्षण के लिए खुले हैं.

OpNS एक उच्च throughput प्रोटोकॉल भी CETP, लिपो प्रोटीन के 4 वर्गों के लिए recombined एचडीएल बातचीत सहित एक श्रृंखला की शर्तों के तहत विभिन्न प्रोटीन (के लिए बाध्य किया गया था कि इस तरह के CETP के रूप में छोटे प्रोटीन के नमूने के सैकड़ों की जांच के माध्यम से प्रोटीन तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में प्लाज्मा एचडीएल, एलडीएल और वीएलडीएल, साथ / 3 मिनट, 20 मिनट, 1 घंटा, 2 घंटा, 4 घंटा, 8 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा और 72 घंटा सहित 9 ऊष्मायन टाइम्स के तहत 2 एंटीबॉडी, H300 और N13,, बिना, सहित 4, और 3 dilutions, यानी, 0.1 मिलीग्राम / एमएल, 0.01 मिलीग्राम / एमएल और 0.001 मिलीग्राम / एमएल, प्लस अतिरिक्त नियंत्रण के नमूने,: 4 के तहत दाढ़ अनुपात, यानी, 1: 0.5, 1: 1: 1, 2, 1 विभिन्न व्यक्तियों द्वारा उपरोक्त प्रयोगों) 6,29 की ट्रिपल परीक्षण के साथ अकेले CETP, अकेले अकेले एलडीएल, और वीएलडीएल,. OpNS CETP की छवियों यथोचित ठीक संरचनात्मक विवरण के साथ उच्च विपरीत छवियों प्रदान की; हमें की अनुमति सफलतापूर्वक 53 केडीए SMA के एक 3 डी घनत्व नक्शा फिर से संगठित करने के लिएडालूँगा प्रोटीन CETP (चित्रा 3 डी - एफ) के एक कण पुनर्निर्माण द्वारा. हमें मध्यवर्ती संकल्प एक भी की (~ 1.5 एनएम) (एक वस्तु, कोई औसत) आईजीजी एंटीबॉडी 3 डी संरचना को प्राप्त करने की अनुमति दी है, जो - इसके अलावा, उच्च विपरीत OpNS छवियों हमें एक व्यक्ति प्रोटीन (सी चित्रा -4 ए) से एक पर्याप्त संकेत प्रदान 5 - व्यक्ति कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (IPET) विधि (जम्मू चित्रा 4E) के माध्यम से. IPET पुनर्निर्माण रणनीति, कार्यप्रणाली, कदम दर कदम प्रक्रिया और संरचनात्मक बदलाव के विश्लेषण का विस्तृत विवरण पहले 4 सूचित किया गया है. यूट्यूब 5 पर अपलोड द्वारा कच्चे छवियों और मध्यवर्ती परिणाम, 3 डी घनत्व नक्शा और संरचनात्मक डॉकिंग सहित IPET एंटीबॉडी पुनर्निर्माण प्रक्रियाओं, के बारे में एक फिल्म की जनता के लिए भी उपलब्ध था. अलग व्यक्ति एंटीबॉडी कणों से 3 डी पुनर्निर्माण की तुलना प्रोटीन गतिशीलता और सी बता सकता हैरासायनिक प्रतिक्रियाओं 4,5 दौरान onformational परिवर्तन.

केडीए 1,2 200, इन छोटे प्रोटीन इमेजिंग में सफलता OpNS विधि छोटे और विषम संरचनात्मक निर्धारण और तंत्र खोजों की ओर पारंपरिक ईएम सीमा पुश करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है कि इसका सबूत - प्रोटीन का 50% से अधिक 40 से लेकर आणविक द्रव्यमान है कि ध्यान में रखते हुए . इस प्रकार, विस्तृत प्रोटोकॉल के रूप में नीचे दी गई है.

Protocol

1% पर ताजा नकारात्मक धुंधला समाधान के 1 तैयारी (डब्ल्यू / वी)

  1. एक अंधेरे कमरे या बॉक्स में पानी विआयनीकृत 100 मिलीलीटर युक्त कांच की बोतल में 1 मिलीग्राम uranyl Formate (यूएफ) पाउडर डाल दिया.
  2. एक अंधेरे कमरे / बॉक्स में आरटी पर समाधान हे / एन हिलाओ. समाधान से टकराने से प्रकाश को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ समाधान बोतल लपेटें.
  3. धीरे के माध्यम से 0.2 माइक्रोन (ताकना आकार) फिल्टर एक 5 मिलीलीटर सिरिंज पर घुड़सवार समाधान फ़िल्टर. फ़िल्टर्ड समाधान कई एल्यूमीनियम पन्नी कवर फाल्कन ट्यूबों में एकत्र किया गया था. फिल्टर सिरिंज भी प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे जाना चाहिए.
  4. 1 मिलीलीटर सिरिंज पर घुड़सवार 0.02 माइक्रोन (ताकना आकार) फिल्टर के माध्यम से फिर से समाधान फ़िल्टर. फ़िल्टर्ड समाधान 2 मिलीलीटर शीशियों में एकत्र और विभाज्य था. सीरिंज और शीशियों का उपयोग करने से पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जा रहा है.
  5. तुरंत एक तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में शीशियों जलमग्न लंबे संभाला संदंश का उपयोग विभाज्य शीशियों रुकबाद समाधान फ़िल्टर किया गया.
  6. भंडारण और भविष्य के उपयोग के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमी शीशियों स्थानांतरण.

नकारात्मक धुंधला कार्य केंद्र और ऊष्मायन कार्य केंद्र की 2. तैयारी

  1. आरटी पर सेट एक नहाने के पानी में 1% UF समाधान की एक शीशी पिघलना. एल्यूमीनियम पन्नी प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए शीशी के चारों ओर लिपटा रहता है कि सुनिश्चित करें.
  2. यह पूरी तरह से 1 मिलीलीटर सिरिंज एक 0.02 माइक्रोन फिल्टर के साथ घुड़सवार लिपटे एक एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके thawed के बाद समाधान फ़िल्टर. शीशी लिपटे एक नए एल्यूमीनियम पन्नी में फ़िल्टर्ड समाधान लीजिए, और उपयोग के लिए इंतज़ार कर रहे एक टोपी कवर बर्फ बॉक्स के अंदर बर्फ पर रखा.
  3. एक खाली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण थाली की सतह पर एक ~ 8 इंच लंबे Parafilm शीट धक्का उंगली से समाधान प्लेटें बनाओ. यह ~ 5 मिमी की एक व्यास के साथ परिपत्र प्लेटों की पंक्तियों उत्पन्न होगा. एक बर्फ के अंदर चपटे बर्फ की सतह पर Parafilm प्लेटों को शामिल प्रत्येक पंक्ति में जगह 6 प्लेटें बनाओएर ढक्कन, एक धुंधला कार्य केंद्र के रूप में.
  4. पिपेट ~ 35 μl प्रत्येक पंक्ति में छोड़ दिया तीन प्लेटों में से प्रत्येक पर पानी विआयनीकृत, और पिपेट ~ 35 μl प्रत्येक पंक्ति में सही तीन प्लेटों पर UF समाधान फ़िल्टर्ड. प्रोटीन धुंधला से पहले प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए एक ढक्कन के साथ धुंधला वर्कस्टेशन कवर.
  5. बर्फ के साथ एक खाली बॉक्स आधे रास्ते भर कर एक EM ग्रिड ऊष्मायन स्टेशन तैयार, और एक सहायक आधार पर रखा जा सकता है कि एक हैंगर के बगल में पालन किया. चिमटी 'टिप्स पास बर्फ सतह जिसमें हैंगर में नमूना चिमटी, रखें. आधा बॉक्स होंठ ऊंचाई से चिमटी 'सुझावों को कवर किया. एक ऊष्मायन स्टेशन बनाने के लिए एक आदर्श आइस बॉक्स एक खाली pipet सुझावों कंटेनर उपयोग कर रहा है.

3 OpNS ऑपरेशन

  1. पतली कार्बन फिल्म 10 सेकंड के लिए 300 जाल तांबा EM ग्रिड लेपित ग्लो निर्वहन.
  2. चिमटी के साथ एक ग्रिड उठाओ और बर्फ के ऊपर एक 45 डिग्री झुकाव और 1 इंच में ग्रिड रखने के द्वारा हैंगर में चिमटी हुकऊष्मायन स्टेशन के अंदर सतह.
  3. ~ की अंतिम प्रोटीन एकाग्रता में 0.01 ~ 0.005 मिलीग्राम / मिलीलीटर Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (DBPS) के साथ प्रोटीन नमूना पतला. जमा ~ 4 μl तुरंत ईएम ग्रिड के कार्बन पक्ष पर कमजोर पड़ने के बाद नमूना पतला. (प्रोटीन DPBS के प्रति संवेदनशील है यदि DPBS एक और बफर को बदला जा सकता है)
  4. ऊष्मायन स्टेशन के अंदर ~ 1 मिनट के लिए EM ग्रिड पर नमूना सेते हैं.
  5. जल्दी से फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड बढ़त छू के माध्यम से अतिरिक्त समाधान निकालें.
  6. अतिरिक्त समाधान ईएम ग्रिड पर हटा दिया गया था के बाद सही Parafilm चादर के ऊपर शुद्ध पानी सतह की पहली बूंद (~ 35 μl) को जल्दी से ग्रिड को स्पर्श करें. और फिर फिल्टर पेपर के साथ तुरंत अतिरिक्त पानी निकाल दें.
  7. Parafilm पर शेष दो पानी की बूंदों पर उन्हें ग्रिड धोने से एक और दो बार के लिए दोहराएँ कदम 3.6 (3.6 कदम और नमूना पानी के प्रति बहुत संवेदनशील है यदि 3.7 छोड़ी जा सकती हैं).
  8. ईएम GRI फ्लोटतुरंत ईएम ग्रिड पर अतिरिक्त पानी के बाद UF समाधान सही की पहली बूंद की सतह पर हटा दिया गया था चाहते हैं. और फिर 10 मिनट के लिए सेते हैं. UF समाधान की सतह पर ग्रिड चल पहले 3 सेकंड के भीतर पानी धोने प्रक्रियाओं को समाप्त करने के लिए सुनिश्चित करें. वाशिंग समय कम, बेहतर गुणवत्ता होगा.
  9. 3 बार - ~ 2 के लिए एक फिल्टर पेपर में सुझावों मर्मज्ञ द्वारा चिमटी साफ करें.
  10. फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड किनारे से संपर्क के माध्यम से ग्रिड पर अतिरिक्त समाधान निकालें, और फिर UF के दूसरे छोड़ पर ग्रिड तैरने लगते हैं.
  11. दूसरी छोटी बूंद पर कदम 3.10 ऊपर जारी रखें.
  12. UF समाधान की तीसरी छोटी बूंद पर ग्रिड फ्लोट और ~ 1 मिनट के लिए धुंधला स्टेशन को कवर किया.
  13. वैकल्पिक कदम: 3.6 में वर्णित के रूप में पानी की एक चोटी पर जल्दी ग्रिड धो लो. इस अतिरिक्त कदम लोड मुक्त सोने के कणों या दाग पृष्ठभूमि पर युक्त नमूनों को फायदा होगा.
  14. वें फिल्टर पेपर छूकर अतिरिक्त समाधान निकालें(कार्बन पक्ष विपरीत) ई पूरे ग्रिड पीठ. सही फिल्टर पेपर को अवशोषित समाधान देख के बाद आरटी पर नाइट्रोजन गैस की एक सौम्य धारा के तहत ग्रिड सूखी.
  15. एक पेट्री डिश के अंदर फिल्टर पेपर की एक शीट पर ग्रिड, जगह और आरटी के तहत कम से कम 30 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए एक टोपी के साथ आंशिक रूप से डिश को कवर किया. कुछ नमूने लिए, एक घंटा के लिए पाक के एक 40 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ग्रिड जगह है.
  16. परीक्षण कर भविष्य ईएम के लिए एक EM ग्रिड बॉक्स में ग्रिड स्टोर.

जांच 4 ईएम

  1. ठीक से ग्रिड पर छोटे प्रोटीन के ईएम परीक्षा से पहले मंदिर संरेखित करें.
    1. मंदिर ठीक से गठबंधन किया गया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक अनाकार कार्बन फिल्म की सत्ता स्पेक्ट्रम है कि उच्चतम दिखाई Thon अंगूठी के संकल्प की जाँच करें. मंदिर में कई अलग अलग उपयोगकर्ताओं द्वारा साझा किया जाता है, मंदिर अक्सर ठीक से गठबंधन नहीं था.
    2. ध्यान संरेखण conditio समायोजित करने के लिए नमूना की कार्बन फिल्म क्षेत्र पर सत्ता स्पेक्ट्रम की जांचमशीन के एन. उच्चतम दिखाई Thon छल्ले लक्षित संकल्प से बेहतर हैं.
      नोट: 120 केवी उच्च तनाव के तहत संचालित एक LaB6 रेशा मंदिर का एक उचित संरेखण के एक उदाहरण के रूप में, 20 से अधिक Thon छल्ले, देखे जा सकते हैं, जिसमें इसी संकल्प 5.0 एक से बेहतर हो सकता है. इस Thon अंगूठी 1.6 माइक्रोन ~ की एक defocus और 20.4 ई / ए 2 (चित्रा 5) की एक खुराक के तहत imaged एक अनाकार कार्बन फिल्म के फूरियर स्थानांतरण द्वारा हासिल की थी.
      नोट: उच्च संकल्प Thon अंगूठी का अवलोकन एक आवश्यक शर्त है, लेकिन नहीं उचित संरेखण के लिए एक पर्याप्त शर्त है. वास्तव में उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए, कई अन्य मानकों ऐसे नमूने गुणवत्ता, विकिरण क्षति, चार्ज और बहती है और साथ ही रोशनी खुराक दर के रूप में, यह भी महत्वपूर्ण हैं.
  2. एक आदर्श दाग क्षेत्र पर छोटे प्रोटीन इमेजिंग के लिए लगभग SCHERZER ध्यान केंद्रित करने के लिए वापस defocus लाओ.
  3. Imag के लिए "बादल छाए रहेंगे" क्षेत्र के लिए खोजई. एक आदर्श दाग क्षेत्र आमतौर पर दाग की मोटाई सामान्य रूप से समान रूप से कार्बन लेपित ग्रिड (चित्रा 6) पर वितरित नहीं है क्योंकि ग्रिड पर एक "बादल छाए रहेंगे" क्षेत्र की तरह दिखता है जो एक मोटा दाग क्षेत्र के किनारे के पास स्थित है. आम तौर पर एक कम बढ़ाई (<100x) पहली इमेजिंग के लिए में जूम करने से पहले इन बादलमय क्षेत्रों को खोजने के लिए मदद करने के लिए था.

Representative Results

OpNS का कार्यान्वयन जैसे विभिन्न लिपोप्रोटीन प्रजातियों की संरचनात्मक और रूपात्मक परीक्षाओं में शामिल हैं: नवजात पुनः संयोजक एचडीएल (rHDL), गोलाकार पुनः संयोजक एचडीएल, प्लाज्मा एचडीएल, एलडीएल, आईडीएल और वीएलडीएल (चित्रा 2) 30; इस तरह के 53 केडीए CETP (सफलतापूर्वक ईएम के माध्यम से imaged सबसे छोटे प्रोटीन के बीच) (चित्रा 3) 6 और 160kDa आईजीजी के रूप में अच्छी तरह से छोटे प्रोटीन (सबसे गतिशील और विषम प्रोटीन में से एक) (चित्रा 4) 4,5,29,52 , यहां तक कि 28 केडीए लिपिड मुक्त अपोलीपोप्रोटीन ए -1 (चित्रा 2L), और GroEL और Proteasomes (चित्रा 2M और एन).

एक उच्च throughput विधि के रूप में OpNS के अन्य उदाहरण इस तरह के 53 केडीए CETP के रूप में प्रोटीन तंत्र को उजागर करने के लिए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच कर रहे हैं. Investiga शुरूआत में वर्णित है, कैसे CETP लिपो प्रोटीन के विभिन्न उपवर्गों के साथ सूचना का आदान प्रदान कर रहे थेटेड जहाँ तक हम जानते हैं कि 400 से अधिक ईएम नमूनों 6 की जांच के माध्यम से, स्क्रीनिंग लगभग एक सौ अलग अलग परिस्थितियों शामिल है कि क्रायो ईएम अध्ययन की कोई ऐसी स्थिति नहीं थी.

OpNS छोटे और विषम प्रोटीन 3 डी संरचना का अध्ययन करने और यहां तक ​​कि 3 डी संरचना (औसत) के बिना एक एकल और व्यक्तिगत प्रोटीन फार्म प्राप्त करने के लिए विस्तार के लिए उन्हें सीमाओं का विस्तार कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, आईजीजी एंटीबॉडी मध्यवर्ती संकल्प पर 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त किया जा करने के लिए चुनौती दे रहा है, जिसमें एक बेहद लचीली संरचना, साथ 160 केडीए अणु है. OpNS विधि झुकाव कोण (चित्रा 4E और एच) की एक श्रृंखला से छवि के लिए एक व्यक्ति आईजीजी एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था. 4,5 - व्यक्तिगत कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (IPET) (जे चित्रा 4E) द्वारा एक भी प्रोटीन की सफल पुनर्निर्माण के लिए अनुमति दी OpNS से यथोचित उच्च संकल्प और उच्च विपरीत प्रोटीन छवियों. IPET 3 डी पुनर्निर्माण में (चित्रा 4F और जी) में एक 3 डी घनत्व को प्राप्त करने के बाद चलने का पुनर्निर्माण के माध्यम से उनकी गणना की वैश्विक केंद्र के लिए गठबंधन किया गया 4. एक ही दृष्टिकोण से, एक भी एंटीबॉडी पेप्टाइड परिसर को खंगाला गया था, और पेप्टाइड (, संकल्प ~ 16.6 एक आंकड़ा 4I और जे) 4,5 की खोज की थी एक भी एंटीबॉडी कण की आंतरिक डोमेन गठनात्मक परिवर्तन प्रेरित किया. अलग व्यक्तिगत कणों से 3 डी पुनर्निर्माण तुलना, संरचनात्मक विश्लेषण एक रासायनिक प्रतिक्रिया 4,5,29,53,54 के मध्यवर्ती चरणों "शॉट तस्वीर" भी हमें प्रोटीन thermodynamic उतार चढ़ाव प्रकट करने के लिए अनुमति देते हैं, और हो सकता है.

संक्षेप में, 40 केडीए के बीच आणविक जन के साथ प्रोटीन - 200 केडीए मानक ईएम संरचनात्मक परीक्षाओं और पुनर्निर्माण के लिए चुनौती दे रहे हैं. ध्यान में रखते हुए कि 50% से अधिकप्रोटीन 40 से लेकर आणविक द्रव्यमान की - केडीए 1,2 200, हम छोटे और विषम संरचनात्मक निर्धारण और भी यंत्रवत अध्ययनों की ओर पारंपरिक ईएम सीमा पुश करने के लिए एक मजबूत और उच्च throughput उपकरण के रूप में एक OpNS विधि की रिपोर्ट.

चित्रा 1
पारंपरिक नकारात्मक धुंधला (एन) EM द्वारा लिपो प्रोटीन की 1 Rouleau विरूपण साक्ष्य चित्रा. (पैनल के नीचे) इलेक्ट्रॉन (पैनल से ऊपर) micrographs और चयनित कण मानक मिश्रण प्रक्रिया के तहत phosphotungstic एसिड (पीटीए) के साथ एन एस के बाद rouleaux साथ विभिन्न लिपो प्रोटीन दिखा. ApoE4 साथ (ए) का पुनर्गठन एचडीएल (rHDL), (ख) apoA-मैं युक्त 9.6 एनएम चक्रिकाभ rHDL, (सी) प्लाज्मा एलडीएल, (डी) गैर अपोलीपोप्रोटीन युक्त POPC liposomes युक्त ApoB. बार्स: 50 एनएम. खिड़की का आकार: ए और सी, 20 Nएम; बी, 30 एनएम. लिपिड रिसर्च जर्नल शुरू में इस काम 29,30 प्रकाशित. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
. (OpNS) ईएम इलेक्ट्रॉन micrographs OpNS द्वारा rouleaux विरूपण साक्ष्य के बिना विभिन्न लिपो प्रोटीन और liposomes दिखाने अनुकूलित नकारात्मक धुंधला द्वारा चित्रा 2 प्रोटीन संरचना (ए) rHDL apoE4 युक्त;. (बी) 7.8 एनएम rHDL, (ग) 8.4 एनएम rHDL, ( डी) 9.6 एनएम rHDL, (ई) 9.3 एनएम गोलाकार rHDL, (एफ) मानव प्लाज्मा α एचडीएल, (जी) प्लाज्मा एचडीएल (एच) मानव प्लाज्मा एलडीएल, (मैं) मानव प्लाज्मा आईडीएल, (जे) मानव प्लाज्मा वीएलडीएल; (एल) लिपिड मुक्त apoA-मैं. अतिरिक्त सत्यापन (एम) GroEL और (एन) एंटीबॉडी नमूने का उपयोग किया गया था. Micrographs (ऊपर पैनल) और (पैनल) से नीचे चयनित कणों. बार्स: 50 एनएम. विंडो आकार: एक - डी, 20 एनएम; ई और एफ, 25 एनएम; जी, 20 एनएम; एच, 25 एनएम; मैं 50 एनएम; जम्मू और कश्मीर, 100 एनएम; एल, 80 एनएम., लिपिड मुक्त apoA-मैं, GroEL और एंटीबॉडी के अलावा, इस शोध मूल लिपिड रिसर्च 29,30 के जर्नल में प्रकाशित किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा CETP की 3 OpNS इलेक्ट्रॉन micrographs. (ए) CETP (धराशायी हलकों) के साथ अवलोकन माइक्रोग्राफ केले के आकार के कणों. (बी) Windoweकच्चे कणों का चयन घ. (सी) तीन एकल कच्चे CETP कण छवियों स्पष्ट रूप से अन्य छोटे, हल्के और संकरा टिप (बाएं पैनल) सहित एक बड़ा, भारी और बड़ा गोलाकार टिप दिखा, उच्च विचार कम समग्र वक्रता के साथ भी इसी तरह का टर्मिनल क्षेत्रों दिखा (मध्य CETP (सही पैनल) की लंबी अक्ष नीचे पैनल), और अंत दृश्य (डी) क्रिस्टल संरचना (PDB सुपरइंपोज़:. इन कच्चे CETP कण छवियों पर 2OBD), हो सकता है अभिविन्यास दिखा दोनों संरचनात्मक आकार और डोमेन आकार में अच्छी तरह से मेल खाता है लगभग सीधे भी कंप्यूटर ((सी) के लिए पैनल इसी) द्वारा सहायता के बिना परिभाषित किया. (ई), इन बेतरतीब ढंग से उन्मुख कणों की समानता (पार से संबंध गणना) की गणना करने के लिए स्वतंत्र 2D वर्ग के औसत (एक आदितः प्रक्रिया संदर्भ होने कणों एक दूसरे के लिए उच्च समानता, समूहबद्ध गठबंधन और फिर पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए औसत और कण छवि चोर बढ़ाया गयाTRAST. संदर्भ मुक्त 2 डी वर्ग के औसत, जिसमें कोई किसी भी मानव बनाया प्रारंभिक मॉडल इस वर्ग के औसत में शामिल किया गया था, EMAN पैकेज में refine2D.py सॉफ्टवेयर से गणना कर रहे हैं. संदर्भ वर्ग मूविंग) एकल कण पुनर्निर्माण से 3 डी पुनर्निर्माण को मान्य करने के लिए एक स्वतंत्र विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. (एफ) चयनित संदर्भ मुक्त 2D वर्ग मूविंग अन्य की तुलना में एक बड़ा बाहर का अंत दिखा. (जी) आरोपित क्रिस्टल संरचना (PDB :, ओवरले छवियों संरचना आकार और डोमेन आकार (कम पैनल) दोनों में क्रिस्टल संरचना और संदर्भ से मुक्त वर्ग औसत के बीच एक के पास सही मैचों संदर्भ मुक्त औसत की 2OBD) तुलना दिखाने (एफ) एक पर CETP की 3 डी घनत्व नक्शा. 13 ए का संकल्प OpNS और एकल कण पुनर्निर्माण विधि (शीर्ष पैनल) और क्रिस्टल संरचना (कम पैनल) द्वारा इस एकल कण पुनर्निर्माण में डॉक चोटी वाला शरीर ने उतारी 8879 कणों से खंगाला गया था. Detछवि preprocessing, प्रारंभिक मॉडल, शोधन प्रक्रियाओं, कोण वितरण और फूरियर शैल सहसंबंध (एफएससी) सहित एकल कण पुनर्निर्माण के ailed जानकारी, विधि अनुभाग में प्रकाशित किया गया और मूल कागज के समर्थन जानकारी (एच) एक कण पुनर्निर्माण की अंतिम तुलना ( पैनल) और अतिरिक्त PDB फिट तुलना (नीचे पैनल) ऊपर 6. बार्स: एक, 50 एनएम; बी - डी, 10 एनएम; एफ, 3 एनएम. इन आंकड़ों के कुछ पहले प्रकृति रासायनिक जीवविज्ञान 6 में प्रकाशित किए गए थे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4 OpNS छवियों और मानव आईजीजी 1 एंटीबॉडी कणों के पुनर्निर्माण. (ए) से अधिकमानव IgG1 एंटीबॉडी OpNS छवियों को देखते हुए. सफेद हलकों में दिखाया कण स्पष्ट रूप से 3 उप डोमेन के साथ कणों प्रदर्शित करते हैं. (बी) मैन्युअल स्पर्श किसी भी बिना (कच्चे कण धार आसपास के शोर को कम करने से पांच व्यक्ति विसंयुग्मित एंटीबॉडी कणों और (सी) उनके इसी शोर कम छवियों के उच्च संकल्प कच्चे छवियों चयनित आसानी से कल्पना करने के कणों के अंदर घनत्व). (डी) इसी प्रकार ईएम छवियों को देखने के लिए एक के लिए उन्मुख किया गया था कि IgG1 एंटीबॉडी की क्रिस्टल संरचना (PDB प्रविष्टि 1IGT). इसी छवियों की तुलना ईएम छवि और डोमेन पदों और आकार सहित क्रिस्टल संरचना, के बीच कई आम सुविधाओं से पता चलता है. (ई) एक उदाहरण IgG1 एंटीबॉडी से एक आदितः 3D पुनर्निर्माण की सौतेली लिए कदम प्रक्रिया (कोई औसत, एक व्यक्ति वस्तु) व्यक्तिगत कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (IPET) विधि का उपयोग. (एफ) के एक एसआई की अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण14.1 ए के प्रस्ताव पर ngle एंटीबॉडी कण तीन डोनट के आकार का डोमेन एक "वाई" आकार में बनाने दिखाया. (जी) डोमेन घनत्व क्रमश नक्शे, इसी और मैन्युअल डोमेन के बीच छोरों दोहरा से प्रत्येक में डोमेन क्रिस्टल संरचनाओं डॉकिंग. (एच) IPET से एक भी आईजीजी पेप्टाइड परिसर (कोई औसत, एक व्यक्ति वस्तु) की 3 डी पुनर्निर्माण की सौतेली लिए कदम प्रक्रिया. (मैं) एक आईजीजी पेप्टाइड परिसर के अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण 16.6 ए के प्रस्ताव पर प्रदर्शित किया गया था तीन रॉड से पता चला एक "वाई" आकार में बनाने के आकार का डोमेन (जम्मू) क्रमश: प्रत्येक आईजीजी एंटीबॉडी डोमेन के क्रिस्टल संरचना (PDB प्रविष्टि: 1IGT) डॉकिंग. प्रत्येक रॉड आकार घनत्व में एक खराब एक आंतरिक डोमेन गठनात्मक परिवर्तन का सुझाव, डोमेन क्रिस्टल संरचनाओं के साथ मिलान से पता चला पेप्टाइड संयुग्मन के बाद. विस्तृत प्रक्रिया, संकल्प विश्लेषण और आंकड़े मूल पत्र में वर्णित किया गया 4 में प्रकाशित और वैज्ञानिक 5 रिपोर्टें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
अनाकार कार्बन फिल्म की चित्रा 5 पावर स्पेक्ट्रम एक Zeiss तुला 120 LaB6 मंदिर से 1.6 माइक्रोन defocus तहत imaged. उच्च संकल्प इमेजिंग ईएम उचित संरेखण और उच्च संकल्प क्षमता है कि दिखाने के लिए पर्याप्त सबूत की आवश्यकता है. ग्रिड पर पास में कार्बन क्षेत्र की बिजली स्पेक्ट्रम के विश्लेषण के पूर्व डाटा अधिग्रहण करने के लिए बीम जुटना हालत की जांच करने के लिए एक कारगर तरीका है. एक अनाकार कार्बन क्षेत्र की छवि के फूरियर हस्तांतरण (सी साधन संबंधित विपरीत हस्तांतरण समारोह दिखाने TF), तो Thon छल्ले कहा जाता है. एक उचित संरेखण और जुटना दिखाई Thon छल्ले की संख्या और एक अपेक्षाकृत उच्च defocus शर्त के तहत दिखाई Thon छल्ले के उच्चतम संकल्प से परिलक्षित किया जा सकता है. / A 2 - एक लैब 6 रेशा सुसज्जित मंदिर के पास उचित संरेखण हालत का एक उदाहरण के रूप में, 20 Thon छल्ले (~ 5 क) कार्बन फिल्म से उत्पन्न किया जा सकता ~ से अधिक 20.4 ई खुराक का उपयोग करते हुए 1.6 माइक्रोन defocus पर imaged हैं. एक कम अंत मंदिर से हासिल Thon छल्ले ऐसे एक उचित संरेखण शर्त के तहत संचालित एक क्षेत्र उत्सर्जन गन (FEG) बढ़ाया मंदिर के रूप में उच्च अंत मंदिर, से उस के लिए एक समान है. शुरू में वैज्ञानिक में प्रकाशित इस काम 5 रिपोर्टें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा OpNS इमेजिंग के लिए 'आदर्श' क्षेत्रों की 6 उदाहरण micrographs. तीन प्रोटीन के नमूने, (ए) GroEL (बी) एंटीबॉडी (सी) गोलाकार एचडीएल, इमेजिंग के लिए आदर्श OpNS प्रदर्शित करने के लिए उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया. दाग असमान नमूना में वितरित कर रहे हैं, नमूना के कम बढ़ाई आमतौर पर "बादल छाए रहेंगे" (बाएँ तरफ के पैनल) प्रकट होता है. इमेजिंग के लिए आदर्श क्षेत्रों में सामान्य रूप से इन "बादल" की सीमाओं में स्थित हैं. का एक उदाहरण कदम दर कदम ज़ूम में एक "बादल छाए रहेंगे" दाग क्षेत्र (बाएं मध्यम पैनल) कणों की उच्च संकल्प और उच्च विपरीत छवियों (सही मध्यम पैनल) के साथ पेश उच्च बढ़ाई छवियों को दिखाने के. कणों के चयनित छवियों प्रोटीन की संरचना विवरण (दायीं पैनल) दिखा. बार्स:. 30nm एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के आर संस्करण.

चित्रा 7
7 चित्रा OpNS प्रक्रियाओं का एक योजनाबद्ध आरेख. (ए) ईएम ग्रिड ऊष्मायन स्टेशन, चमक छुट्टी ग्रिड पर नमूना समाधान सेते सरल स्टेशन. प्रकाश में दाग जोखिम को कम करते हुए, एक बर्फ बिस्तर के ऊपर पानी धोने बूंदों, और दाग बूंदों को बनाए रखने के लिए बनाया गया (बी) धुंधला कार्य केंद्र,. (सी) धुंधला प्रक्रिया का अवलोकन, illustrating: सोख्ता दिशा, 3x पानी rinsing, 3x UF दाग प्रदर्शन, दाग बूंदों पर औंधा नमूना ग्रिड के साथ धुंधला ऊष्मायन, और अंतिम पीठ नमूना द्वारा पूर्व सुखाने के लिए नमूना दाग समाधान की एक पतली परत सुनिश्चित करने के लिए सोख्ता नाइट्रोजन हवा. वीं का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है.

चित्रा 8
8 चित्रा उच्च - 53kDa छोटे प्रोटीन CETP का संकल्प छवियों को एक संशोधित OpNS विधि, क्रायो सकारात्मक धुंधला (क्रायो पी एस) से पता चला पांच उच्च संकल्प और गोल आकार (रिवर्स विपरीत के साथ) CETP कणों की मुलायम नकाबपोश कच्चे छवियों का चयन करें. और कण आकार आसानी से कल्पना करने के लिए (, लेकिन कणों के भीतर किसी भी घनत्व को संशोधित करने के बिना कच्चे कण छवियों 'किनारों के आसपास के मैन्युअल कम शोर) कच्चे कणों नकाबपोश. सभी परमाणु और रिबन क्रिस्टल संरचना तुलना ईएम छवियों प्रत्येक कण के समान झुकाव के लिए गठबंधन कच्चे कणों नकाबपोश लिए. नहीं सभी क्रिस्टल संरचना सुविधाओं कच्चे डेटा से हल किया जा सकता है, जबकि कच्चे छवि क्षेत्रों के उच्च संकल्प विवरण, क्रिस्टल संरचना के साथ कुछ समानता प्रदर्शित करते हैं. Remarka Bly, इन कच्चे छवियों दोनों टर्मिनल में समानता मैन्युअल कम शोर छवियों (त्रिकोण) में देखा पास के छोटे परिपत्र छेद होने समाप्त होता दिखा, इसके अलावा, कण छवियों के भीतर सी टर्मिनल क्षेत्रों में किस्में क्रिस्टल संरचना पूरक β-शीट (तीर) और अंत में, CETP सी टर्मिनल क्षेत्र पर फैला हुआ छोरों क्रिस्टल संरचना (हीरे) में करने के लिए समान हैं. (ए) पांच का चयन (रिवर्स विपरीत के साथ) CETP कणों की उच्च संकल्प और गोल आकार मुलायम नकाबपोश कच्चे छवियों. (बी) 10A को छानने के कम से गुजारें. (सी) 20A को छानने हायर कम से गुजारें. (डी) मैन्युअल शोर कम छवियों नकाबपोश. (ई) रिबन संरचना से क्रिस्टल संरचना तुलना. सभी परमाणु प्रतिनिधित्व द्वारा (एफ) क्रिस्टल संरचना तुलना. बार: 5nm. इस काम के हिस्से प्रकृति रासायनिक जीवविज्ञान 6 में प्रकाशित किया गया था.दुबला "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा
9 चित्रा लवणता भिन्न तहत पारंपरिक एन एस प्रोटोकॉल (पीटीए दाग) द्वारा rouleau गठन दिखा liposomes की इलेक्ट्रॉन micrographs. (ए) उच्च लवणता (~ 0.5 MNaCl). (बी) नियमित लवणता (~ 0.25 एम NaCl). (सी) कम लवणता (~ 0.1 एम NaCl). (डी) शुद्ध पानी. Micrographs (पैनल से ऊपर) और दिखाया (पैनल के नीचे) का चयन विंडोड कणों. बार्स: 100 एनएम. खिड़की का आकार: 80 एनएम. लिपिड रिसर्च जर्नल मूल रूप से इस काम में 30 प्रकाशित किया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

पारंपरिक एन एस तकनीक की तुलना में, OpNS rouleaux कलाकृतियों (चित्रा 1 और 9), विश्वसनीय और उचित उच्च संकल्प (~ 1nm) छोटे प्रोटीन की संरचनात्मक जानकारी प्रदान (चित्रा 2) को रोका जा सकता. क्रायो ईएम की तुलना में, OpNS एक उच्च throughput तरीका प्रदान करता है और प्रोटीन और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 6 की एक विस्तृत विविधता की जांच कर सकते हैं. हालांकि, OpNS अभी भी अपने नुकसान की है. पारंपरिक एन एस की तुलना में, OpNS जरूरत पर जोर देता: नमूना तैयार करने में मैं) अधिक जटिल कदम; द्वितीय) एक रेडियोधर्मी पदार्थ, UF का उपयोग; iii) की वजह से है क्योंकि इसके प्रकाश संवेदनशीलता के UF दाग की कम शक्ति के लिए ताजा दाग रखने; चतुर्थ) वर्षा UF समाधान -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत और उपयोग करने से पहले विगलन आवश्यकता जाना चाहिए को रोकने के लिए; वी) और अंत में सभी UF खतरनाक अपशिष्ट के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए. क्रायो ईएम की तुलना में, OpNS अपेक्षाकृत कम संकल्प छवियों और किसी भी अभी तक नहीं की खोज विरूपण साक्ष्य के लिए कोई गारंटी नहीं प्रदान करता हैभविष्य में.

लिपोप्रोटीन rouleaux गठन पर एन एस आपरेशन प्रक्रियात्मक प्रभाव

ड्रॉप द्वारा ड्रॉप 16, और वाशिंग प्रक्रियाओं 29, 55 मिश्रण: परीक्षा 16,29-36,55 के लिए प्रोटीन की तैयारी के लिए एन एस प्रोटोकॉल तरीकों 50 की तीन प्रमुख समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है. मैं) मिश्रण प्रोटोकॉल एक विशिष्ट अनुपात में दाग और प्रोटीन नमूना की प्रारंभिक मिश्रण की आवश्यकता है, और फिर अंत में ईएम परीक्षा 55 के लिए हवा सुखाने से पहले फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त समाधान को हटाने, एक ग्रिड पर लेपित कार्बन फिल्म पर मिश्रित समाधान को लागू करने. द्वितीय) ड्रॉप द्वारा ड्रॉप प्रोटोकॉल बाद में दाग की एक बूंद (~ 4 μl) के आवेदन से पहले अतिरिक्त नमूना समाधान को हटाने, ~ 1 मिनट के लिए कार्बन दे बैठने में लेपित एक EM ग्रिड से सीधे (~ 4 μl) नमूना बूंद लागू करना शामिल ग्रिड के एक ही पक्ष पर समाधान. ऊष्मायन के ~ 1 मिनट के बाद, Exces हटानेसाफ फिल्टर पेपर के साथ संपर्क के माध्यम से दाग, अंत में हवा सुखाने 16,56-58 के लिए प्रस्तुत करने. iii) धोने प्रोटोकॉल (चित्रा 7) तो सही फिल्टर पेपर 3,29,30 से अतिरिक्त समाधान हर बार हटाने के बाद विआयनीकृत पानी के साथ तीन बार धोने, 1 मिनट के लिए कार्बन में लेपित एक EM ग्रिड के लिए नमूना समाधान आवेदन की आवश्यकता होती है. OpNS प्रोटोकॉल इस धोने की प्रक्रिया से संशोधित किया गया था.

एन एस दाग प्रकार और लिपोप्रोटीन rouleaux गठन पर प्रभाव

एन एस में, भारी धातु दाग को मजबूत इलेक्ट्रॉन बिखरने प्रोटीन 17-20,59 से विपरीत प्रदान करते हैं. एन एस नमूने इसके अलावा अधिक से अधिक विकिरण खुराक ग्रस्त हैं, और एक तेज नकारात्मक विपरीत 8,9,60 द्वारा प्रोटीन सुविधाओं में वृद्धि कर सकते हैं. भारी धातुओं के धब्बे के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है: phosphotungstic एसिड (पीटीए) 16 सहित, anionic, methylamine Tungstate 14 और सिलिकॉन Tungstate 61; और कटियनऐसे uranyl एसीटेट (यूए) 62, UF 3,29,30, और uranyl नाइट्रेट (यूएन) 63 के रूप में आईसी,. सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है कि anionic एन एस दाग की एक पीटीए 33,64-67 है. 7.5 - पीटीए आम तौर पर एक पीएच 7.0 के आसपास है, जो कि heteropoly एसिड, है. पीटीए भी सकारात्मक धुंधला 3,16,68 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीटीए की नकारात्मक आरोप दोनों लिपोप्रोटीन और liposome सतहों पर सकारात्मक POPC तरह, सिर समूहों का आरोप लगाया असंतृप्त लिपिड, साथ electrostatic बातचीत में मध्यस्थता कर सकते हैं. पीटीए भी नियमित बफर लवणता 29,30 (चित्रा 1) के तहत इस बातचीत 29,30 के माध्यम से rouleaux गठन के कारण हो सकता है. ऐसे यूए, UF और संयुक्त राष्ट्र के रूप में uranyl दाग, विशेष रूप से अक्सर जैविक नमूनों 62,69,70 की एक किस्म की एन एस के लिए इस्तेमाल किया जाता है cationic भारी धातुओं के दाग और UA के लिए वैकल्पिक विकल्प हैं. प्रयोगों UF ऐसे POPC के रूप में असंतृप्त वसा अम्ल लिपिड होते कि लिपो प्रोटीन का कोई rouleaux का कारण बनता पाया. हालांकि, UF अभी roule उत्पन्न हो सकता हैऐसे dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) और 1 hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC) के रूप में संतृप्त फैटी एसिड लिपिड होते कि लिपोप्रोटीन पर औक्स गठन. इस बातचीत का विस्तृत तंत्र अज्ञात है. यूए / UF / संयुक्त राष्ट्र कम पीएच मान पर सभी काम 3.5-4.6 लेकर कर सकते हैं. इस तरह कम पीएच मान पीएच 14,71 के प्रति संवेदनशील हैं कि कुछ जैविक अणुओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. दिलचस्प है, यूए / UF एक अज्ञात तंत्र 72 के माध्यम से कुछ मिसे के भीतर प्रोटीन संरचना को ठीक कर सकते हैं. पीटीए के विपरीत, यूए / UF एक एसिड से एक नमक के समान है.

(: 0.3 एनएम, संयुक्त राष्ट्र: ~ 0.5 एनएम UF) 3,74 UF कथित जिसमें, UF और संयुक्त राष्ट्र दाग यूए की तुलना में छोटे अनाज के आकार के है, यूए 73 की तुलना में बेहतर परिणाम दे सकता है. UF पालन करके नकारात्मक दाग अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया था जब एक दिलचस्प उदाहरण, एक छोटे प्रोटीन (53 केडीए CETP) के माध्यमिक संरचना की तरह विवरण सीधे कच्चे micrographs से देखे जा सकते हैंपहले क्रायो सकारात्मक धुंधला (क्रायो पी एस) विधि (चित्रा 8) 6 की सूचना दी. क्रायो में PS, दाग नमूना माध्यमिक संरचनात्मक पतन का कारण हो सकता है जो OpNS प्रोटोकॉल में क्रायो ईएम नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के बजाय सुखाने प्रक्रिया का पालन करते हुए जमे हुए फ्लैश था. क्रायो पुनश्च छोटे प्रोटीन 75 के उच्च विपरीत और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक विधि है. क्रायो पुनश्च छवियों सूचना दी क्रायो एन एस प्रोटोकॉल 22 से उन लोगों की तुलना में इसके विपरीत उलट, लेकिन पारंपरिक क्रायो EM छवियों से उन लोगों के लिए सुसंगत छवि के विपरीत है है, इस प्रकार यह क्रायो पुनश्च विधि नामित किया गया था. क्रायो पुनश्च छवियों धुंधला अभिकर्मक, uranyl formate, धुंधला केवल बाहरी सतह की संरचना की कल्पना कर सकते हैं कि पारंपरिक देखने को चुनौती देने, आणविक सतह कि प्रवेश दिखा. uranyl formate आणविक सतह प्रवेश कैसे की व्यवस्था अज्ञात है. एक संभावना यह uranyl कटियन उपलब्ध प्रोटीन carboxyl समूहों बांधता है, और इस प्रकार हैकांच का बर्फ आसपास के जिससे एक सकारात्मक दाग के रूप में अभिनय, प्रोटीन और uranyl समूहों का धुंधला की तुलना में कम घनत्व की है. क्रायो पुनश्च विधि एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी 76-78 में चरण समस्या को हल करने के लिए एक साझा दृष्टिकोण था जो कई ्र प्रतिस्थापन (मीर) विधि के समान है. मीर में, क्रिस्टल नमूने अपने मूल रूप को एक isomorphic फार्म प्राप्त करने के लिए, यूरेनियम सहित एक भारी परमाणु समाधान, साथ भिगो कर रहे हैं. भारी परमाणु के अलावा कभी कभी क्रिस्टल गठन या इकाई सेल आयामों को प्रभावित लेकिन क्रिस्टल संरचना निर्धारण 76-78 की अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है. UF के छोटे अनाज से लाभांवित करके, क्रायो पुनश्च विशेष रूप से लगभग सभी प्रोटीन समाधान में स्वाभाविक रूप से गतिशील और विषम हैं कि जब विचार, प्रोटीन संरचना के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है जो एक ही प्रोटीन, के एक उच्च विपरीत और उच्च संकल्प छवि प्रदान कर सके. इस क्रायो पुनश्च विधि के सत्यापन के लिए, हम उन्हें क्षेत्र से किसी भी अंधा परीक्षण के लिए खुला. लिपो प्रोटीन में rouleaux गठन पर नमक एकाग्रता प्रभाव

परंपरागत पीटीए नकारात्मक धुंधला अभिकर्मक का उपयोग करना, मनाया rouleaux गठन के अधिक होने की संभावना के बजाय प्रोटीन बातचीत के लिपिड बातचीत से संबंधित है. काफी लवणता (0.5 एम NaCl), मध्यम लवणता (0.25 एम NaCl), अपेक्षाकृत कमजोर लवणता (0.1M NaCl), और शुद्ध पानी (9 चित्रा) के तहत तैयार POPC liposome पुटिका के नमूने इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन micrographs rouleaux गठन किया गया था दिखाने नमक एकाग्रता (- डी चित्रा 9A) के लिए सहसंबद्ध. UF के रूप में नकारात्मक धुंधला अभिकर्मक का उपयोग करना, कोई rouleaux जल्दी धुंधला एक जरूरी है सही से पहले नमक एकाग्रता कम करने के लिए धोने की प्रक्रिया, सुझाव POPC liposome पुटिका नमूना 30 (चित्रा 2L) में मनाया गया था, लेकिन संबंधित POPC में rouleaux को रोकने के लिए नहीं स्वतंत्र रूप से पर्याप्त कदम नमूने.

मंदिर इमेजिंग छोटे प्रोटीन एक के पास SCHERZER फोकस हालत की आवश्यकता है.

उच्च संकल्प पर छोटे प्रोटीन का सफल मंदिर इमेजिंग दो महत्वपूर्ण शर्तों, एक उचित बीम संरेखण और एक के पास SCHERZER फोकस अधिग्रहण हालत की आवश्यकता है. मैं) एक उचित बीम संरेखण एक अपेक्षाकृत उच्च defocus के तहत अधिग्रहीत एक कार्बन फिल्म छवि के फूरियर स्थानांतरण पर दिखाई Thon छल्ले (सत्ता स्पेक्ट्रम) की संख्या के माध्यम से आंका जा सकता है. किरण की बेहतर संरेखण हालत, अधिक Thon अंगूठियां देखे जा सकते हैं और एक के पास SCHERZER फोकस के तहत औसत दर्जे का .. द्वितीय) हासिल छवि एक अन्य की हालत गंभीर है. जैविक नमूने छवि के विपरीत 79 में वृद्धि कर सकते हैं - (2 माइक्रोन और भी अधिक 1), जैविक नमूनों इमेजिंग के लिए एक पारंपरिक मानक रणनीति आमतौर पर उच्च defocus का इस्तेमाल करता. यह रणनीति है, जो अक्सर मुश्किल सामग्री के परमाणु संकल्प संरचना इमेजिंग के लिए विशिष्ट रणनीति से अलग महत्वपूर्ण हैएक के पास SCHERZER फोकस (~ 50 एनएम defocus) का इस्तेमाल करता है. एक उच्च defocus जैविक नमूने इसके विपरीत मजबूत बनाने सकता है, उच्च संकल्प संकेतों आंशिक रूप से सफाया हो जाएगा. नतीजतन, उच्च संकल्प संकेत की मिलीभगत एक उच्च defocus इमेजिंग हालत में कम होगा. कारण मंदिर छवि नमूना संरचना के कनवल्शनफ़िल्टर्स और साधन CTF है, कि है. CTF वक्र अक्सर उच्च आवृत्ति पर शून्य आयाम को पार डोलती जिसमें आवृत्ति, के खिलाफ एक oscillating वक्र है. हर बार CTF शून्य भर में, इस विशिष्ट आवृत्ति पर नमूना संरचनात्मक संकेत (शून्य बार किसी भी संख्या शून्य हो जाएगा) का सफाया हो जाएगा. इस आवृत्ति में सफाया संकेत किसी भी CTF सुधार एल्गोरिथ्म (बजाय मूल संरचनात्मक संकेत के किसी भी यादृच्छिक संख्या में हो सकता है एक शून्य से विभाजित एक शून्य) द्वारा बरामद नहीं किया जा सकता. उच्च defocus इमेजिंग के तहत, CTF, और अधिक आक्रामक तरीके से, इस प्रकार CTF एक परिणाम के रूप में, अधिक बार शून्य आयाम पार हिलाना होगाविशिष्ट आवृत्तियों की एक बड़ी संख्या में संरचनात्मक संकेतों का सफाया हो जाएगा. समाप्त हो जाते हैं कि अधिक संकेत, कम मिलीभगत छवि होगा. विशेष रूप से, छवि की मिलीभगत बरामद या किसी भी CTF सुधार करके सही नहीं किया जा सकता. हालांकि, अलग defocuses तहत अधिग्रहीत incompleted छवियों के एक नंबर भी एक परमाणु संकल्प 9-12 प्राप्त किया जा सकता है जिसमें एक औसत विधि, के माध्यम से नमूना संरचना के प्राप्त एक पूरा संरचनात्मक संकेत करने के लिए एक दूसरे को अपने अंतराल को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

औसतन विधि कुछ अत्यधिक सममित प्रोटीन और संरचनात्मक संबंधित कठोर प्रोटीन की संरचना को प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. हालांकि, यह अभी भी विशेष रूप से इस तरह के एंटीबॉडी और HDLs के रूप में संरचनात्मक गतिशीलता और लचीला प्रोटीन, के लिए, छोटे और विषम प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन में चुनौती बनी हुई है. औसतन प्रोटीन कणों की संरचना और रचना लेकिन डि में समान हैं कि इस धारणा पर आधारित हैfferent झुकाव में, लेकिन कई प्रोटीन समाधान में thermodynamic अस्थिरता से गुजरना करने के लिए जाना जाता है. पहले से प्रोटीन thermodynamic अस्थिरता उतार चढ़ाव जाने बिना औसतन पद्धति लागू करके, औसतन संरचना अक्सर डोमेन 10,80 या क्रायो ईएम पुनर्निर्माण में संकल्प 81 में स्थानीय भिन्नता लापता हो सकता है.

एक एकल प्रोटीन के छोटे प्रोटीन के 3D पुनर्निर्माण को प्राप्त करने में सफलता, जैसे 53 केडीए CETP, और 3 डी संरचना, जैसे 160 केडीए IgG1 एंटीबॉडी, एक उचित संरेखण शर्त के तहत लगभग SCHERZER फोकस इमेजिंग हालत का उपयोग करने से लाभ. छवि के विपरीत लगभग SCHERZER ध्यान केंद्रित छवियों में कम लगता है, इसके विपरीत आसानी से बस पृष्ठभूमि में उच्च आवृत्ति शोर को कम करने के लिए कम से गुजारें छानने लगाने से बढ़ाया जा सकता है. हम मानते हैं, के पास SCHERZER छवियों अधिकतम संरचनात्मक संकेतों ले ध्यान देते हैं, और कण संरेखण की शुद्धता बढ़ाने और effi वृद्धि कर सकते हैंएकल कण 3 डी पुनर्निर्माण और व्यक्तिगत कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी पुनर्निर्माण में ciency.

Acknowledgments

हम संपादन और टिप्पणियों, और डीआरएस के लिए डॉ मिकी यांग धन्यवाद. सहायता के लिए लेई जांग और बो पेंग. इस काम विज्ञान का कार्यालय, ऊर्जा के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग के मूल ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय (कोई. डे AC02-05CH11231 अनुबंध), राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान (द्वारा समर्थित किया गया कोई . R01HL115153), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (कोई. R01GM104427).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stain: Uranyl Formate The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. 02545-AA http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Syringe: 1 ml NORM-JECT VWR 89174-491 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm  VWR 28145-487 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) Whatman 6809-1002 http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SIGMA-Aldrich D8537 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft. VWR 470152-246 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh Pacific Grid-Tech Cu-300CN http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh EMS (Electro Microscopy Sciences) CF200-Cu http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5 EMS (Electro Microscopy Sciences) 72882-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System EMD Millipore Milli-Q Advantage A10 http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles Whatman 1001-090 http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil Any type
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors VWR 89174-520 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
Name Company Catalog Number Comments
Glow Discharge Unit Ted Pella 91000 http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors VWR 89174-524 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips VWR 37001-528 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet Pipetman F161201 and F167300 http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx

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Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51087, doi:10.3791/51087 (2014).

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