Summary
wormsorterは蛍光レポーターの発現に応じてワームをソートすることによって線虫（Caenorhabditis elegans）における遺伝子スクリーニングを容易にします。 GFPを発現病原体によるコロニー形成に応じて仕分けし、我々は、免疫応答を開始における病原体認識のよくわかっていない役割を調べるためにそれを利用する：ここでは、新たな使用方法を説明します。
Abstract
wormsorterは蛍光レポーターの発現に基づいてワームを並べ替えることが一般的には、 線虫（Caenorhabditis elegans）の研究で使用されているFACS装置に類似した楽器です。ここでは、GFPを発現病原体によるコロニー形成の程度に応じてワームをソートするために、本器の代替使用状況を強調表示します。この新しい使用は、私たちは、ワームの腸や免疫応答の誘導の植民地との関係に対処することができました。一方、C.異なる病原体への虫の免疫応答は、それらを開始し何まだ不明ですが、文書化されている。 （相互に排他的ではない）2主な可能性が病原体関連分子パターンの認識、感染によって引き起こされた損傷の検出である。 2つの可能性を区別するために、病原体への暴露は、それが引き起こす損傷から解離されなければならない。グラムNによって広く保菌されたワームのwormsorter有効に分離植民同様に暴露されたワームの可能性が高い病原体の負荷による損傷はなく、またはわずかに、とegative病原緑膿菌 、。これらの異なる集団は、病原体負荷および転写免疫応答の誘導との間の関係を評価した。結果は、2つの病原体認識の可能性を支持し、解離していることを示唆している。
Introduction
自動ワームのソートは、それがチューブ内に真っ直ぐに通過すると（通常はレポータータンパク質のトランスジェニック発現によって提供される）ワームに蛍光シグナルを測定することにより、オペレーティング·リダイレクション、コレクションチューブに/ウェルまたは廃棄物容器に応じてできるように、多くのFACSのようなものです研究者1が設定したパラメータをゲーティングする。 wormsorterは、多くの方法で研究を容易にすることができる。分析ツールとして、それを採用した例はほとんど千の遺伝子2プロモーター活性の時空間パターンを踏襲研究である。
しかしながら、wormsorterの主な用途は、標的遺伝子発現レベル又はウォーム3-5の軸に沿った蛍光タンパク質の局在化に続いて、遺伝子スクリーニングである。
ここでは、蛍光タグ付けされた病原体によるワームの定着を、以下に、wormsorterための新しいアプリケーションを記述します。これによりツールとして、我々はpathogとの関係に焦点を当てた植民地化/負荷と免疫応答備わり、ワームでの免疫応答の開始に責任のメカニズムに新たな洞察を得るために。
これまでに研究され、事実上すべての生物では、微生物病原体に対する自然免疫応答の開始は、病原体関連分子パターン（PAMP）の認識に依存し、かつ/または危険/損傷関連分子パターン（減衰させる）6,7。微生物の細胞壁の構成成分、その鞭毛、またはその脂質二重層6、最初に保存されている微生物の構造は、第二には、両方の放出された分子（ 例えば 、ATP 8）、改変されたタンパク質または改変された細胞プロセス9,10の他のマーカーが含まれています。両方のタイプの信号は、パターン分子の特異的結合の際に防御応答を導く一連の事象を活性化するパターン認識受容体（PRR）として指定されたタンパク質によって認識される。C.虫は tractaとして非常に有用であったBLEモデルは、宿主 - 病原体相互作用のさまざまな側面を分析するが、十分に理解されていない一つのことは、ワームに開始されるか免疫応答である。他の生物におけるパターン認識受容体（PRR）にオーソロガスである推定される受容体のどれものPAMPに結合することが示されておらず、他の生物における免疫応答のために極めて重要であるのPRRのオルソログの多くは、ワームの病原体応答に驚くほど限られた貢献度を示していると抵抗。例えば、グラム陽性病原体に抵抗するために不可欠であるショウジョウバエのToll受容体は、C言語で表現されているグラム陰性病原体ネズミチフス菌11からではなく、他のテストのグラム陰性からの保護に貢献する唯一のホモログ、TOL-1による線虫 、または陽性病原体11,12。これらの観察は、その免疫応答を示すデータと組み合わせる細胞のタンパク質翻訳hを破壊することによって誘導することができLEDなどのいくつかが提案することで虫は、主に減衰9,13,14を検出します。それにもかかわらず、免疫応答を誘導するために死んだ病原体の能力を記述するレポートは、PAMPの結合は、C.における病原体認識に重要な役割を有し得ることを示唆する虫 15,16。年齢に同期化された遺伝的に同一のCの免疫応答に焦点を当てたこれまでの研究虫集団は、細菌のグラム陰性病原体緑膿菌による腸のコロニー形成に大きな個体差を示した。
しかし、転写プロファイリング研究は、1事業体17,18として、これらの可変保菌集団を処理した。この変動を利用して、我々は、GFPを発現するPにさらさ線虫（Caenorhabditis elegans）の差別的植民集団を分離するための自動化されたwormsorterを中心にプロトコルを開発緑膿菌 。異なっ - 植民集団における遺伝子発現をFACI調べる病原体の負荷（および関連する損傷）との関係の評価と免疫応答をlitated とCに病原体認識についての新たな洞察を提供虫 19。下に我々はすべての蛍光標識された病原体に感染したワームのソートに適用することができるプロトコルを記述します。
潜在的なユーザーには、選別されることが必要虫数は、使用中のその後の分析およびプロトコルの性質に依存することに留意すべきである。例えば、マイクロアレイ遺伝子発現解析の場合には、>千のワームは、標準的なプロトコルが使用される場合、十分なRNAを得るために必要とするが、増幅が用いられる場合約100ワームが十分である、材料の迅速な収集を可能にし、従って、ストレスを最小限にするワーム。
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Protocol
1。ヤングアダルト動物の同期化された文化の取得
- OP50-1 E.を接種し、いくつかのNGMプレート上でワームを育てる大腸菌の細菌（10×飽和文化からの濃縮）、多くのワームは、妊娠の段階に達するまで。
- 同期された培養物（卵）を得るために卵プレップ液で妊娠動物を扱う。
- いくつかの60 mmのNGMプレート上のプレートの卵は、およそ150〜200の卵/プレートの密度で10倍に濃縮OP50-1を播種。
- （ - ヤングアダルト段階ワームは、L4に達するまで）2日間、25℃で培養する。
2。 緑膿菌版の作製やワームに感染
- 卵プレップ（ステップ1.1）の日に100μg/ mlの最終濃度王のB型メディアを含むリファンピシンの2ミリリットルにPA14 :: GFPの培養物に接種。攪拌O / Nで37℃で培養液を、
- PA14 :: GFP CULプレートアッセイに必要な数のスローキリングプレート（SKP）にTURE。各150ミリメートルSKPペトリ皿ピペットに75〜100飽和文化μlの滅菌ガラススプレッダーを使用して均一に広げる。 20〜24時間、37℃で培養する。
- インキュベーターからプレートを取り外し、それらを室温（〜20分）に冷却する。 M9緩衝液を使用して、PA14にステップ1.4からワームを洗っ:: GFPプレートを液体の最小容量の。 150mmプレートを使用する場合は、数百のワームは、単一のプレート上に配置することができる。
- 18〜21時間、25℃で培養する。 Pの緑膿菌に露出し、若い成虫は、これはnoncolonized動物VSコロニー形成の最適な分布を表示時間ウィンドウです。
3。 Wormsorterの設定
サンプルの並べ替えを実行する前に、マシンが正常に機能していることを確認してください。詳細はhttp://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43で得られた、と目することができますE基本的な手順は以下のとおりです。
- 約5 PSI（4.5〜5.5の範囲）にシースバルブの圧力設定を行ってください。
- そのシース流体流量が適切であることを確認ディスペンサーの下に15ミリリットルコニカルチューブを配置し、シースバルブをオンにし、ソーターバルブをオフにします。 60秒間、ディスペンサーの下にチューブを保持します。チューブ内のボリューム9-10 mlでなければならない。この範囲外である場合、それに応じてシース弁圧を調節する。
- （ステップ3.2と同様に設定）がシース液流量が正確な選別を可能にする確実40μmで調整粒子を使用してソート速度をテストする
- シースバルブをオフにします。貯水池への制御粒子溶液約25ミリリットルを追加します。
- シースバルブ、サンプルバルブをオンにします。
- コンピュータソフトウェア上で、「制御粒子モード」に移動して取得]をクリックします。
- 幅を近似するTOF（飛行時間）で、粒子流量は〜5-8粒子/秒であることを確認してください粒子の、40ミクロン。このようなTOFは、単一の40ミクロンのオブジェクトを一度に通過していることを示しています。値がこの範囲外である場合は、それに応じて（上記の指示に従う）設定を調整します。
4。 Noncolonizedワーム対植民仕分け
- M9を使用して、15 mlのコニカルチューブにワームを洗う。成虫は、重力によって、チューブの底に沈む、上清を除去することができます。新鮮なM9でチューブを埋める。このプロセスを3〜4倍を繰り返します。これは幼虫の大部分だけでなく、余分な細菌を除去し、約10分かかります。
- 優しく混合小さな攪拌棒付きwormsorterリザーバーにワームを追加します。
- 200に600にグリーンPMTを設定し、赤と黄色の光電子増倍管によって初期信号ゲインを調整します。
- 設定を調整するためのデータの収集を開始。
- 毎秒25〜30イベント（ワーム）のソート率を目指す。数字率が高すぎる場合、それに応じてM9と、リザーバ内のワームを希釈する。レートがある場合x低、M9の小さな体積でより多くのワームを追加します。
- 実験はnoncolonizedワームVSコロニー形成の非常に厳しい分離を必要とする場合は、「純粋な」から「一致確認」に設定します。これは、イベント内の2つのオブジェクトが互いに接近しすぎ発生した場合、または同じドロップで、機械ではなく、それを集めるよりも、ドロップを拒否していることを保証します。
- 関心の人口をソートするには、サイズ（成虫を得るために）と蛍光強度（noncolonizedのための低、コロニー形成のためのすなわち高い）を示す軸周りのゲートを描きます。蛍光ゲーの値は経験的に決定されなければならない。
- ワームの並べ替えを開始するためにソート弁を開放してワームを収集するために、マルチウェルプレートまたはディスペンサーの下にペトリ皿を置きます。
- ソートされた集団は、関心の集団であることを顕微鏡下で確認するために、動物の小集団を収集します。いない場合は、それに応じてゲーティングパラメータを調整し、サンプル収集を続行します。
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Representative Results
年齢をマッチさせた場合には、遺伝的に同一で虫はPにさらされている緑膿菌は 、広い分布がコロニー形成（ 図1A）のレベルで観察される。植民ワームからnoncolonizedの効率的な分離が（ 図1B）を達成することができ、ここで説明されたプロトコルの助けを借りて。 noncolonizedワームとは異なり、植民ワームは、低迷して減少し、排便19などの損傷の兆候を示している。後者は、ワームがPによって植民地化した理由かもしれ緑膿菌は困難、感染をクリアしています。これはnoncolonizedとしてソートワームが以前に定着していなかったことを示唆して記述されたプロトコルのための直接的な意味を持っています。直接この主張が正しいかどうかをテストするには、厳選された植民地化のワームは、仕分けの実験におけるものと同様の洗浄工程にかけ、その後、蛍光顕微鏡下で調べた。唯一の56分の4は、病原体をクリアしました。そのため、おそらく目ですnoncolonizedとしてソートものの中、以前に植民ワームの割合で無視できる。しかしながら、P.以外の病原体のための問題のよりていてもよく、分析上の誤ったソートの影響を防止するために、洗浄工程中のコロニー形成の変化を監視することが推奨される緑膿菌 。
マイクロアレイ遺伝子発現分析のために並べ替えられワームを使用し、P.と本質的に同一の応答を観察ここに記載のプロトコルを用いた以前の研究19時間同じ量の病原体にさらされていた保菌およびnoncolonizedウォーム集団における緑膿菌 図2 Cの一部であることが知られている、4つの遺伝子の発現を測定するために定量的（q）のRT-PCRを用いて、同様の傾向を示してい。虫免疫応答： のLys-2はリゾチーム、F08G5.6とF55G11.2感染に特異的に反応する2未同定の遺伝子であり、符号化し、最初にも感染に寄与するののTiON抵抗、およびPGP-5、感染だけでなく、重金属ストレスに応答します。すべての4つの遺伝子はPで、同様に誘導された関係なく、ワームの植民地状態の緑膿菌の曝露、。これは、代わりに信号としての病原体関連分子パターンを指し、コロニー形成およびそれに関連する損傷は、免疫応答に必要とされないことを示す以前に公表された結果を裏付ける。そのPGP-5は、Cの免疫応答と一般ストレス応答を制御する調節プログラムで重複を示唆している、大規模な被害を経験されることが期待されていないnoncolonized動物において誘導される虫 。
図1。植民地化とCを noncolonized 虫は wormsorteを使用して分離R（A）は、野生型の成人での代表的な画像GFPを発現するP.に露出エレガンス 18時間緑膿菌 。 noncolonizedと植民ワームの（B）の代表的な画像をwormsorterを使用して分離した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。植民地化は、Pに転写応答は必要ありません。 緑膿菌。E.に露出野生型動物において定量RT-PCRにより測定されたRNA のlys-2（A）のレベル、F08G5.6（B）、F55G11.2（C）、およびPGP-5（D）大腸菌またはP緑膿菌<〜18時間/ EM>。示す手段及び3を代表する一つの実験から、重複した測定値のSDである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
表1。材料とwormsorter実験に必要な試薬。
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Discussion
我々が説明する方法は、ワームとその環境の間の相互作用に従うこと、ワームの外実体の蛍光標識を利用しています。我々はこの場合、分離は、病原体のラベリングに基づいていたなし（または光）負荷のものとは重い病原体負荷でワームを分離するために用いられた。その後の遺伝子発現分析は、それらが病原体負荷とは無関係であったことを示唆している二つのグループの間の免疫応答において差は認められなかった。応答を開始する信号は、物理的に、この信号は、PAMPであり得ることを示唆し、むしろ分泌されるのではなく、細菌と関連していることが他の場所で示された。まとめると、これらの結果は、PAMP認識がC.免疫応答を開始する役割を果たしているという仮説を支持虫 19。
上述の選別プロトコルの一つの利点は、両方のコロニー形成及びnoncolonizedワームは、単一集団から単離されることである。目あるnoncolonized対植民地化された動物の最適配分と人口を持つに依存します。発明者らは、Pでヤングアダルト、野生型ワームに感染するとき緑膿菌は、これは、ほぼ18時間の曝露時間に相当する。この露光時間は、動物の大部分は「中間」程度に定着したが、数百のワームが完全な植民地化を示し、類似の数はnoncolonizedあった人口を生産した。これが我々の目的に最適な分布を表しているが、他の人は自分の最適配分を定義することもできます。
ソート中には、それぞれの実験に組み込まれた「品質管理」を持つことをお勧めします。我々は2つの方法でそれをした。一つは、遺伝子発現研究のために、我々は、遺伝子の限られたセットに定量RT-PCRのために使用され得る蛍光解剖顕微鏡下（コロニー形成及びnoncolonized）ワーム少数の手摘み。これらは、どのような遺伝子expressiための「ゴールドスタンダード」として機能本当に純粋な集団の上のようになります。第二に、期待通りに、機器が実行している蛍光顕微鏡下で確認するために、各自動的にソート集団プレートに20個以上のワームを並べ替えることをお勧めします。下流側のアプリケーションに応じて、選別プロトコルの「忠実度」の程度が異なるが必要とされ得る。並べ替えワームは植民地化の所望の程度に適合していない場合には、ゲーティングパラメータは（ステップ4.7）に調整する必要があります。これは、ゲートより厳しい必要ワーム、および実験のより高い初期数はそれに応じてスケールアップする必要があることに留意すべきである。
ここで説明する実験は、（それが蛍光タグ付けされている限り）関心のある任意の病原体に行うことができた。ソートに続いて、その後の分析は、遺伝子発現解析を遵守する必要はなく、生存あるいは行動分析に焦点を当てることができます。さらに、同様のプロトコルを、分析の目的に使用することができる、代謝物の吸収に従うには、または病原体の負荷を定量化するために、後者は20,21非常に多様でCFU計数に簡単な代替手段を提供する。数のと速度の増加は、遺伝ホストの中断または病原体、および異なる環境条件を含む様々な条件下での病原体の負荷を定量化する容易にすることができる。 wormsorterはコロニー形成を追跡し、複数の蛍光分子を検出するように装備することができるので、細菌の1種類に限定される必要はない。この機能により、さまざまな微生物が植民地化のために競争することができ、生態研究のために有用であろう。病因、Cの実験室での研究では虫は一般的に細菌の単一栽培を成長させる。しかし、病原体が免疫力に影響を与える可能性がある他の微生物の数百人の中に存在する野生の、中の自然免疫のメカニズムの研究が注目22,23を集めるために始めている。
要約すると、資料を使gで幅広い用途にwormsorter実験が短時間で、及び/又は大規模に行うことができる。このようなアプリケーションのレパートリーを拡大することでの我々の理解を進めることができ生理学エレガンス 。特に、Cの分野で虫自然免疫、生存率は種々の遺伝子の貢献をテストするための頻繁に使用されるメトリックです。しかし、植民地は、依然として機能的出力を提供しながら、免疫を開始するイベントに、より近接している。ここで説明するように関心のある集団を単離および/または分析するためのプロトコルを使用すると、ワームの免疫応答の初期事象のさまざまな側面を研究するための貴重なツールです。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、彼らのサポートのためにエリソン医療財団に感謝します。私たちは、wormsorterを使用しての支援のためのアビーデルンブルク研究室のメンバーに感謝したいとも。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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