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Immunology and Infection

Séparation automatique des doi: 10.3791/51090 Published: March 21, 2014

Summary

Le wormsorter facilite écrans génétiques dans Caenorhabditis elegans par tri vers selon l'expression de journalistes fluorescentes. Ici, nous décrivons un nouvel usage: le tri selon la colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP, et nous l'employons pour examiner le rôle mal compris de la reconnaissance de l'agent pathogène dans l'initiation des réponses immunitaires.

Abstract

Le wormsorter est un instrument analogue à une machine FACS qui est utilisé dans les études de Caenorhabditis elegans, typiquement pour trier vers basés sur l'expression d'un rapporteur fluorescent. Ici, nous mettons en évidence une utilisation alternative de cet instrument, pour trier vers en fonction de leur degré de colonisation par un agent pathogène exprimant la GFP. Cette nouvelle utilisation nous a permis d'aborder la relation entre la colonisation de l'intestin du ver et de l'induction de réponses immunitaires. Alors que C. réponses immunitaires elegans à différents agents pathogènes ont été documentés, il est encore inconnue ce qui les déclenche. Les deux possibilités (qui ne sont pas mutuellement exclusives) sont la reconnaissance de motifs moléculaires associés à des pathogènes et la détection des dommages causés par une infection. Pour différencier entre les deux possibilités, l'exposition à l'agent pathogène doit être dissociée de la dommages qu'il cause. La séparation de wormsorter permis de vers qui ont été largement colonisée par le Gram-npathogène egative Pseudomonas aeruginosa, avec les dommages susceptibles provoquée par la charge pathogène, des vers qui ont été exposées de façon similaire, mais pas, ou peu, colonisé. Ces populations distinctes ont été utilisés pour évaluer la relation entre la charge de l'agent pathogène et l'induction de réponses immunitaires de transcription. Les résultats suggèrent que les deux sont dissociées, confirmant la possibilité de reconnaissance de l'agent pathogène.

Introduction

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Tri à vis sans fin automatique est un peu comme FACS, fonctionnant en mesurant un signal fluorescent dans une vis sans fin (typiquement fournie par l'expression transgénique de protéines rapporteurs) lors de son passage redressé dans un tube, ce qui permet la redirection soit à un tube de collecte / puits ou à un conteneur de déchets selon l' à gating paramètres fixés par le chercheur 1. Le wormsorter peut faciliter la recherche de plusieurs façons, un exemple de l'employer comme outil d'analyse est une étude qui a suivi les modèles spatio-temporelles de l'activité du promoteur pour près de 1000 gènes 2.
Cependant, l'utilisation principale de la wormsorter est dans cribles génétiques, à la suite des niveaux ou des gènes localisation de la protéine fluorescente selon l'axe de la vis sans fin 3-5 expression cibles.

Ici, nous décrivons une nouvelle application pour la wormsorter, en suite à la colonisation de la vis sans fin par un agent pathogène fluorescence marqués. Avec comme un outil nous nous sommes concentrés sur la relation entre pathogfr colonisation / charge et la réponse immunitaire, à acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes responsables de l'initiation de la réponse immunitaire dans le ver.

Dans pratiquement tous les organismes étudiés à ce jour, l'initiation des réponses immunitaires innées à des agents pathogènes microbiens dépend de la reconnaissance de motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), et / ou motifs moléculaires danger / dommages-associé (Damps) 6,7. Les structures microbiennes premiers sont conservés qui comprennent les éléments de la paroi cellulaire microbienne, son flagelle, ou son bicouche lipidique 6; la seconde, comprennent deux molécules libérées (par exemple ATP 8), protéines modifiées ou d'autres marqueurs de processus cellulaires modifiés 9,10. Les deux types de signaux sont reconnus par des protéines désignées comme des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR), qui, lors de la liaison spécifique d'une molécule modèle activer une chaîne d'événements conduisant à une réponse protectrice. C. elegans a été extrêmement utile comme Tractable modèle de disséquer les différents aspects des interactions hôte-pathogène, mais une chose qui n'est pas bien compris comment les réponses immunitaires sont initiées dans le ver. Aucun des récepteurs putatifs qui sont orthologues de reconnaissance de formes récepteurs (PRR) dans d'autres organismes ont été montré pour lier PAMP, et la plupart des orthologues de PRR qui sont essentielles pour les réponses immunitaires dans d'autres organismes montrent une contribution étonnamment limité de réponses ver pathogènes et la résistance. Par exemple, le récepteur de type Toll de Drosophila, ce qui est essentiel pour la résistance à des agents pathogènes Gram positifs, est représenté en C. elegans par un seul homologue, tol-1, ce qui contribue à la protection contre l'agent pathogène à Gram négatif Salmonella Typhimurium 11, mais pas par les autres agents pathogènes testés positifs ou Gram-négatifs, 11,12. Ces observations, combinées avec des données indiquant que les réponses immunitaires pourrait être induite par perturber protéine cellulaire traduction hque conduit certains à suggérer que C. elegans détecte principalement Damps 9,13,14. Néanmoins, les rapports décrivant la capacité des agents pathogènes morts à induire des réponses immunitaires suggérer que la liaison PAMP peut avoir un rôle important dans la reconnaissance de l'agent pathogène dans C. elegans 15,16. Des travaux antérieurs mettant l'accent sur ​​les réponses immunitaires de l'âge synchronisée génétiquement identiques C. elegans populations, ont montré une grande variabilité individuelle dans la colonisation intestinale par le Gram négatif bactérienne pathogène Pseudomonas aeruginosa.

Cependant, des études de profilage transcriptionnel traités ces populations variable colonisés comme une seule entité 17,18. Profitant de cette variabilité, nous avons élaboré un protocole en se concentrant un wormsorter automatisé pour séparer les populations colonisées différentielle de Caenorhabditis elegans exposés à la GFP exprimant P. aeruginosa. Examen expression des gènes dans les populations différemment colonisés Faciévaluation litated de la relation entre la charge de pathogènes (et les dommages associés) et les réponses immunitaires et fourni de nouvelles informations sur la reconnaissance des agents pathogènes dans C. elegans 19. Ci-dessous nous décrivons le protocole, qui pourrait être appliquée pour trier vers infectées par l'agent pathogène tout marqué par fluorescence.

Pour les utilisateurs potentiels, il convient de noter que le nombre de vers qui doivent être triés dépend de la nature des analyses ultérieures et les protocoles utilisés. Par exemple, dans le cas de l'analyse de l'expression des gènes de microréseau,> 1000 vers devront obtenir suffisamment ARN, si les protocoles standards sont utilisés, mais ~ 100 vers suffirait si l'amplification est utilisé, permettant la collecte rapide de matériel et de minimiser ainsi le stress de les vers.

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Protocol

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Une. L'obtention d'une culture synchronisée des jeunes adultes Animaux

  1. Grandir vers sur plusieurs plaques NGM ensemencées avec OP50-1 E. colibacilles (10x concentré d'une culture saturée) jusqu'à ce que de nombreux vers ont atteint le stade gravide.
  2. Traiter les animaux gravides avec une solution d'oeuf préparation pour obtenir une culture synchronisée (œufs).
  3. oeufs de plaque sur plusieurs plaques de 60 mm NGM ensemencées avec 10x concentré OP50-1 à une densité d'environ 150-200 oeufs / plaque.
  4. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 2 jours (jusque vers ont atteint le L4 - stade jeune adulte).

2. Préparation Pseudomonas aeruginosa plaques et infecter Worms

  1. Le jour de l'oeuf-prep (étape 1.1) inoculer une culture PA14 :: GFP dans 2 ml d'un milieu contenant B de King la rifampicine à une concentration finale de 100 pg / ml. Incuber la culture à 37 ° C avec agitation O / N.
  2. Plate la PA14 :: GFP culture sur autant de plaques de Killing lent (SKP) comme nécessaire pour le test. Sur chaque 150 mm SKP boîte de Pétri pipette 75-100 ul de culture saturée et répartir uniformément avec une spatule en verre stérile. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 20-24 h.
  3. Retirer les plaques de l'incubateur et de les laisser refroidir à la température ambiante (~ 20 min). En utilisant un tampon M9, laver les vers de l'étape 1.4 sur PA14 :: plaques GFP dans un volume minimal de liquide. Lors de l'utilisation des plaques de 150 mm, plusieurs centaines de vers peuvent être placés sur une seule plaque.
  4. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 18-21 h. Pour P. jeunes vers adultes aeruginosa exposés, c'est la fenêtre de temps l'affichage de la répartition optimale de colonisé vs animaux noncolonized.

3. Mise en place du Wormsorter

Avant d'effectuer l'échantillon sorte, s'assurer que la machine fonctionne correctement. Les détails peuvent être obtenus http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, et ee étapes essentielles sont décrites ci-dessous.

  1. Régler la pression de la soupape de gaine à environ 5 psi (4,5-5,5 gamme).
  2. Pour vérifier que le débit de fluide gaine est approprié, placer un tube conique de 15 ml sous le distributeur, tournez la vanne de la gaine, et fermez le robinet de tri. Tenir le tube sous le distributeur pendant 60 secondes. Le volume dans le tube doit être de 9 à 10 ml. Si elle est en dehors de cette gamme, ajuster la pression de la soupape de gaine en conséquence.
  3. Pour veiller à ce que le débit de fluide gaine (défini comme dans l'étape 3.2) permettra tri précis, tester le taux de tri à l'aide de 40 particules um de contrôle:
  4. Fermez le robinet de la gaine. Ajouter environ 25 ml de solution de particules de commande au réservoir.
  5. Ouvrir la valve de la gaine, et la soupape d'échantillon.
  6. Sur le logiciel de l'ordinateur, accédez à la "mode de particule de contrôle" et cliquez acquérir.
  7. Assurez-vous que le taux d'écoulement de particules est d'environ 5-8 particules / sec, avec une TOF (Time Of Flight) approximation de la largeurde la particule, de 40 um. Un tel TOF indique que seulement une seule 40 um objet passe à travers à la fois. Si les valeurs sont en dehors de cette plage, régler les paramètres (en suivant les indications ci-dessus) en conséquence.

4. Le tri Colonisée vs Noncolonized Worms

  1. Utilisation M9, laver vers dans des tubes coniques de 15 ml. Permettre vers adultes à se déposent au fond du tube par gravité et retirer le surnageant. Remplir le tube avec frais M9. Répétez ce processus 3-4x. Cela supprime une grande partie des larves ainsi que les bactéries en excès et dure environ 10 min.
  2. Ajouter vers le réservoir de wormsorter avec une petite barre d'agitation en douceur de mélange.
  3. Régler le gain de signal initial en définissant la PMT vert à 600 et le rouge et jaune PMT à 200.
  4. Commencer à acquérir des données pour ajuster les réglages.
  5. Viser un taux de 25-30 événements (vers) par seconde de tri. Si le taux de nombre est trop élevé, diluer les vers dans le réservoir avec M9 en conséquence. Si le taux est deo faible, ajouter des vers dans un petit volume de M9.
  6. Si l'expérience nécessite une séparation très stricte de colonisé vs vers noncolonized, réglez le "bilan de coïncidence" à "pur". Cela garantit que dans le cas où deux objets apparaissent trop proches les uns des autres ou dans la même chute, la machine rejette la chute plutôt que de les recueillir.
  7. Pour trier la population d'intérêt, établir des barrières autour des axes indiquant la taille (pour obtenir des vers adultes) et de l'intensité de fluorescence (c.-haut pour colonisé, faible pour noncolonized). Les valeurs de fluorescence de déclenchement doivent être déterminées de manière empirique.
  8. Placez une plaque multi-puits ou d'une boîte de Pétri sous le distributeur pour recueillir les vers puis ouvrez la vanne de sorte à commencer le tri vers.
  9. Recueillir une petite population d'animaux pour vérifier sous le microscope que la population triée est la population d'intérêt. Sinon, ajustez les paramètres de déclenchement en conséquence et poursuivre la collecte de l'échantillon.

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Representative Results

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Lorsque appariés pour l'âge, génétiquement identiques C. elegans sont exposés à P. aeruginosa, une large distribution est observée dans les niveaux de colonisation (Figure 1A). Avec l'aide du protocole décrit ci-séparation efficace contre les vers de noncolonized colonisés peut être réalisé (figure 1B). Contrairement vers noncolonized, vers colonisés montrent des signes de dommages, comme la lenteur et la défécation réduit 19. Ce dernier peut être une raison pour laquelle vers colonisés par P. aeruginosa ont de la difficulté infection compensation. Ceci a des implications directes pour le protocole décrit ce qui suggère que les vers triés comme noncolonized n'ont pas été colonisés auparavant. Pour tester directement si cette affirmation est correcte, vers colonisés triés sur le volet ont été soumis à des étapes de lavage similaires à celles dans l'expérience de tri et ensuite examinées au microscope à fluorescence; seulement 4/56 effacé l'agent pathogène. Par conséquent, il est probable èmeà la proportion de vers précédemment colonisés parmi ceux classés comme noncolonized est négligeable. Cependant, il est conseillé de suivre l'évolution de la colonisation au cours des étapes de lavage pour prévenir les effets de tri trompe sur l'analyse, qui peuvent être plus un problème pour les autres agents pathogènes que P. aeruginosa.

Des travaux antérieurs utilisant le protocole décrit ici utilisé vers trié pour une analyse de l'expression du gène de la puce à ADN et les réponses observées essentiellement identiques à P. aeruginosa dans les populations de vers colonisés et noncolonized qui avaient été exposés à l'agent pathogène pour la même quantité de temps 19. Figure 2 montre la même tendance en utilisant quantitative (q) RT-PCR pour mesurer l'expression de quatre gènes, appelés à faire partie de la C . elegans réponse immunitaire: lys-2 code pour une lysozyme, F08G5.6 et F55G11.2 sont deux gènes non caractérisés, qui répondent spécifiquement à l'infection, dont la première contribue également à l'infectiontion de la résistance, et pgp-5, qui répond à l'infection, ainsi que pour le stress de métal lourd. Les quatre gènes ont été induites de façon similaire par P. exposition aeruginosa, indépendamment de l'état de la colonisation des vers. Cela corrobore les résultats déjà publiés indiquant que la colonisation et ses effets néfastes associés ne sont pas tenus pour une réponse immunitaire, à la place de pointage à motifs moléculaires associés à des pathogènes comme le signal. PGP-5 est induite chez les animaux noncolonized, qui ne devraient pas éprouver d'importants dégâts, suggère un chevauchement dans les programmes de réglementation contrôlant les réponses immunitaires et les réponses générales de stress dans C. elegans.

Figure 1
Figure 1. Colonisés et noncolonized C. elegans séparée en utilisant un wormsorter. (A) Représentant l'image de type sauvage adulte C. elegans exposés au exprimant la GFP P. aeruginosa pendant 18 heures. (B) images représentant d'un vers noncolonized et colonisés séparés en utilisant la wormsorter. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La colonisation n'est pas requise pour la réponse transcriptionnelle à P. aeruginosa. Des niveaux de lys-2 (A) ARN, F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), et pgp-5 (D) mesurée par qRT-PCR chez les animaux de type sauvage exposée à E. coli ou P. aeruginosa </ Em> pour environ 18 heures. Présentés sont des moyens et SD de mesures en double d'une expérience qui, qui est un représentant de trois. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1. Matériaux et réactifs nécessaires pour une expérience de wormsorter.

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Discussion

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La méthode que nous décrivons tire parti de marquage fluorescent des entités à l'extérieur de la vis sans fin, pour suivre les interactions entre la vis sans fin et de son environnement. Dans le cas que nous présentons, la séparation a été basée sur l'étiquetage d'un agent pathogène et a été utilisé pour les vers séparées avec lourde charge pathogène de ceux qui n'ont pas (ou lumière) charge. Après l'analyse de l'expression du gène n'a trouvé aucune différence dans les réponses immunitaires entre les deux groupes suggérant qu'ils étaient indépendants de la charge de l'agent pathogène. Le signal qui initie la réaction a été montré comme devant être physiquement associé à la bactérie, plutôt que d'être sécrétée, ce qui suggère que ce signal peut être un PAMP. Ensemble, ces résultats soutiennent l'hypothèse que la reconnaissance PAMP joue un rôle dans l'initiation de la réponse immunitaire C. elegans 19.

Un avantage du protocole de tri décrit ci-dessus est que les deux ont colonisé et vers noncolonized sont isolés à partir d'une seule population. Thest dépend avoir une population avec une répartition optimale des animaux qui sont colonisés par rapport noncolonized. Nous avons constaté que lorsque infecter des vers de jeunes adultes, de type sauvage avec P. aeruginosa, ce qui correspond à un temps d'exposition d'environ 18 heures. Ce temps d'exposition a produit une population où la majorité des animaux ont été colonisés à un degré "intermédiaire", mais plusieurs centaines de vers a montré plein la colonisation, et un nombre similaire ont été noncolonized. Bien que cela représente une répartition optimale pour nos fins, d'autres peuvent définir leur propre distribution optimale.

Pendant le tri, il est conseillé d'avoir "des contrôles de qualité" intégrés dans chaque expérience. Nous l'avons fait de deux façons. Un, pour les études d'expression génique, nous cueillies à la main un petit nombre de vers (colonisés et noncolonized) sous un microscope de dissection fluorescent, qui peut être utilisé pour qRT-PCR sur un ensemble limité de gènes. Elles servent de «gold standard» pour ce expressi de gènedans une population vraiment pur ressemblerait. Deuxièmement, il est de bonne pratique pour trier 20 vers ou plus à une plaque pour chaque population triés automatiquement pour vérifier sous un microscope à fluorescence que l'instrument fonctionne comme prévu. Selon l'application, en aval, des degrés différents de "fidélité" du protocole de tri peuvent être nécessaires. Lorsque les vers triés ne sont pas conformes au degré de colonisation souhaitée, les paramètres de déclenchement doivent être ajustés (étape 4.7). Il convient de noter que la plus rigoureuse les portes, plus le nombre initial de vers nécessaires, et les expériences doivent être renforcés en conséquence.

L'expérience décrite ici peut être effectuée avec n'importe quel agent pathogène d'intérêt (dans la mesure où il est marqué de manière fluorescente). Après le tri, les analyses subséquentes n'ont pas besoin d'adhérer à l'analyse de l'expression des gènes, et pourraient se concentrer sur la survie ou l'analyse comportementale même. En outre, des protocoles similaires pourraient être utilisés à des fins analytiques, De suivre l'absorption du métabolite, ou à quantifier la charge de l'agent pathogène, ce dernier fournissant une solution plus simple pour le nombre de CFU, qui sont très variables 20,21. L'augmentation du nombre et de la vitesse pourrait faciliter la quantification de la charge pathogène dans des conditions différentes, y compris les perturbations génétiques chez l'hôte ou l'agent pathogène, et des conditions environnementales différentes. En outre, étant donné que la wormsorter peut être équipé pour détecter plusieurs molécules fluorescentes, suivi de la colonisation n'a pas à être limité à un seul type de bactérie. Cette capacité serait utile pour les études écologiques, permettant à différents microbes en lice pour la colonisation. Dans des études de laboratoire de pathogénie, C. elegans est généralement cultivé sur une monoculture bactérienne. Cependant, l'étude des mécanismes de l'immunité innée dans la nature, où les agents pathogènes existent parmi des centaines d'autres micro-organismes qui peuvent influer sur l'immunité commence à attirer l'attention 22,23.

En résumé, using la wormsorter pour une large gamme d'applications permet d'effectuer des essais dans un court laps de temps, et / ou à grande échelle. Élargir le répertoire de ces applications pourrait progresser notre compréhension de C. elegans physiologie. En particulier, dans le domaine de C. elegans immunité innée, la survie est une métrique souvent utilisé pour tester les contributions de divers gènes. Cependant, la colonisation est plus proximale des événements qui déclenchent l'immunité tout en fournissant une sortie fonctionnelle. En utilisant des protocoles comme décrit ici pour isoler et / ou analyser les populations d'intérêt est un outil précieux pour étudier divers aspects des événements précoces de la réponse immunitaire dans le ver.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient la Fondation médicale Ellison pour leur soutien. Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire Abby Dernburg d'assistance à l'utilisation du wormsorter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer prepared in house Recipe at wormbook.org
Rifampicin Sigma R3501
Egg prep solution prepared in house 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide
NGM plates prepared in house Recipe at wormbook.org
SKP plates prepared in house Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles Union Biometrica 310-5071-001

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References

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Séparation automatique des<em&gt; C. elegans</em&gt; Façon variable colonisé par une bactérie pathogène
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Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen. J. Vis. Exp. (85), e51090, doi:10.3791/51090 (2014).More

Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen. J. Vis. Exp. (85), e51090, doi:10.3791/51090 (2014).

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