הפרדה אוטומטית של Published: March 21, 2014 doi: 10.3791/51090

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kwame Twumasi-Boateng¹, Maureen Berg¹, Michael Shapira¹

¹Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

Summary

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

Abstract

Wormsorter הוא מכשיר דומה למכשיר FACS המשמש במחקרים של elegans Caenorhabditis, בדרך כלל כדי למיין תולעים המבוססים על ביטוי של כתב ניאון. כאן, אנו מדגישים את השימוש אלטרנטיבי של מכשיר זה, למיון תולעים על פי מידתם של קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא. שימוש חדש זה מאפשר לנו להתייחס למערכת היחסים בין קולוניזציה של מעי התולעת והאינדוקציה של תגובה חיסונית. בעוד ג תגובות חיסוניים elegans לפתוגנים שונים תועדו, זה עדיין לא ידוע מה יוזם אותם. שתי האפשרויות העיקריות (שאינן סותרים) הן הכרה הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, וזיהוי של נזק שנגרם על ידי זיהום. כדי להבדיל בין שתי האפשרויות, חשיפה לפתוגן חייבת להיות מנותקת מהנזק שהיא גורמת. ההפרדה אפשר wormsorter של תולעים ש- יישבו בהרחבה על ידי גראם nהפתוגן egative Pseudomonas aeruginosa, עם הניזק, אשר עלול להיגרם על ידי עומס הפתוגן, מתולעים שנחשפו באופן דומה, אבל לא, או שולי, קולוניאלי. אוכלוסיות מובחנות אלה שימשו כדי להעריך את הקשר בין עומס הפתוגן והאינדוקציה של תגובה חיסונית תעתיק. מהתוצאות עולה כי שני הם ניתקו, התומכים באפשרות של הכרת הפתוגן.

Introduction

מיון תולעת אוטומטי הוא הרבה יותר כמו FACS, הפועל על ידי מדידת אות ניאון בתולעת (הניתנת בדרך כלל על ידי ביטוי של חלבונים מהונדסים כתב) כשהוא עובר יישר בצינור, המאפשר ניתוב מחדש או לצינור איסוף / טוב או למכל פסולת על פי לgating פרמטרים שנקבעו על ידי החוקר ^1. Wormsorter יכול להקל על מחקר בדרכים רבות; דוגמא להעסקתו ככלי אנליטי היא מחקר שבא בעקבות דפוסי spatiotemporal פעילות אמרגן לכמעט 1,000 גנים ^2.
עם זאת, השימוש העיקרי של wormsorter הוא במסכים גנטיים, בעקבות רמות יעד גן הביטוי או לוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי לאורך הציר של התולעת ^3-5.

כאן, אנו מתארים יישום חדש לwormsorter, בבעקבות הקולוניזציה של התולעת על ידי פתוגן מתויג fluorescently. עם זה ככלי שאנחנו מתמקדים במערכת היחסים בין pathogen קולוניזציה / עומס ואת התגובה החיסונית, כדי לקבל תובנות חדשות על המנגנונים אחראים לייזום של מערכת החיסונית בתולעת.

כמעט בכל היצורים שנחקרו עד כה, ייזום של תגובה חיסונית מולדת לחיידקי גורמי מחלה תלוי בהכרה של דפוסים הקשורים לפתוגן המולקולריים (PAMPs), ו / או דפוסים מולקולריים סכנה / הקשורים לנזק (damps) ^6,7. המבנים הראשונים שמורים של חיידקים הכוללים רכיבים של קיר חיידקי התא, השוטון שלו, או bilayer השומנים שלה ^6; השני, כוללים שני מולקולות שפורסמו (למשל ה-ATP ^8), חלבונים שונים או סמנים אחרים של תהליכים תאיים שינו ^9,10. שני סוגי האותות מוכרים על ידי חלבונים המיועדים כקולטניים זיהוי תבניות (PRRs), שעליו ספציפי מחייב של מולקולת דפוס להפעיל את שרשרת האירועים שהובילו לתגובה המגנה. ג elegans כבר מאוד שימושי כמו tractaמודל ble לנתח היבטים שונים של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, אבל דבר אחד שאינו מובן היטב הוא איך תגובות חיסוניים הם יזמו בתולעת. אף אחד מהקולטנים המשוערת שorthologous לקולטנים זיהוי תבניות (PRRs) באורגניזמים אחרים הוכחו לאגד PAMPs, ורבים מorthologs של PRRs שהם מרכזיים לתגובות חיסוניים באורגניזמים אחרים להראות תרומה מוגבלת באופן מפתיע לתגובות הפתוגן התולעת והתנגדות. לדוגמא, קולט דרוזופילה האגרה, שהוא חיוני להתנגדות פתוגנים גראם חיוביים, מיוצג בג elegans ידי homolog בלעדי, tol-1, אשר תורם להגנה מפני הפתוגן השלילי גרם סלמונלה ¹¹ Typhimurium, אבל לא מגורמי מחלה אחרות שנבדקו גראם שליליות, או חיובית ^11,12. תצפיות אלו, בשילוב עם נתונים המצביע על כך תגובה חיסונית יכול להיגרם על ידי שיבוש שעות תרגום חלבונים תאייםכהוביל כמה להציע כי ג elegans מזהה בעיקר damps ^9,13,14. עם זאת, דיווחים המתארים את היכולת של פתוגנים מתים כדי לעורר תגובות חיסוניים מראים כי PAMP מחייב ניתן יש תפקיד חשוב בזיהוי הפתוגן בג elegans ^15,16. עבודה קודמת מתמקדת בתגובות חיסונית בג הזהה מבחינה גנטית מסונכרן גיל elegans אוכלוסיות, הפגינו השתנות בודדת גדולה בקולוניזציה במעי על ידי פתוגן החיידקים גראם שלילי Pseudomonas aeruginosa.

עם זאת, מחקרי פרופיל תעתיק טופלו אוכלוסיות variably-יישבו אלה כישות אחת ^17,18. ניצול של השונות הזאת, פיתחנו פרוטוקול תוך התמקדות wormsorter אוטומטי להפריד אוכלוסיות יישבו באופן דיפרנציאלי של elegans Caenorhabditis נחשף לפ-GFP-לבטא aeruginosa. בדיקת ביטוי גנים באוכלוסיות שונה, יישבו faciהערכת litated של הקשר בין עומס הפתוגן (והנזק קשור) ואת התגובה חיסונית ותובנות חדשות הניתנות על הכרת הפתוגן בג elegans ^19. להלן נתאר את הפרוטוקול, אשר יכול להיות מיושם כדי למיין תולעים נגועים בפתוגן כל שכותרתו fluorescently.

למשתמשים פוטנציאליים יש לציין כי מספר התולעים נדרשו להיות מיינו תלוי באופי של הניתוחים שלאחר מכן ופרוטוקולים שבשימוש. לדוגמא, במקרה של ניתוח ביטוי גני microarray,> 1,000 תולעים יידרשו להשיג מספיק RNA, אם פרוטוקולים סטנדרטיים משמשים, אבל ~ 100 תולעים יספיקו אם הגברה היא מועסקות, המאפשרים איסוף מהיר של חומר ובכך למזער את הלחץ על התולעים.

Protocol

1. קבלת תרבות מסונכרן של בעלי חיים למבוגרים צעירים

1. לגדול תולעים בכמה צלחות NGM seeded עם OP50-1 E. חיידקי קולי (10x מרוכז מתרבות רוויה) עד תולעים רבים הגיעו לשלב הרה.
2. טיפול בבעלים חיים הרה להולדת עם פתרון ביצת הכנה כדי לקבל תרבות מסונכרנת (ביצים).
3. ביצי צלחת על כמה צלחות NGM 60 מ"מ זרע עם 10x OP50-1 מרוכז בצפיפות של כ 150-200 ביצים / צלחת.
4. דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (עד תולעים הגיעו L4 - במה למבוגרים צעירה).

2. הכנת צלחות aeruginosa Pseudomonas ומדביק את התולעים

1. ביום של ביצת ההכנה (שלב 1.1) לחסן תרבות PA14 :: ה-GFP לתוך 2 מיליליטר של ריפאמפיצין מדיה המכילה B של המלך בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם התסיסה O / נ
2. פלייט הרחוב ללא PA14 :: ה-GFPture על כמה שיותר צלחות איטית הריגה (SKP) לפי צורך עבור assay. על כל צלחת פיפטה 150 מ"מ SKP פטרי 75-100 μl של תרבות רוויה ולהתפשט באופן שווה באמצעות מפזר זכוכית סטרילית. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-24 שעות.
3. הסר את הצלחות מן החממה ולאפשר להם להתקרר לRT (~ 20 דקות). באמצעות חיץ M9, לשטוף תולעים משלב 1.4 על PA14 :: לוחות GFP בנפח מינימאלי של נוזלים. בעת שימוש ב150 צלחות מ"מ, יכולים להיות ממוקמים כמה מאה תולעים בצלחת אחת.
4. דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 18-21 שעות. לפ תולעים צעירים מבוגרים חשופים aeruginosa, זה חלון הזמן בו מוצגות החלוקה האופטימלית של קולוניות לעומת חיות noncolonized.

3. הגדרת Wormsorter

לפני ביצוע סוג המדגם, להבטיח כי המכשיר פועל כהלכה. פרטים ניתן לקבל בhttp://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, והדואר צעדים חיוניים המפורטות להלן.

1. הגדר את לחץ שסתום נדן לכ -5 psi (4.5-5.5 טווח).
2. כדי לוודא שקצב זרימת נוזל הנדן מתאים, למקם את צינור חרוטי 15 מיליליטר מתחת למתקן, להפעיל את שסתום הנדן, ולכבות את שסתום סדרן. החזק את הצינור מתחת למתקן ל60 שניות. הנפח בצינור צריך להיות 9-10 מיליליטר. אם זה מחוץ לטווח זה, התאם את לחץ שסתום נדן בהתאם.
3. כדי להבטיח שקצב זרימת נוזל נדן (כפי שנקבע בשלב 3.2) יאפשר מיון מדויק, לבחון את שיעור מין באמצעות 40 חלקיקי מיקרומטר שליטה:
4. כבה את שסתום הנדן. הוסף על 25 מיליליטר של תמיסת חלקיקי שליטה למאגר.
5. הפעל את שסתום הנדן, ואת שסתום המדגם.
6. בתוכנת המחשב, נווט אל "מצב חלקיק השליטה" ולחץ על רכישה.
7. ודא את זרימת חלקיקי השיעור הוא ~ 5-8 חלקיקים / sec, עם TOF (שעת טיסה) שלהן דומים לרוחבשל החלקיקים, 40 מיקרומטר. כגון TOF מציין כי רק אובייקט 40 מיקרומטר אחת עובר דרך בכל פעם. אם ערכים נמצאים מחוץ לטווח זה, התאם את הגדרות (להלן כיוונים לעיל) בהתאם.

4. מיון יישב לעומת התולעים Noncolonized

1. באמצעות M9, לשטוף תולעים לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל. לאפשר תולעים בוגרות לשקוע לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה ולהסיר את supernatant. מלא את הצינור עם M9 הטרי. חזור על תהליך זה 3-4x. זה מסיר חלק גדול מזחלים, כמו גם חיידקים עודפים ולוקח בערך 10 דקות.
2. להוסיף תולעים למאגר wormsorter עם בר ומערבב קטן בעדינות ללישת.
3. התאם רווח אות ראשוני על ידי הגדרה הירוקה PMT 600 והאדומים וצהוב PMT 200.
4. בגין רכישת נתונים כדי להתאים את ההגדרות.
5. לשאוף לשיעור סוג של 25-30 אירועים (תולעים) לשנייה. אם שיעור המספר גבוה מדי, לדלל את התולעים במאגר עם M9 בהתאם. אם השיעור הואo נמוכה, להוסיף עוד תולעים בנפח קטן של M9.
6. אם הניסוי דורש הפרדה מחמירה מאוד של קולוניות לעומת תולעי noncolonized, להגדיר את "בדיקת צירוף מקרים" ל" טהורה ". הדבר מבטיח כי במקרה שני עצמים מתרחשים קרובים מדי זה לזה או באותו הירידה, המכונה דוחה את הירידה ולא לאסוף אותו.
7. כדי למיין את האוכלוסייה של עניין, לצייר שערים סביב הצירים המציינים גודל (להשיג תולעים בוגרות) ועוצמת הקרינה (כלומר גבוהה לקולוניזציה, נמוכה לnoncolonized). הערכים עבור gating הקרינה צריכים להיקבע באופן אמפירי.
8. מניחים צלחת רב גם או צלחת פטרי מתחת למתקן לאיסוף תולעים לאחר מכן פתח את השסתום מהסוג להתחיל מיון תולעים.
9. אסוף אוכלוסייה קטנה של בעלי חיים כדי לוודא תחת המיקרוסקופ שהאוכלוסייה מסודרים היא האוכלוסייה של עניין. אם לא, להתאים את הפרמטרים gating בהתאם, ולהמשיך באיסוף דגימה.

Representative Results

ג כאשר מתאימים בגיל, זהה מבחינה גנטית elegans נחשפים לפ aeruginosa, הפצה רחבה הוא ציין ברמות (איור 1 א) קולוניזציה. בעזרתו של הפרוטוקול המתואר כאן הפרדה יעילה של noncolonized מתולעים יישבו יכולה להיות מושגת (איור 1). שלא כמו תולעי noncolonized, תולעים יישבו להראות סימנים של נזק, כגון זחילה והפרשת צואה מופחתת ^19. האחרון עשוי להיות סיבה לכך שתולעים יישבו על ידי פ יש לי aeruginosa קושי ניקוי זיהום. יש לכך השלכות ישירות לפרוטוקול המתואר המצביע על כך תולעים מסודרים כnoncolonized לא יישבו בעבר. כדי לבחון ישירות אם טענה זו נכונה, תולעים יישבו הרים יד היו נתונים לשלבים כביסה דומים לאלה בניסוי המיון ובדקנו לאחר מכן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי; רק 4/56 פינו את הפתוגן. לכן, סביר להניח הבחלקן של תולעים בעבר יישבו בין אלה מסודרים כnoncolonized הוא זניח. עם זאת, מומלץ לעקוב אחר שינויים בקולוניזציה במהלך שלבי כביסה כדי למנוע תופעות של מיון טועה בניתוח, שעשויה להיות יותר של בעיה לפתוגנים אחרים מאשר פ aeruginosa.

העבודה קודמת העסקת הפרוטוקול המתואר כאן משמש תולעים מסודרים לניתוח ביטוי גני microarray וראה תגובות זהות במהות לפ aeruginosa באוכלוסיות תולעת קולוניות וnoncolonized שנחשפו לפתוגן עבור אותה הכמות של זמן ^19. איור 2 מדגים את אותה מגמה באמצעות כמותית (q) RT-PCR למדידת ביטוי של ארבעה גנים, הידוע להיות חלק מC . elegans תגובה חיסונית: יס-2 מקודד ליזוזים, F08G5.6 וF55G11.2 שני גנים uncharacterized, שמגיבים באופן ספציפי לזיהום, מתוכם הראשונות גם תורם לinfecהתנגדות tion, וPGP-5, אשר מגיב לזיהום, כמו גם ללחץ כבד ממתכת. כל ארבעה הגנים היו מושרה באופן דומה על ידי פ ' חשיפת aeruginosa, ללא קשר למעמד קולוניזציה של התולעים. זה מאשש את תוצאות שפורסמו בעבר מצביעים על כך שההתישבות והנזקים הקשורים אליו לא נדרשים לתגובה חיסונית, במקום מצביעים על הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן כאות. שPGP-5 הוא מושרה בחיות noncolonized, שלא צפוי להיות חווים נזק רב, מצביעה על חפיפה בתוכניות הרגולציה שליטה מערכת החיסונית ואת תגובות לחץ כלליות בג elegans.

איור 1. יישבו וnoncolonized ג elegans מופרד באמצעות wormsorter. (א) תמונה מייצגת של הבוגרים ג wild-type elegans נחשף לפ-GFP-לבטא aeruginosa ל18 שעה. (ב) נציג תמונות של תולעי noncolonized ויישבו מופרדות באמצעות wormsorter. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. קולוניזציה לא נדרשה לתגובת תעתיק לפ aeruginosa. רמות RNA של יס-2 (א), F08G5.6 (ב '), F55G11.2 (C), וPGP-5 (ד') נמדד על ידי qRT-PCR בחיות בר מסוג שנחשף לE. coli או פ aeruginosa </ Em> ל~ שעות 18. מוצגים הם האמצעי וSD של מדידות כפולות מניסוי אחד, שהוא נציג של שלוש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1. חומרים וחומרים כימיים הדרושים לניסוי wormsorter.

Discussion

השיטה שאנו מתארים מנצלת ניאון תיוג של גופים מחוץ לתולעת, לעקוב אחרי יחסי גומלין בין התולעת וסביבתו. במקרה שאנו מציגים, הפרדה הייתה מבוססת על תיוג של הפתוגן והועסקה לתולעים נפרדים עם עומס הפתוגן כבד מאלה שאין לי (או אור) עומס. ניתוח ביטוי גנים לאחר לא מצא הבדל בתגובה חיסונית בין שתי הקבוצות שמראות כי הם היו תלויים בעומס הפתוגן. האות שיוזמת את התגובה הראתה במקום אחר להיות קשורים פיזי עם החיידקים, במקום להיות מופרש, מה שמרמז שאות זו עשויה להיות PAMP. יחד, תוצאות אלו תומכות בהשערה כי הכרת PAMP משחקת תפקיד בייזום תגובה חיסונית בג elegans ^19.

אחד יתרונות של פרוטוקול המיון המתואר לעיל הוא שיישבו שני ותולעי noncolonized מבודדים מאוכלוסייה אחת. ההוא תלוי בבעל אוכלוסייה עם החלוקה אופטימלית של בעלי חיים, כי הם יישבו מול noncolonized. מצאנו כי כאשר מדביק את תולעים צעירים, מבוגרים, מסוג בר עם פ aeruginosa, זה תואם את זמן חשיפה של בערך 18 שעה. חשיפה חלקית זו הופקה אוכלוסייה שבה רוב בעלי החיים יושבו לתואר "ביניים", אבל כמה מאה תולעים הראו קולוניזציה מלאה, ומספר דומה היו noncolonized. אמנם זה מייצג הפצה אופטימלית למטרות שלנו, אחרים עשויים להגדיר את החלוקה האופטימלית שלהם.

במהלך מיון, רצוי שתהיה "בקרת איכות" שנבנתה לכל ניסוי. אנחנו עשינו את זה בשתי דרכים. אחד, ללימודי ביטוי גנים, שהרי יד במספר קטן של תולעים (יישבו וnoncolonized) תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון, אשר יכול לשמש לqRT-PCR על סדרה מוגבלת של גנים. אלו משמשים כ" תקן הזהב "על מה expressi הגןבאוכלוסייה באמת טהורה תיראה. שנית, זה תרגול טוב כדי למיין 20 או יותר תולעים לצלחת לכל אוכלוסייה ממוינת באופן אוטומטי כדי לוודא תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כי המכשיר מבצע כצפוי. בהתאם ליישום במורד הזרם, בדרגות שונות של "נאמנות" של פרוטוקול המיון ייתכן שיידרשו. כאשר תולעים מסודרים אינם תואמים את המידה הרצויה של קולוניזציה, צריכים להיות מותאמים פרמטרים gating (שלב 4.7). יש לציין כי מחמיר יותר השערים, ככל שהמספר הגבוה הראשוני של תולעי צורך, והניסויים צריכים להיות מדורגים בהתאם.

הניסוי המתואר כאן יכול להתבצע עם כל הפתוגן של עניין (כל עוד זה מתויג fluorescently). בעקבות מיון, ניתוחים שלאחר מכן לא צריכים לדבוק בניתוח ביטוי גנים, ויכולים להתמקד בהישרדות או אפילו ניתוח התנהגותי. יתר על כן, פרוטוקולים דומים יכולים לשמש למטרות אנליטיות, לעקוב אחר קליטת המטבוליט, או לכמת עומס הפתוגן, שהאחרון מתן אלטרנטיבה פשוטה לספירת CFU, שהם משתנים ^20,21 מאוד. העלייה במספרים ובמהירות יכולה להקל כימות עומס הפתוגן בתנאים שונים, ובם שיבושים גנטיים במארח או פתוגן, ותנאים סביבתיים שונים. יתר על כן, מאז wormsorter יכול להיות מצויד כדי לזהות מולקולות ניאון מרובות, מעקב קולוניזציה לא צריך להיות מוגבל לסוג אחד של חיידקים. יכולת זו תהיה שימושית עבור מחקרים אקולוגיים, המאפשרת לחיידקים שונים להתחרות על קולוניזציה. במחקרים במעבדה של פתוגנזה, ג elegans הוא גדל בדרך כלל על מאחדות תרבותיות חיידקים. עם זאת, המחקר של מנגנונים של חסינות מולדת בטבע, שבו פתוגנים קיימים בקרב מאות מיקרואורגניזמים אחרים העשויים להשפיע על חסינות מתחיל לגייס את תשומת לב ^22,23.

לסיכום, מנצליםגרם wormsorter עבור מגוון רחב של יישומים מאפשר ניסויים שיבוצעו בזמן קצר, ו / או בקנה מידה גדולה. הרחבת הרפרטואר של יישומים כאלה יכולים לקדם את ההבנה שלנו ג elegans פיזיולוגיה. בפרט, בתחום ג elegans חסינות מולדת, הישרדות היא לעתים קרובות נעשה שימוש מטרי לבדיקת תרומתם של גנים שונים. עם זאת, קולוניזציה היא יותר פרוקסימלי לאירועים שייזמו חסינות תוך מתן תפוקה פונקציונלית. תוך שימוש בפרוטוקולים כפי שמתואר כאן לבודד ו / או לנתח את אוכלוסיות של ריבית הוא כלי רב ערך כדי ללמוד היבטים שונים של האירועים המוקדמים של תגובות חיסוניים בתולעת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer	prepared in house		Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	prepared in house		50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide
NGM plates	prepared in house		Recipe at wormbook.org
SKP plates	prepared in house		Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001