Summary
Il wormsorter facilita schermi genetiche in Caenorhabditis elegans di classificare vermi secondo l'espressione di giornalisti fluorescenti. Qui, descriviamo un nuovo utilizzo: ordinamento secondo la colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono, e ci avvaliamo di esaminare il ruolo poco compreso del riconoscimento patogeno in avvio risposte immunitarie.
Abstract
Il wormsorter è uno strumento analogo ad una macchina FACS che viene utilizzato in studi di Caenorhabditis elegans, tipicamente per ordinare vermi basato su espressione di un reporter fluorescente. Qui, si evidenzia un uso alternativo di questo strumento, per l'ordinamento vermi in base al loro grado di colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono. Questo nuovo utilizzo ci ha permesso di affrontare il rapporto tra la colonizzazione dell'intestino verme e induzione di risposte immunitarie. Mentre C. elegans risposte immunitarie a diversi agenti patogeni sono stati documentati, non si sa ancora che cosa li avvia. Le due possibilità principali (che non si escludono a vicenda) sono il riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni, e la rilevazione dei danni causati da infezione. Per distinguere tra le due possibilità, l'esposizione al patogeno deve essere dissociata dai danni che provoca. Il permesso wormsorter separazione dei vermi che sono stati ampiamente-colonizzata dai Gram-npatogeno egative Pseudomonas aeruginosa, con danni probabilmente causato da un carico patogeno, da vermi che sono stati esposti in modo simile, ma non, o marginalmente, colonizzato. Queste popolazioni distinte sono stati usati per valutare il rapporto tra carico patogeno e l'induzione di risposte immunitarie trascrizionali. I risultati suggeriscono che i due sono dissociate, supportando la possibilità di riconoscimento patogeno.
Introduction
Smistamento automatico verme è molto simile FACS, operando misurando un segnale fluorescente in una vite senza fine (tipicamente fornita dai transgenici espressione di proteine reporter) che passa raddrizzato in un tubo, consentendo il reindirizzamento sia ad un tubo di raccolta / pozzetto o ad un contenitore per rifiuti secondo di gating parametri fissati dal ricercatore 1. Il wormsorter può facilitare la ricerca in molti modi, un esempio di impiegare come uno strumento analitico è uno studio che ha seguito i modelli spazio-temporali di attività del promotore per quasi 1.000 geni 2.
Tuttavia, il principale uso del wormsorter è in schermi genetici, seguendo bersaglio livelli di espressione di geni o localizzazione di proteina fluorescente lungo l'asse del verme 3-5.
Qui, descriviamo una nuova applicazione per la wormsorter, nel seguire la colonizzazione del worm da un agente patogeno fluorescente tag. Con questo come uno strumento ci siamo concentrati sul rapporto tra pathogen colonizzazione / carico e la risposta immunitaria, per acquisire nuove conoscenze sui meccanismi responsabili per l'inizio delle risposte immunitarie nel verme.
In quasi tutti gli organismi studiati fino ad oggi, l'inizio delle risposte immunitarie innate di agenti patogeni microbici dipende dal riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), e / o modelli molecolari di pericolo / danno-associato (smorza) 6,7. Le strutture microbiche primi sono conservati che includono componenti della parete cellulare microbica, il suo flagello, o il suo doppio strato lipidico 6, la seconda, comprendono sia molecole rilasciate (ad esempio ATP 8), proteine alterate o altri marcatori di processi cellulari alterati 9,10. Entrambi i tipi di segnali sono riconosciuti da proteine designati come recettori di pattern recognition (PRR), che su specifica di legame di una molecola modello di attivare una catena di eventi che conducono ad una risposta protettiva. C. elegans è stato estremamente utile come tractamodello bile sviscerare i vari aspetti delle interazioni ospite-patogeno, ma una cosa che non è ben compreso è come risposte immunitarie sono iniziati nel verme. Nessuno dei recettori putativi che sono orthologous ai recettori pattern recognition (PRR) in altri organismi hanno dimostrato di legare PAMPs, e molti degli ortologhi di PRRs che sono cardine per le risposte immunitarie in altri organismi mostrare un contributo sorprendentemente limitato a risposte verme patogeni e resistenza. Per esempio, il recettore Toll Drosophila, che è essenziale per resistere patogeni Gram positivi, è rappresentato in C. elegans da una suola omologo, tol-1, che contribuisce alla protezione dal patogeno Gram-negativo Salmonella Typhimurium 11, ma non da altre testate Gram-negativi, patogeni o-positivi 11,12. Queste osservazioni, combinato con i dati che indicano che le risposte immunitarie potrebbe essere indotta da interrompendo proteina cellulare traduzione hcome indotto alcuni a suggerire che C. elegans rileva principalmente smorza 9,13,14. Tuttavia, i rapporti capacità degli agenti patogeni morti per indurre risposte immunitarie descrivono suggerire che PAMP legame può essere ha un ruolo importante nel riconoscimento patogeno in C. elegans 15,16. Il lavoro precedente concentrandosi sulle risposte immunitarie in età sincronizzato geneticamente identici C. elegans popolazioni, hanno dimostrato grande variabilità individuale nella colonizzazione intestinale da parte dei batteri Gram-negativi patogeno Pseudomonas aeruginosa.
Tuttavia, gli studi di profilatura trascrizionale trattate queste popolazioni variabile colonizzati come un'unica entità 17,18. Approfittando di questa variabilità, abbiamo sviluppato un protocollo di messa a fuoco di un wormsorter automatizzato per separare le popolazioni colonizzate differenziale di Caenorhabditis elegans esposti a GFP che esprimono P. aeruginosa. Esaminando l'espressione genica in popolazioni diversamente colonizzate FACIla valutazione litated del rapporto tra carico patogeno (e il danno associato) e le risposte immunitarie e nuove intuizioni fornite circa il riconoscimento dei patogeni in C. elegans 19. Qui di seguito descriviamo il protocollo, che potrebbe essere applicato per ordinare i vermi infettati con qualsiasi agente patogeno fluorescente.
Per utenti potenziali occorre notare che il numero di vermi che devono essere risolti dipende dalla natura delle analisi successive e protocolli in uso. Ad esempio, nel caso di analisi di espressione genica microarray,> 1.000 vermi dovranno avere abbastanza RNA, se si utilizzano protocolli standard, ma ~ 100 vermi sarebbero sufficienti se l'amplificazione è impiegato, consentendo veloce raccolta di materiale e riducendo al minimo lo stress a i vermi.
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Protocol
1. Ottenere una cultura sincronizzata di giovane adulto animali
- Crescere vermi in diverse piastre NGM seminato con OP50-1 E. coli, batteri (10x concentrata da una cultura satura) fino a molti worm hanno raggiunto la fase gravida.
- Trattare gli animali gravide con la soluzione di uovo-prep per ottenere una coltura sincronizzata (uova).
- Uova Piatto su diversi 60 mm piastre NGM seminato con 10x OP50-1 concentrato ad una densità di circa 150-200 uova / piastra.
- Incubare le piastre a 25 ° C per 2 giorni (fino vermi hanno raggiunto la L4 - Giovani stadio adulto).
2. Preparazione Pseudomonas aeruginosa Piatti e infettare Worms
- Il giorno dell'uovo-prep (passo 1.1) inoculare una coltura PA14 :: GFP in 2 ml di B supporti contenenti rifampicina re ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione O / N.
- Piatto il PA14 :: GFP culTure su altrettanti piatti Uccidere lenta (SKP) come necessario per il saggio. Su ogni 150 millimetri SKP Petri dish pipetta 75-100 ml di cultura satura e diffondere uniformemente con una spatola di vetro sterile. Incubare le piastre a 37 ° C per 20-24 ore.
- Rimuovere le piastre da incubatore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (~ 20 min). Utilizzando tampone M9, lavare i vermi dal passaggio 1.4 su PA14 :: piastre GFP in un volume minimo di liquido. Quando si utilizzano piastre da 150 mm, diverse centinaia di vermi possono essere posizionati su un unico piatto.
- Incubare le piastre a 25 ° C per 18-21 ore. Per P. vermi adulti giovani aeruginosa esposte, questa è la finestra temporale visualizza la distribuzione ottimale delle colonizzato vs animali non colonizzato.
3. Impostazione del Wormsorter
Prima di eseguire il campione tipo, assicurarsi che la macchina sta funzionando correttamente. I dettagli possono essere ottenuti presso http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, e THe passaggi essenziali sono riportate qui di seguito.
- Impostare la pressione della valvola guaina a circa 5 psi (4,5-5,5 range).
- Per verificare che la portata del liquido guaina è opportuno posizionare un tubo da 15 ml sotto l'erogatore, attivare la valvola di guaina, e spegnere la valvola selezionatrice. Tenere il tubo sotto il dispenser per 60 sec. Il volume del tubo deve essere 9-10 ml. Se è fuori di questo intervallo, regolare la pressione della valvola guaina di conseguenza.
- Per garantire che la portata del liquido guaina (impostato come nel passaggio 3.2) consentirà un'accurata selezione, verificare il tasso di ordinamento mediante 40 particelle micron di controllo:
- Spegnere la valvola guaina. Aggiungere circa 25 ml di soluzione di particella controllo al serbatoio.
- Aprire la valvola guaina, e la valvola di campionamento.
- Sul software per computer, passare alla modalità "particella di controllo" e fare clic acquisire.
- Assicurarsi che il flusso di particelle è ~ 5-8 particelle / sec, con una TOF (Time Of Flight) approssimare la larghezzadella particella, 40 pm. Tale TOF indica che solo un singolo 40 pm oggetto attraversa alla volta. Se i valori sono al di fuori di questo intervallo, regolare le impostazioni (seguendo le indicazioni di cui sopra) di conseguenza.
4. Ordinando Colonizzato vs non colonizzato Worms
- Utilizzando M9, lavare i vermi in tubi conici da 15 ml. Consentire vermi adulti depositarsi sul fondo della provetta per gravità e rimuovere il surnatante. Riempire il tubo con fresche M9. Ripetere questo processo in 3-4x. Ciò elimina gran parte delle larve e batteri in eccesso e dura circa 10 min.
- Aggiungi vermi al serbatoio wormsorter con un dolcemente mescolando piccola ancoretta.
- Regolare il guadagno iniziale del segnale impostando la PMT verde a 600 e il rosso e giallo PMT a 200.
- Iniziare l'acquisizione di dati per regolare le impostazioni.
- Obiettivo per un tasso sorta di 25-30 eventi (vermi) al secondo. Se il tasso di numero è troppo alta, diluire i vermi nel serbatoio con M9 conseguenza. Se il tasso è quelloo bassa, aggiungere più vermi in un piccolo volume di M9.
- Se l'esperimento richiede una separazione molto rigorosa colonizzato vs vermi non colonizzato, impostare il "controllo di coincidenza" a "puro". Ciò garantisce che, in caso si verificano due oggetti troppo vicini l'uno all'altro oppure nella stessa caduta, la macchina rifiuta la goccia anziché raccogliendola.
- Per ordinare la popolazione di interesse, disegnare cancelli intorno agli assi che indicano le dimensioni (per ottenere vermi adulti) e intensità di fluorescenza (cioè alto per colonizzata, basso per non colonizzato). I valori di fluorescenza gating devono essere determinati empiricamente.
- Posizionare un piatto multi-pozzo o una capsula di Petri sotto l'erogatore per raccogliere i vermi quindi aprire la valvola di ordinamento per iniziare l'ordinamento vermi.
- Raccogliere una piccola popolazione di animali per verificare al microscopio che la popolazione filtrate è la popolazione di interesse. In caso contrario, regolare i parametri di gating di conseguenza e continuare con la raccolta di campioni.
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Representative Results
Quando pari età, geneticamente identici C. elegans sono esposti a P. aeruginosa, un'ampia distribuzione si osserva nei livelli di colonizzazione (Figura 1A). Con l'aiuto del protocollo qui descritto separazione efficiente di non colonizzato da vermi colonizzati può essere raggiunto (Figura 1B). A differenza dei worm non colonizzato, worm colonizzati mostrano segni di danni, come la lentezza e ridotto defecazione 19. Quest'ultimo può essere un motivo per cui i vermi colonizzate da P. aeruginosa hanno difficoltà di compensazione infezione. Questo ha implicazioni dirette per il protocollo descritto suggerendo che i vermi filtrate come non colonizzato non sono stati precedentemente colonizzati. Per testare direttamente se questa affermazione è corretta, vermi colonizzati raccolte a mano sono stati sottoposti a fasi di lavaggio analoghe a quelle nell'esperimento smistamento e successivamente esaminati al microscopio a fluorescenza; solo 4/56 eliminato l'agente patogeno. Pertanto, è probabile thla proporzione di vermi precedentemente colonizzati tra quelle classificate come non colonizzato è trascurabile. Tuttavia, si consiglia di monitorare i cambiamenti nella colonizzazione durante le fasi di lavaggio per evitare effetti di smistamento scambiato per l'analisi, che possono essere più di un problema per altri patogeni di P. aeruginosa.
Impieghi precedenti impiegando il protocollo descritto qui utilizzato vermi filtrate per una analisi di espressione genica microarray e osservate risposte sostanzialmente identici a P. aeruginosa nelle popolazioni verme colonizzati e non colonizzato che erano stati esposti al patogeno per la stessa quantità di tempo 19. Figura 2 mostra la stessa tendenza utilizzando quantitativa (q) RT-PCR per misurare l'espressione di quattro geni, noti per essere parte della C . elegans risposta immunitaria: lys-2 codifica una lisozima, F08G5.6 e F55G11.2 sono due geni non ancora caratterizzati, che rispondono specificamente alle infezioni, di cui il primo contribuisce anche a infezioniresistenza zione, e pgp-5, che risponde alle infezioni e allo stress da metalli pesanti. Tutti e quattro i geni sono stati indotti in modo analogo da P. esposizione aeruginosa, indipendentemente dallo stato di colonizzazione dei vermi. Questo conferma i risultati precedentemente pubblicati indicano che la colonizzazione e il suo danno associato non sono necessari per una risposta immunitaria, invece punta a pattern molecolari associati ai patogeni come il segnale. Che pgp-5 è indotta negli animali non colonizzato, che non si prevede siano sperimentare ingenti danni, suggerisce una sovrapposizione nei programmi di regolamentazione controllano le risposte immunitarie e le risposte generali di stress in C. elegans.
Figura 1. Colonizzato e non colonizzato C. elegans separazione tramite un wormsorter. (A) Immagine rappresentativa della wild-type adulto C. elegans esposti a GFP che esprimono P. aeruginosa per 18 ore. (B) Immagini rappresentative di un worm non colonizzato e colonizzati separati utilizzando il wormsorter. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Colonizzazione non è richiesta per la risposta trascrizionale di P. aeruginosa. livelli di RNA di Lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), e pgp-5 (D), misurata mediante qRT-PCR in wild-type animali esposti a E. coli o P. aeruginosa </ Em> per ~ 18 ore. Vengono mostrati i mezzi e SD di misurazioni duplicati da un esperimento, che è un rappresentante di tre. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Materiali e reagenti necessari per un esperimento wormsorter.
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Discussion
Il metodo descriviamo approfitta marcatura fluorescente di entità esterna della vite senza fine, di seguire le interazioni tra la vite e il suo ambiente. Nel caso che presentiamo, la separazione è basata sull'etichettatura di un agente patogeno ed è stato impiegato per vermi separati con carico agente patogeno pesante da quelli senza (o luce) del carico. Successiva analisi di espressione genica trovato alcuna differenza nella risposta immunitaria tra i due gruppi suggerendo che fossero indipendenti carico patogeno. Il segnale che avvia la risposta è stato mostrato altrove per essere fisicamente associate con i batteri, invece di essere secreta, suggerendo che questo segnale può essere un PAMP. Insieme, questi risultati supportavano l'ipotesi che il riconoscimento PAMP gioca un ruolo nell'iniziare risposta immunitaria in C. elegans 19.
Un vantaggio del protocollo ordinamento sopra descritto è che sia colonizzato e vermi non colonizzato sono isolati da una singola popolazione. Thè dipende da avere una popolazione con una distribuzione ottimale degli animali che vengono colonizzati vs non colonizzato. Abbiamo scoperto che quando infettare giovane-adulto, wild type vermi con P. aeruginosa, questo corrisponde a un tempo di esposizione di circa 18 ore. Questa esposizione in tempo prodotto una popolazione in cui la maggior parte degli animali sono stati colonizzati ad un livello "intermedio", ma diverse centinaia di vermi ha mostrato piena colonizzazione, e un numero simile è stato non colonizzato. Anche se questo rappresenta una distribuzione ottimale per i nostri scopi, altri possono definire la propria distribuzione ottimale.
Durante l'ordinamento, è consigliabile avere "controlli di qualità" incorporati in ogni esperimento. Lo abbiamo fatto in due modi. Uno, per studi di espressione genica, abbiamo raccolto a mano un piccolo numero di vermi (colonizzati e non colonizzato) sotto un microscopio da dissezione fluorescente, che può essere utilizzato per qRT-PCR su un numero limitato di geni. Questi servono come il "gold standard" per la quale gene espressivosu una popolazione veramente puro sarebbe simile. In secondo luogo, è buona norma per ordinare 20 o più vermi ad una piastra per ogni popolazione ordinati automaticamente per verificare sotto un microscopio a fluorescenza che lo strumento funzioni come previsto. A seconda dell'applicazione a valle, diversi gradi di "fedeltà" del protocollo di smistamento possono essere richiesti. Quando i vermi filtrate non sono conformi al grado desiderato di colonizzazione, i parametri di gating devono essere regolati (punto 4.7). Va notato che la più rigorosa porte, maggiore è il numero iniziale di vermi necessari, ed esperimenti dovrebbero essere scalati conseguenza.
L'esperimento qui descritto potrebbe essere eseguita con qualsiasi agente patogeno di interesse (fintanto che è fluorescente etichettato). Dopo la cernita, analisi successive non devono aderire analisi di espressione genica, e potrebbero concentrarsi sulla sopravvivenza o addirittura analisi comportamentale. Inoltre, protocolli simili possono essere usate per scopi analitici, A seguire assorbimento metabolita, o per quantificare il carico patogeno, quest'ultimo fornisce un'alternativa più semplice per una conta, che sono altamente variabile 20,21. L'aumento del numero e della velocità potrebbe facilitare la quantificazione del carico patogeno in diverse condizioni, tra cui interruzioni genetiche nel ospitante o il patogeno, e le diverse condizioni ambientali. Inoltre, poiché la wormsorter può essere equipaggiato per rilevare più molecole fluorescenti, inseguimento colonizzazione non deve essere limitato ad un solo tipo di batteri. Questa funzionalità potrebbe essere utile per gli studi ecologici, permettendo diversi microbi di competere per la colonizzazione. In studi di laboratorio di patogenesi, C. elegans è tipicamente cresciuto su una monocoltura batterica. Tuttavia, lo studio dei meccanismi dell'immunità innata nella natura, dove esistono agenti patogeni, tra centinaia di altri microrganismi che possono influenzare l'immunità sta cominciando a raccogliere l'attenzione 22,23.
In sintesi, using la wormsorter per un'ampia gamma di applicazioni permette esperimenti da eseguire in breve tempo, e / o su larga scala. Ampliare il repertorio di tali applicazioni potrebbe avanzare la nostra comprensione di C. elegans fisiologia. In particolare, nel campo di C. elegans immunità innata, la sopravvivenza è un parametro spesso utilizzato per testare i contributi di vari geni. Tuttavia, la colonizzazione è più prossimale agli eventi che avviano immunità pur fornendo un'uscita funzionale. Utilizzando protocolli come qui descritto per isolare e / o analizzare le popolazioni di interesse è un valido strumento per studiare vari aspetti dei primi eventi di risposte immunitarie nei vermi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Ellison Medical Foundation per il loro sostegno. Desideriamo anche ringraziare i membri del laboratorio Abby Dernburg per l'assistenza con l'utilizzo del wormsorter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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