Summary
Den wormsorter letter genetiske skjermer i Caenorhabditis elegans ved å sortere ormer ifølge uttrykk for fluorescerende reportere. Her beskriver vi en ny bruk: sortering i henhold til kolonisering av en GFP-uttrykke patogen, og vi bruker den til å undersøke dårlig forstått rolle patogen anerkjennelse i å initiere immunresponser.
Abstract
Den wormsorter er et instrument som er analog med FACS en maskin som blir brukt i studier av Caenorhabditis elegans, typisk for å sortere ormer basert på ekspresjon av en fluorescerende reporter. Her markerer vi en alternativ bruk av dette instrumentet, for sortering ormer i henhold til deres grad av kolonisering av en GFP-uttrykke patogen. Denne nye bruken tillot oss å ta opp forholdet mellom kolonisering av ormen tarmen og induksjon av immunresponser. Mens C. elegans immunresponser mot forskjellige patogener har blitt dokumentert, det er fortsatt ukjent hva som initierer dem. De to viktigste muligheter (som ikke er gjensidig utelukkende) er anerkjennelse av patogen-assosiert molekylære mønstre, og påvisning av skade forårsaket av infeksjon. For å skille mellom de to mulighetene, må eksponeringen mot patogen være skilt fra skaden den forårsaker. Den wormsorter aktivert separasjon av ormer som ble utstrakt-kolonisert av Gram-negative patogene Pseudomonas aeruginosa, med skaden sannsynligvis forårsaket av patogen belastning, fra ormer som ble eksponert på samme måte, men ikke, eller marginalt, kolonisert. Disse distinkte populasjoner ble brukt for å bedømme forholdet mellom patogenet belastning og induksjon av transkripsjonelle immunresponser. Resultatene tyder på at de to er skilt, støtter muligheten for patogen anerkjennelse.
Introduction
Automatisk sortering orm er mye som FACS, som opererer ved å måle et fluorescerende signal på en snekke (typisk ved hjelp av transgen ekspresjon av rapportør proteiner) når den passerer utbrettet i et rør, slik at omdirigering enten til en oppsamlingsrøret / brønn eller til en avfallsbeholder ifølge å gating parametre satt av forskeren en. Den wormsorter kan rette for forskning på mange måter, et eksempel for å ansette den som et analytisk verktøy er en studie som fulgte Spatiotemporal mønstre av promoter aktivitet for nesten 1000 gener to.
Imidlertid er den viktigste bruk av wormsorter i genetiske skjermer, som følge målet genekspresjon nivåer eller lokalisering av fluorescerende protein langs aksen av spiralen 3-5.
Her beskriver vi en ny søknad om wormsorter, i følge kolonisering av ormen av en fluorescently merket patogen. Med dette som et verktøy vi fokusert på forholdet mellom patogeneno kolonisering / belastning og immunrespons, for å få ny innsikt i mekanismene som er ansvarlig for initiering av immunresponser i ormen.
I nesten alle organismer studert til dags dato, initiering av medfødte immunresponser mot mikrobielle patogener avhenger anerkjennelse av patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs), og / eller fare / skade-forbundet molekylære mønstre (demper) 6,7. Den første er bevart mikrobielle strukturer som inkluderer komponenter av den mikrobielle celleveggen, sin flagellen, eller dens lipidbilag 6, den andre, inkluderer både utgitt molekyler (f.eks ATP 8), endrede proteiner eller andre markører av endrede cellulære prosesser 9,10. Begge typer av signaler blir gjenkjent av proteiner som er utpekt til mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs), som ved spesifikk binding av et mønster molekyl aktiverer en kjede av hendelser som fører til en beskyttende respons. C. elegans har vært svært nyttig som en tractalig modell for å dissekere ulike aspekter av host-patogen interaksjoner, men en ting som ikke er godt forstått er hvordan immunresponser er initiert i ormen. Ingen av de putative reseptorer som er ortologe til mønstergjenkjennings reseptorer (PRRs) i andre organismer er blitt vist å binde PAMPs, og mange av de orthologs av PRRs som er avgjørende for immunresponser i andre organismer viser en overraskende begrenset bidrag til snekke patogene responser og motstand. For eksempel er Drosophila Toll-reseptoren, noe som er viktig for å motstå Gram-positive patogener, representert i C. elegans av en eneste homolog, tol-en, noe som bidrar til beskyttelse mot Gram negative patogen Salmonella Typhimurium 11, men ikke fra andre testede Gram-negative, eller-positive patogener 11,12. Disse observasjonene, kombinert med data som indikerer at immunresponser kan bli indusert ved å forstyrre celleprotein oversettelses hsom ledet noen til å foreslå at C. elegans primært oppdager DAMPS 9,13,14. Likevel, rapporter som beskriver evne til døde patogener å indusere immunresponser tyder på at PAMP binding kan ha en viktig rolle i patogen anerkjennelse i C. elegans 15,16. Tidligere arbeid med fokus på immunresponser i alders synkronisert genetisk identiske C. elegans populasjoner, viste stor individuell variasjon i intestinal kolonisering av bakteriell Gram-negative patogen Pseudomonas aeruginosa.
Men transcriptional profilering studier behandlet disse variabelt-koloniserte befolkninger som en enhet 17,18. Benytte seg av denne variasjonen, utviklet vi en protokoll som fokuserer en automatisert wormsorter å skille differentially kolonis bestander av Caenorhabditis elegans utsatt for GFP-uttrykke P. aeruginosa. Undersøke genuttrykk i annerledes-koloniserte befolkninger Facilitated vurdering av forholdet mellom patogen belastning (og tilhørende skader) og immunresponser og gitt ny innsikt om patogen anerkjennelse i C. elegans 19. Nedenfor beskriver vi protokollen, som kan brukes til å sortere ormer smittet med noe fluorescensmerkede patogen.
Til potensielle brukere det bør bemerkes at antall ormer som kreves for å bli sortert ut, avhenger av arten av de etterfølgende analyser og protokoller i bruk. For eksempel, i det tilfelle mikromatrise genekspresjonsanalyse av,> 1000 ormer vil være nødvendig for å oppnå tilstrekkelig RNA, hvis standard protokoller benyttes, men ~ 100 ormer vil være tilstrekkelig hvis forsterkning er ansatt, slik at hurtig samling av materiale og dermed minimalisere stress ormer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Innhenting av en synkronisert Kultur Unge voksne dyr
- Grow ormer på flere NGM plater seeded med OP50-en E. coli-bakterier (10x konsentrert fra en mettet kultur) før mange ormer har nådd gravid stadium.
- Unn av gravid dyr med egg-prep løsning for å få et synkronisert kultur (egg).
- Plate egg på flere 60-mm NGM plater podet med 10x konsentrert OP50-1 med en tetthet på omtrent 150 til 200 egg / plate.
- Inkuber platene ved 25 ° C i 2 dager (inntil ormer har nådd L4 - Unge voksne stadiet).
2. Forbereder Pseudomonas aeruginosa Plater og infiserer Worms
- På dagen for egg-prep (trinn 1.1) inokulere en PA14 :: GFP kultur i 2 ml Kings B medium inneholdende rifampicin i en endelig konsentrasjon på 100 pg / ml. Inkuber kulturen ved 37 ° C under omrøring O / N.
- Plate på PA14 :: GFP Culture på så mange Slow Killing plater (SKP) som er nødvendig for analysen. På hver 150 mm SKP petriskål pipette 75-100 mL mettet kultur og fordeles jevnt ved hjelp av en steril glass sprederen. Inkuber platene ved 37 ° C i 20-24 timer.
- Fjerne platene fra inkubatoren og tillate dem å avkjøle til romtemperatur (~ 20 min). Ved hjelp av M9 buffer, vaske-ormer fra trinn 1,4 til PA14 :: GFP platene i et minimalt væskevolum. Ved bruk av 150 mm-plater kan flere hundre ormer plasseres på en enkelt plate.
- Inkuber platene ved 25 ° C i 18-21 timer. For P. aeruginosa-eksponerte unge voksne ormer, er dette tiden vindu som viser den optimale fordelingen av koloniserte vs noncolonized dyr.
Tre. Sette opp Wormsorter
Før du utfører prøven sortere, sikre at maskinen fungerer som den skal. Detaljer kan fås ved http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, og the viktige skritt er beskrevet nedenfor.
- Still skjede ventilen trykket til ca 5 psi (4,5-5,5 range).
- For å kontrollere at skjede fluidumstrømningsovergangsområde er hensiktsmessig, plassere en 15 ml konisk tube under dispenseren, slå på skjede ventilen, og slå av sorter ventil. Holde røret under dispenseren for 60 sek. Volumet i røret bør være 9-10 ml. Hvis det er utenfor dette området, justere skjede ventilen trykket tilsvarende.
- For å sikre at skjede fluidumstrømningsovergangsområde (satt som i trinn 3.2) vil tillate nøyaktig sortering, teste den slags hastighet ved hjelp av 40 mikrometer kontroll partikler:
- Slå av sliren ventil. Til omtrent 25 ml av kontroll partikkel-løsning til reservoaret.
- Slå på kappen ventilen og prøveventilen.
- På dataprogramvare, naviger til "kontroll partikkel-modus" og klikk anskaffe.
- Pass på at partikkelmengden er ~ 5-8 partikler / sek, med en TOF (Time Of Flight) tilnærmet breddentil partikkelen, 40 mikrometer. En slik TOF angir at bare en eneste 40 mikrometer objektet passerer gjennom på en gang. Dersom verdiene er utenfor dette området, justere innstillingene (følger instruksjonene ovenfor) tilsvarende.
4. Sortering Kolonisert vs Noncolonized Worms
- Ved hjelp av M9, vaske ormer inn i 15-ml koniske rør. Tillat voksne ormer for å synke til bunnen av røret ved hjelp av gravitasjon og fjern supernatanten. Fyll røret med ferskt M9. Gjenta denne prosessen 3-4x. Dette fjerner en stor andel av larver, så vel som mange bakterier og tar omtrent 10 min.
- Legg ormer til wormsorter reservoar med en forsiktig-miksing liten oppsikt bar.
- Juster innledende signal gevinst ved å sette den grønne PMT til 600 og den røde og gule PMT til 200.
- Begynn å skaffe data for å justere innstillingene.
- Sikt på en slags hastighet på 25-30 hendelser (ormer) per sekund. Hvis tallet frekvensen er for høy, fortynnes ormer i reservoaret med M9 deretter. Hvis hastigheten er foro lav, tilsett mer ormer i et lite volum av M9.
- Hvis forsøket krever en svært streng separasjon av koloniserte vs noncolonized ormer, sett "tilfeldighet sjekk" til "ren". Dette sikrer at i tilfelle to gjenstander forekommer for nær hverandre eller i samme slipp, avviser maskinen fallet i stedet for å samle den.
- For å sortere befolkningen av interesse, tegne porter rundt aksene indikerer størrelsen (for å få voksne ormer) og fluorescens intensitet (dvs. høy for kolonisert, lav for noncolonized). Verdiene for fluorescens gating må bestemmes empirisk.
- Plasser en multi-brønn-plate eller en petriskål under dispenseren for å samle ormer åpne sorterings ventilen til å begynne sortering ormer.
- Samle en liten bestand av dyr for å verifisere under mikroskopet at sortert befolkningen er befolkningen av interesse. Hvis ikke, juster gating parametre i henhold til og fortsette med prøveinnsamlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når alders matchet, genetisk identiske C. elegans er utsatt for P. aeruginosa, er en bred fordeling observert i nivåer av koloniseringen (figur 1A). Med hjelp av den protokoll som er beskrevet her for effektiv separasjon av noncolonized fra kolonis ormer kan oppnås (figur 1B). I motsetning noncolonized ormer, kolonis ormer viser tegn på skade, slik som treghet og redusert avføring 19. Sistnevnte kan være en grunn til at ormer kolonisert av P. aeruginosa har vanskeligheter med å rydde infeksjon. Dette har direkte konsekvenser for den beskrevne protokollen som tyder på at ormer sortert som noncolonized tidligere ikke var kolonisert. Å direkte teste om denne påstanden er riktig, ble håndplukket kolonis ormer utsatt for liknende vasketrinn som de i sortering forsøket og senere undersøkt under et fluorescerende mikroskop, bare 4/56 ryddet patogen. Derfor er det sannsynlig thpå hvor stor andel av tidligere koloniserte ormer blant de sorteres som noncolonized er ubetydelig. Men, er det tilrådelig å overvåke endringer i kolonisering under vask skritt for å hindre effekten av feilaktig sortering på analyse, som kan være mer av et problem for andre patogener enn P. aeruginosa.
Tidligere arbeid ansette protokollen beskrevet her brukt sortert ormer for en microarray analyse av genuttrykk og observert i hovedsak identiske svar på P. aeruginosa i koloniserte og noncolonized orm populasjoner som hadde blitt utsatt for patogenet for samme tidsperiode 19. Figur 2 viser den samme trenden ved hjelp av kvantitative (q) RT-PCR for å måle uttrykket av fire gener, kjent for å være en del av C . elegans immunrespons: LYS-2 koder for et lysozym, F08G5.6 og F55G11.2 er to uncharacterized gener, som reagerer spesielt til infeksjon, hvorav den første bidrar også til infeksjon motstand, og PGP-5 som reagerer på infeksjon så vel som for tungt metall stress. Alle fire gener ble indusert på samme måte ved P. aeruginosa eksponering, uavhengig av statusen for kolonisering ormer. Dette bekrefter tidligere publiserte resultater som indikerer at kolonisering og tilhørende skader ikke er nødvendig for en immunrespons, i stedet peke på patogen-assosiert molekylære mønstre som signalet. At pgp-5 er indusert i noncolonized dyr, som ikke forventes å ha oppstått omfattende skader, antyder en overlapping i de regulatoriske programmer som kontrollerer immunreaksjoner og generelle stressresponser i C. elegans.
Figur 1. Kolonisert og noncolonized C. elegans skilt ved en wormsorter.. (A) Representative bilde av villtype voksen C. elegans utsatt for GFP-uttrykke P. aeruginosa i 18 timer. (B) Representative bilder av en noncolonized og koloniserte ormer skilles fra hverandre med wormsorter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Colonization er ikke nødvendig for transkripsjons respons på P. aeruginosa. RNA-nivåer av lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), og PGP-5 (D) måles ved QRT-PCR i villtype-dyrene utsettes for E. coli eller P. aeruginosa </ Em> for ~ 18 hr. Vist er midler og SD dupliserte målinger fra ett eksperiment, som er en representant for tre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Materialer og reagenser som trengs for en wormsorter eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden vi beskrive utnytter fluorescerende merking av enheter utenfor ormen, for å følge samspillet mellom ormen og dens omgivelser. I tilfelle vi presenterer, ble separasjon basert på merking av et patogen og ble ansatt til separate ormer med tung patogen last fra de med ingen (eller lys) belastning. Etterfølgende genekspresjonsanalyser fant ingen forskjell i immunresponser mellom de to gruppene som tyder på at de var uavhengige av patogen belastning. Det signal som initierer reaksjonen ble vist andre steder for å være fysisk assosiert med bakterier, heller enn å bli utskilt, noe som tyder på at dette signal kan være et PAMP. Sammen utgjør disse resultatene støtter hypotesen om at PAMP anerkjennelse spiller en rolle i å initiere immunrespons i C. elegans 19.
En fordel av sorteringsprotokoll som er beskrevet ovenfor, er at både kolonisert og noncolonized ormer er isolert fra en enkelt populasjon. Ther avhengig av å ha en befolkning med en optimal fordeling av dyr som er kolonisert vs noncolonized. Vi har funnet ut at når infisere ung-voksen, vill type ormer med P. aeruginosa, tilsvarte dette til en eksponeringstid på omtrent 18 timer. Denne eksponeringen-tiden produsert en befolkning der flertallet av dyrene ble kolonisert til en "middels" grad, men flere hundre ormer viste fullt kolonisering, og et tilsvarende antall ble noncolonized. Selv om dette representerer optimal distribusjon for våre formål, mens andre kan definere sine egne optimal fordeling.
Under sortering, er det lurt å ha "kvalitetskontroller" innebygd i hvert forsøk. Vi gjorde det på to måter. En, for genekspresjon studiene har vi håndplukket et lite antall (kolonisert og noncolonized) ormer under et fluorescent disseksjonsmikroskop, som kan brukes for QRT-PCR på et begrenset sett av gener. Disse fungerer som "gullstandarden" for hva genet expressipå i en virkelig ren befolkningen ville se ut. Dernest er det god praksis å sortere 20 eller flere ormer til en plate for hver sorteres automatisk befolkningen til å kontrollere under et fluorescerende mikroskop at instrumentet fungerer som forventet. Avhengig av den nedstrøms anvendelse, kan forskjellige grader av "gjengivelse" av sorteringsprotokoll være nødvendig. Når sortert ormer ikke svarer til den ønskede grad av kolonisering, bør gating parametre justeres (trinn 4.7). Det skal bemerkes at jo mer strenge portene, må jo høyere det opprinnelige antall ormer som trengs, og eksperimenter bli skalert opp tilsvarende.
Eksperimentet som er beskrevet her kan gjennomføres med en hvilken som helst patogen av interesse (så lenge som det er fluorescensmerket). Etter sortering, trenger påfølgende analyser ikke trenger å forholde seg genekspresjonsanalyser til, og kunne fokusere på overlevelse eller atferdsanalyse. Videre kan tilsvarende protokoller brukes for analytiske formål, For å følge metabolitt absorpsjon, eller for å kvantifisere patogen belastning, idet sistnevnte gir en enklere alternativ til CFU teller, som er svært variabel 20,21. Økningen i antall og i fart kan lette kvantifisere patogen belastning under ulike forhold, blant annet genetiske forstyrrelser i verten eller patogenet, og ulike miljøforhold. Dessuten, siden den wormsorter kan være utstyrt for å detektere flere fluorescerende molekyler, sporing kolonisering behøver ikke å være begrenset til en enkelt type bakterier. Denne evnen vil være nyttig for økologiske studier, slik at forskjellige mikrober til å konkurrere for kolonisering. I laboratoriestudier av patogenesen, C. elegans blir vanligvis dyrket i et bakterielt monokultur. Men, er studiet av mekanismer for medfødt immunitet i naturen, hvor patogener eksisterer blant hundrevis av andre mikroorganismer som kan påvirke immunforsvaret begynner å få oppmerksomhet 22,23.
I sammendraget, using den wormsorter for et bredt spekter av anvendelser tillater forsøk som skal utføres i løpet av kort tid, og / eller i stor skala. Utvide repertoar av slike søknader kunne fremme vår forståelse av C. elegans fysiologi. Spesielt innen C. elegans medfødt immunitet, er overlevelse en ofte brukt metriske for testing av bidrag fra ulike gener. Imidlertid er kolonisering mer proksimalt for de hendelser som setter i gang immunitet og fortsatt gi en funksjonell utgang. Ved hjelp av protokoller som beskrevet her for å isolere og / eller analysere bestander av interesse er et verdifullt verktøy for å studere ulike aspekter av de tidlige hendelsene i immunresponser i ormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ellison Medical Foundation for deres støtte. Vi ønsker også å takke medlemmene av Abby Dernburg laboratorium for å få hjelp med å bruke wormsorter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
- Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
- Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
- Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
- McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
- Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
- Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
- Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
- Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
- Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).
