Summary
该wormsorter通过根据荧光记者表达分拣蠕虫有利于遗传筛选在秀丽隐杆线虫 。在这里，我们描述了一个新的使用：根据定植通过GFP表达病原体排序，我们用它来检查病原体识别在启动免疫反应的了解甚少的作用。
Abstract
该wormsorter是一种手段类似于用在秀丽隐杆线虫的研究，在FACS机器，通常进行排序基于荧光报道的表达蠕虫。在这里，我们重点介绍该仪器的另一种用法，根据由GFP表达他们的病原菌定植程度的排序蠕虫。这个新的使用使我们能够解决肠蠕虫和诱导的免疫应答的定植之间的关系。虽然C.线虫的免疫反应，以不同的病原体已被记录在案，仍是一个未知数，什么因素促使他们。两个主要的可能性（这并不相互排斥）是识别病原体相关的分子模式，并检测感染所引起的损伤。要在两个可能性区分，接触到的病原体必须从它所造成的损害进行分离。蠕虫的wormsorter启用分离的进行了广泛定植由革兰氏-Negative致病菌绿脓杆菌 ，有可能是由病原体负荷造成的损害，从蠕虫，亦放置，而不是，或轻微，定植。这些不同的群体被用来评估病原体负载和转录的免疫应答的诱导之间的关系。该结果表明，这两个解离，配套的病原体识别的可能性。
Introduction
蠕虫自动分拣很像流式细胞仪，通过在蠕虫（通常由记者蛋白的转基因表达提供）测量荧光信号，因为它通过拉直在管经营，允许根据重定向到任何一个收集管/孔或废物容器到门的研究员1设置参数。该wormsorter可以在许多方面促进研究，采用它作为分析工具的一个例子是一项研究，随后启动子活性的时空模式对近1000个基因2。
然而，wormsorter的主要用途是在遗传筛选，下列靶基因表达水平或荧光蛋白的沿蜗杆3-5的轴线定位。
在这里，我们描述了wormsorter一个新的应用程序，在由荧光标记的病原体以下蠕虫的殖民化。用此作为一种工具，我们专注于pathog之间的关系恩定植/负载和免疫反应，从而获得新的见解负责的蠕虫启动免疫反应的机制。
几乎在研究迄今所有的生物，先天免疫反应，病原微生物开始依赖于识别病原体相关分子模式（PAMP），和/或危险/损伤相关分子模式（抑）6,7。第一是保守的微生物结构，其包括微生物细胞壁，其鞭毛，或它的脂质双分子层6的部件，第二个，包括释放分子（ 如 ATP 8），改变的蛋白或改变的细胞过程9,10的其他标记。这两种类型的信号被指定为模式识别受体（模式识别受体），其在特定的图案分子的结合激活链导致的保护性反应事件的蛋白C。确认。 线虫一直作为tracta非常有用的BLE模型解剖的宿主 - 病原体相互作用的各个方面，但有一点还不是很清楚的是免疫应答是如何在蠕虫发起的。无推定的受体是同源模式识别受体（的PRRs）在其他生物体中已显示出结合的PAMP，许多的PRR是关键对于在其他生物中的免疫应答的直向同源物的展现给蠕虫病原体响应一个令人惊讶的贡献有限和电阻。例如，在果蝇 Toll受体，它是一种抗革兰氏阳性病原体必不可少的，表示以C由一个唯一同源物，TOL-1，这有助于保护从革兰氏阴性病原体沙门氏菌 11，但不从其他检测革兰氏阴性或阳性病原体11,12。这些观察，结合数据线虫表明免疫应答可以通过破坏细胞蛋白质翻译h内诱导为使一些人认为，C。线虫主要检测DAMPS 9,13,14。然而，描述的死病原体诱导的免疫应答能力的报告表明，PAMP结合可能有病原体识别在C的重要作用线虫 15,16。以前的工作重点是与年龄同步的基因完全相同C.免疫反应线虫种群，由细菌革兰氏阴性致病菌绿脓杆菌表现在肠道定植大的个体差异。
然而，转录谱研究处理这些可变定植人群作为一个实体17,18。利用这种变化，我们开发了一套集中的自动化wormsorter分离暴露在表达GFP的体育秀丽隐杆线虫的差异殖民地人口铜绿假单胞菌 。研究基因表达的不同定植人群FACI病原体负载（和相关联的损伤）和免疫应答和有关C.病原体识别提供了新的见解之间的关系litated评估线虫 19。下面我们介绍的协议，它可以应用到排序感染任何荧光标记的病原虫。
给潜在的用户应当注意的是，需要进行排序的蠕虫数目依赖于随后的分析和协议中使用的性质。例如，在微阵列基因表达分析的情况下，> 1,000蠕虫将需要获得足够的RNA，如果使用标准的协议，但〜100蠕虫就足够了，如果扩增采用，允许快速采集材料，因而应力最小化，以该蠕虫。
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Protocol
1。获得年轻的成年动物的同步文化
- 蠕虫生长在接种OP50-1 大肠杆菌数NGM板大肠杆菌菌（10倍浓缩从饱和的文化），直到许多蠕虫都达到了妊娠阶段。
- 治疗妊娠动物的卵制备的溶液，以获得同步培养（卵）。
- 在几个60毫米NGM板板蛋接种10倍浓缩OP50-1在大约150-200个卵/板的密度。
- 孵育板在25°C为2天（直到蠕虫已经达到了L4 - 青少年阶段）。
2。准备绿脓杆菌板，感染蠕虫
- 对鸡蛋准备（步骤1.1）的一天接种PA14 :: GFP文化于2ml为100微克/毫升的最终浓度金氏B培养基含有利福平。孵育培养，在37℃下搅拌的O / N。
- 板的PA14 :: GFP的尽头根据需要测定TURE到尽可能多的缓慢杀灭板（SKP）。在每个150毫米SKP培养皿移液器75-100微升饱和培养均匀涂抹用无菌玻璃吊具。培养板在37℃下20-24小时。
- 从孵化器中取出板，让他们冷却至室温（约20分钟）。用M9缓冲液中，来自步骤1.4中的液体的最小量洗蠕虫到PA14 :: GFP板。当使用的150mm板，几百蠕虫可以被放置在一个单一的板。
- 孵育板在25℃，18〜21小时。对于P。铜绿假单胞菌暴露年轻的成虫，这是时间窗口，显示的殖民者的最优分配比noncolonized动物。
3。设立Wormsorter
在进行样品排序，确保机器正常工作。详情可http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43获得，日以下ae基本步骤进行了概述。
- 设置止回阀的压力约5磅（4.5-5.5范围内）。
- 以验证鞘液的流速是合适的，放置15毫升锥形管中的分配器的下方，打开鞘阀，并关闭分选器阀。保持管内的分配器60秒的下方。在管中的体积应为9-10毫升。如果在此范围之外，相应地调整鞘阀压力。
- 以确保鞘液流动速率（设置为在步骤3.2）将允许精确分选，测试使用40微米的颗粒控制的排序率：
- 关闭止回阀。加约25ml的控制粒子溶液的贮存器。
- 打开鞘阀，样品阀。
- 在计算机软件，导航到“控制粒子模式”，然后点击获取。
- 确保颗粒流量为〜5-8粒/秒，用TOF（时间飞行）近似宽度颗粒，40微米。这样的TOF表明只有一个40微米的对象是通过在一个时间流逝。如果值在这个范围之外，调整设置（按照上述方向）相应。
4。排序殖民者与Noncolonized蠕虫
- 使用M9，洗蠕虫成15毫升锥形管。允许成虫由重力下沉到试管底部并除去上清液。填充管与新鲜的M9。重复这个过程3-4倍。这消除了很大比例的幼虫以及过量的细菌并需要大约10分钟。
- 蠕虫添加到wormsorter水库，轻轻混合小搅拌棒。
- 由绿色光电倍增管的红色和黄色的PMT设置为600和200的初始调整信号增益。
- 开始采集数据调整设置。
- 瞄准25-30事件（蠕虫）每秒一种速度。如果数率太高，淡化蠕虫与M9相应的贮存器。如果利率是o低，在小体积的M9添加更多的蠕虫。
- 如果实验需要的殖民一个非常严格的分离与noncolonized蠕虫，设置“巧合检查”到“纯”。这确保了在事件的两个对象发生太靠近彼此或在相同的压降，该机器将拒绝该压降，而不是收集它。
- 要排序的利益群体，绘制一个围绕轴门表示大小（以获得成虫）和荧光强度（ 即高的殖民统治，低noncolonized）。对于荧光门控的值必须根据经验来确定。
- 将一个多孔板或分配器下方的培养皿收集蠕虫然后打开阀门排序开始整理蠕虫。
- 收集一小群动物的分类人口的利益群体在显微镜下进行验证。如果不是这样，相应地调整门控参数，并继续与样品采集。
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Representative Results
当年龄相匹配的，遗传上相同的C。线虫暴露于P。假单胞菌 ，广泛分布在定殖（ 图1A）的水平变化。与此处描述的noncolonized从殖民蠕虫有效的分离可以实现（ 图1B）协议的帮助。不像noncolonized蠕虫，蠕虫殖民显示损坏的迹象，如呆滞，减少排便19。后者可能是一个原因，蠕虫殖民地P。绿脓杆菌有困难清除感染。这对描述的协议表明蠕虫排序，noncolonized以前未定植直接的影响。直接测试这种说法是否正确，钦点殖民蠕虫受到类似的洗涤步骤，那些在分类实验，随后在荧光显微镜下观察，只有五十六分之四清除病原体。因此，有可能第在先前殖民蠕虫在那些排序为noncolonized的比例可以忽略不计。然而，最好是监视在洗涤步骤的变化定植，以防止误分选对分析的影响，这可能是更大的问题，对其他病原体比P。铜绿假单胞菌 。
以前的工作使用这里描述用于排序的蠕虫的微阵列基因表达分析和观察到的基本上是相同的反应P.协议铜绿假单胞菌中已暴露于病原体的时间19相同数量的殖民者和noncolonized蠕虫病毒的人群。 图2演示了使用量化（Q）RT-PCR方法来测量四个基因，已知的 C部分表达了同样的趋势。线虫免疫应答：LYS-2编码一种溶菌酶，F08G5.6和F55G11.2两个未知的基因，即对感染的反应特异性，其中所述第一也有助于感染化性能，和PGP-5，这是为了响应感染以及重金属应力。这四个基因的由P.同样引起铜绿假单胞菌曝光，不管蠕虫的殖民状态。这证实了先前公布的结果表明定植和其相关联的损伤是不需要的免疫应答，而不是指在病原体相关分子模式的信号。这PGP-5是诱发noncolonized动物，它们预计不会遇到大面积损坏，建议在监管项目控制免疫反应和一般应激反应中C的重叠线虫 。
图1。殖民和noncolonized C。使用wormsorte 线虫分离野生型成年C的河（A）代表图像暴露在表达GFP的体育线虫假单胞菌 18小时。 （B）的noncolonized和殖民蠕虫代表图像使用wormsorter分开。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。不需要对P的转录反应定植铜绿假单胞菌 。的LYS-2（A）+ RNA的水平，F08G5.6（B），F55G11.2（C）和PGP-5（D）由定量RT-PCR检测野生型动物中测量接触到大肠杆菌大肠杆菌或P。铜绿假单胞菌</ em>的为〜18小时。显示的是手段，从一个实验，这是三个有代表性的重复测量的SD。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1材料和所需的wormsorter实验试剂。
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Discussion
我们所描述的方法利用实体的荧光标记的蜗杆以外，遵循蠕虫和它的环境之间的相互作用。在我们目前的情况下，分离是基于病原体的标记和被雇用，以单独的蠕虫与那些没有（或轻）负荷沉重的病原体负荷。随后的基因表达分析中发现的免疫反应，两组表明它们是独立的病原体负载之间没有差异。启动该响应信号别处被证明在物理上与细菌相关的，而不是被分泌的，这表明这种信号可以是PAMP。总之，这些结果支持这一PAMP识别起着在C启动免疫应答中起作用的假说线虫 19。
上面描述的排序协议的一个优点是，这两个定植和noncolonized蠕虫是由一个单一的群体分离。钍是取决于有人口与那些殖民与noncolonized动物的最佳分配。我们发现，与体育感染年轻的成人，野生型蠕虫时假单胞菌 ，这相当于大约18小时的曝光时间。本次曝光时产生的，其中大多数动物被殖民的一个“中间”的程度，但几百蠕虫表现出了十足殖民化，以及同样数量的被noncolonized人口。虽然这代表了我们的目的最优分配，其他人可能定义自己的优化配置。
在排序过程中，最好是有“质量控制”内置到每个实验。我们这样做有两种方式。一，基因表达的研究，我们钦点的荧光解剖显微镜，可用于定量RT-PCR对一组基因在有限的一小部分（殖民和noncolonized）蠕虫。这些作为“金标准”是什么基因则表达式，在一个真正的纯粹的人口会是什么样子。其次，这是很好的做法，20个或更多的蠕虫进行排序，以一盘为每个自动排序人口仪器正在执行如预期般在荧光显微镜下进行验证。根据下游应用，可能需要不同程度排序协议“保真”的。当蠕虫排序不符合定植的期望程度，门需要调整的参数（步骤4.7）。应当指出的是，更严格的栅极，需要蠕虫的更高的初始数量和实验应该相应地按比例增加。
这里描述的实验中可以进行与任何感兴趣的病原体（只要它是荧光标记）。下面的排序，后续的分析并不需要坚持的基因表达分析，并能专注于生存，甚至行为分析。此外，类似的协议可以用于分析目的，遵循代谢物的吸收，或者以量化病原体负载，后者提供一个简单的替代CFU计数，这是高度可变20,21。在数量上和速度上的增加可能促进在不同条件，包括基因破坏在宿主或病原体，并且在不同环境条件下的量化病原体负载。此外，由于wormsorter可以配备用于检测多个荧光分子，跟踪定植不需要被限制在一个单一类型的细菌。这种能力将是生态研究非常有用，可以让不同的微生物争夺殖民。在发病机理，C的实验室研究线虫通常生长在细菌单一种植。然而，在野外，在那里病原体存在其中包括数百名可能会影响免疫力等微生物的天然免疫机制的研究也开始吸引客户的关注22,23。
综上所述，加兹登克的wormsorter用于广泛的应用范围允许实验在很短的时间内进行，对大规模和/或。扩大这类应用的剧目可以推动我们的C的理解线虫生理。特别是，在C的场线虫先天免疫，生存是一个经常被使用的度量测试各种基因的贡献。然而，定植更靠近该开始免疫，同时还提供一个功能输出的事件。使用协议如这里描述的分离和/或分析的兴趣群体是研究中的蠕虫的免疫应答的早期事件的各个方面的一种有价值的工具。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢埃利森医学基金会的支持。我们还要感谢艾比Dernburg实验室的成员，使用的wormsorter援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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