Summary
Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.
Abstract
Die wormsorter ist ein Instrument analog zu einem FACS-Maschine, die in den Studien von Caenorhabditis elegans verwendet wird, in der Regel, um Würmer, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporter sortieren. Hier stellen wir eine alternative Nutzung dieses Instruments für die Sortierung Würmer nach dem Grad der Kolonisierung durch einen GFP-exprimierenden Erregers. Diese neue Nutzung gestattet uns die Beziehung zwischen Kolonisierung des Darms Schnecke und Induktion von Immunreaktionen zu adressieren. Während C. elegans Immunreaktionen auf verschiedene Erreger dokumentiert worden ist, ist es noch nicht bekannt, was sie veranlasst. Die beiden wichtigsten Möglichkeiten (die nicht gegenseitig ausschließen) sind Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns, und den Nachweis von Schäden, die durch eine Infektion verursacht. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, muss die Exposition gegenüber dem Erreger aus der von ihm verursachten Schäden getrennt werden. Die wormsorter aktiviert Trennung von Würmern, die durch Gram-n extensiv besiedelt wurdenegative Erreger Pseudomonas aeruginosa, mit dem Schaden wahrscheinlich durch Erreger Last verursacht, von Würmern, die in ähnlicher Weise exponiert waren, aber nicht, oder geringfügig besiedelt. Diese unterschiedliche Populationen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Keimmenge und der Induktion von Immunantworten Transkriptions beurteilen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die beiden dissoziiert, unterstützt die Möglichkeit der Krankheitserreger Erkennung.
Introduction
Automatische Sortierschnecke ist ähnlich wie FACS, Betriebs durch Messen eines Fluoreszenzsignals in einer Schnecke (typischerweise durch transgene Expression von Reporterproteinen zur Verfügung gestellt), wie es geht in ein Rohr gerichtet, so dass die Umleitung entweder zu einem Sammelrohr / Vertiefung oder zu einem Abfallbehälter nach um Gating Parameter durch den Forscher 1 gesetzt. Die wormsorter kann die Forschung in vielerlei Hinsicht zu erleichtern, ein Beispiel der Verwendung es als analytisches Werkzeug ist eine Studie, die räumlich-zeitliche Muster der Promotoraktivität für fast 1.000 Gene 2 gefolgt.
Jedoch ist die Hauptanwendung des wormsorter in genetischen Screens, folgende Zielgenexpressionsniveaus oder Lokalisation des fluoreszierenden Proteins entlang der Achse der Schnecke 3-5.
Hier beschreiben wir eine neue Anwendung für die wormsorter, in folgenden Kolonisierung der Wurm von einem fluoreszenzmarkierten Erregers. Mit diesem als ein Werkzeug, das wir auf die Beziehung zwischen pathog fokussierten Kolonisation / Last und der Immunantwort, um neue Einblicke in die Mechanismen für die Initiierung von Immunreaktionen in der Wurm verantwortlich zu gewinnen.
In praktisch allen bisher untersuchten Organismen, Initiierung der angeborenen Immunantwort gegen mikrobielle Krankheitserreger, hängt von der Anerkennung pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und / oder Gefahr / Schaden-associated molecular patterns (gedämpft) 6,7. Die ersten konserviert sind mikrobielle Strukturen, Komponenten der mikrobiellen Zellwand, seine Flagellum oder dessen Lipid-Doppelschicht 6 umfassen, der zweite umfassen sowohl freigesetzten Moleküle (z. B. ATP 8), veränderte Proteine oder andere Marker von veränderten zellulären Prozessen 9,10. Beide Arten von Signalen sind als Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), die auf spezifische Bindung eines Moleküls aktivieren Muster eine Kette von Ereignissen, die eine schützende Antwort bezeichneten Proteinen erkannt. C elegans ist extrem nützlich als tracta gewesenble Modell, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu sezieren, aber eine Sache, die nicht gut verstanden wird, ist, wie Immunantworten werden in der Wurm gestartet. Keiner der vermeintlichen Rezeptoren, die orthologen zu pattern recognition receptors (PRR) in anderen Organismen haben gezeigt, dass PAMPs zu binden, und viele der Orthologen von PRRS, die entscheidend für Immunreaktionen in andere Organismen sind eine überraschend begrenzten Beitrag zur Schnecken Erreger Antworten und Widerstand. Zum Beispiel wird das Drosophila Toll-Rezeptor, die für Gram-positive Pathogene Widerstand ist, in C dargestellt elegans durch eine einzige Homolog, tol-1, die Schutz gegen gramnegative Erreger Salmonella Typhimurium 11 trägt, nicht aber von anderen getesteten Gram-negative oder-positive Erreger 11,12. Diese Beobachtungen, zusammen mit Daten, die anzeigen, dass Immunantworten konnte durch Unterbrechung zellulären Proteintranslation h induziert werdenso führte einige darauf hin, dass C. elegans erkennt vor allem dämpft 9,13,14. Dennoch deuten Berichte beschreiben Fähigkeit von toten Krankheitserreger, Immunantworten zu induzieren, dass PAMP Bindung kann eine wichtige Rolle in Krankheitserreger Anerkennung in C haben werden elegans 15,16. Frühere Arbeiten mit Schwerpunkt auf Immunantworten in alters synchronisiert genetisch identisch C. elegans Populationen zeigten große individuelle Unterschiede in der Darmbesiedlung durch die bakterielle Gram-negative Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa.
Allerdings Transkriptionsprofilierung Studien behandelt diese variabel kolonisierten Bevölkerung als eine Einheit 17,18. Unter Ausnutzung dieser Variabilität, wir ein Protokoll Fokussieren eines automatisierten wormsorter differentiell kolonisiert Populationen von Caenorhabditis elegans an GFP-exprimierenden S. ausgesetzt trennen entwickelten aeruginosa. Untersuchung der Genexpression in unterschiedlich kolonisierten Bevölkerung Facilitated Beurteilung der Beziehung zwischen Keimmenge (und der damit verbundenen Schädigung) und Immunreaktionen und lieferte neue Erkenntnisse über Pathogen Erkennung in C. elegans 19. Nachfolgend beschreiben wir das Protokoll, die angewendet könnten, um Würmer mit einem Fluoreszenz-markierten Erreger infiziert zu sortieren.
Potenziellen Anwendern ist anzumerken, dass die Anzahl der Würmer erforderlich aussortiert werden müssen, hängt von der Art der nachfolgenden Analysen und Protokolle benutzt werden. Zum Beispiel im Fall von Microarray-Genexpressionsanalyse,> 1.000 Würmer werden benötigt, um genügend RNA zu erhalten, wenn Standard-Protokolle verwendet werden, aber ~ 100 Würmer würde genügen, wenn Verstärkung eingesetzt wird, die eine schnelle Sammlung von Material und damit Minimierung von Stress zu die Würmer.
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Protocol
1. Die Erteilung einer Synchronized Kultur Junger Erwachsener Tiere
- Würmer wachsen auf mehreren NGM-Platten mit OP50-1 E. ausgesät coli-Bakterien (aus einer gesättigten Kultur 10x konzentriert), bis viele Würmer haben die schwangeren Stadium erreicht.
- Gönnen trächtige Tiere mit Ei-Prep-Lösung, um eine synchronisierte Kultur (Eier) zu erhalten.
- Platte Eier auf mehrere 60-mm NGM-Platten ausgesät mit 10x konzentrierter OP50-1 mit einer Dichte von etwa 150-200 Eier / Platte.
- Platten bei 25 ° C für 2 Tage (bis Würmer haben die L4 erreicht - Young Adult Stufe).
2. Vorbereiten Pseudomonas aeruginosa infiziert Platten und Worms
- Am Tag des Ei-Prep (Schritt 1.1) beimpfen eine PA14 :: GFP Kultur in 2 ml King-B-Medium, das Rifampicin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C unter Rühren O / N.
- Platte der PA14 :: GFP Kulturtur auf so viele Slow-Killing-Platten (SKP), die für den Test benötigt. Auf jeder SKP 150 mm Petrischale Pipette 75-100 ul gesättigten Kultur und mit einem sterilen Glasverteiler gleichmäßig verteilt. Die Inkubation bei 37 ° C für 20-24 Stunden.
- Platten entfernen Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf RT (~ 20 min) zu kühlen. Mit M9 Puffer, Wasch Würmer aus Schritt 1.4 auf PA14 :: GFP-Platten in einem minimalen Volumen der Flüssigkeit. Bei Verwendung von 150-mm-Platten, kann mehrere hundert Würmer auf einer einzigen Platte angeordnet sein.
- Platten bei 25 ° C für 18-21 Stunden. Für P. aeruginosa-exponierten jungen erwachsenen Würmer, ist dies die Zeit Fenster, die optimale Verteilung der kolonisierten vs noncolonized Tiere.
3. Einrichten des Wormsorter
Vor der Durchführung der Proben Art, sicherzustellen, dass die Maschine richtig funktioniert. Details finden Sie in http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 erhalten werden kann, und the wesentlichen Schritte sind unten aufgeführt.
- Stellen Sie den Mantel Ventildruck auf ca. 5 psi (4,5-5,5 Bereich).
- Um zu überprüfen, dass Mantel Fluiddurchsatz geeignet ist, legen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen unter dem Spender, schalten Sie den Mantel-Ventil, und schalten Sie den Sorter-Ventil. Halten Sie das Röhrchen unter dem Spender für 60 Sekunden. Das Volumen in dem Rohr sollte 9-10 ml betragen. Wenn es außerhalb dieses Bereichs ist, passen Sie die Hülle Ventildruck.
- Um sicherzustellen, dass Mantel Fluiddurchsatz (wie in Schritt 3.2 festgelegt) werden genaue Sortierung zu ermöglichen, testen Sie die Sortierrate mit 40 um Steuer Partikel:
- Schalten Sie den Mantel Ventil. In etwa 25 ml der Kontrolle Partikellösung zum Stausee.
- Schalten Sie den Ventilmantel und dem Probenventil.
- Auf der Computer-Software, gehen Sie zum "Steuerpartikel Modus" und klicken Sie erwerben.
- Stellen Sie sicher, dass der Partikeldurchflussrate ~ 5-8 Teilchen / sec, mit einem TOF (Time Of Flight) in etwa der Breitedes Teilchens, 40 um. Solch ein TOF bedeutet, dass nur ein einziges Objekt 40 um durchläuft in einer Zeit. Wenn die Werte außerhalb dieses Bereiches, passen Sie die Einstellungen (nach der Beschreibung oben) entsprechend.
4. Die Sortierung kolonisiert vs Noncolonized Worms
- Mit M9, waschen Würmer in 15 ml konischen Röhrchen. Lassen erwachsenen Würmer auf den Boden der Röhre durch die Schwerkraft sinken, und entfernen Sie den Überstand. Das Rohr wird mit frischem M9. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x. Dies entfernt einen großen Anteil der Larven sowie überschüssige Bakterien und dauert etwa 10 min.
- In Würmer an die wormsorter Behälter mit einem sanft-Mischen kleiner Rührstab.
- Stellen anfänglichen Signalverstärkung durch Einstellen der Grün PMT auf 600 und die rote und gelbe PMT 200.
- Start der Datenerfassung, um die Einstellungen anzupassen.
- Ziel für eine Art Rate von 25 bis 30 Veranstaltungen (Würmer) pro Sekunde. Wenn die Anzahl Rate zu hoch ist, verdünnte die Würmer in dem Reservoir mit M9 entsprechend. Wenn die Rate ano niedrig ist, mehr Würmer in einem kleinen Volumen M9.
- Wenn das Experiment erfordert eine sehr strenge Trennung der kolonisierten vs noncolonized Würmer, stellen Sie die "Koinzidenzprüfung" auf "reine". Dies gewährleistet, dass im Falle zweier Objekte zu nahe aneinander auftreten oder in der gleichen Tropfen, die Maschine weist die Tropfen nicht gesammelt wird.
- Um die Bevölkerung von Interesse zu sortieren, ziehen Toren um die Achsen der Größe anzeigt (zu erwachsenen Würmern zu erhalten) und Fluoreszenz-Intensität (dh hoch für kolonisiert, niedrig für noncolonized). Die Werte für die Fluoreszenz Gating muss empirisch ermittelt werden.
- Legen Sie ein Multi-Well-Platte oder eine Petrischale unter dem Spender, um Würmer zu sammeln öffnen Sie dann die Art Ventil Sortier Würmer zu beginnen.
- Sammeln Sie eine kleine Population von Tieren, die unter dem Mikroskop, dass die Bevölkerung sortiert ist die Bevölkerung von Interesse zu überprüfen. Wenn nicht, passen Sie die Gating-Parameter und weiterhin mit Probenentnahme.
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Representative Results
Wenn bei gleichaltrigen, genetisch identisch C. elegans sind P. ausgesetzt aeruginosa, wird eine breite Verteilung in Stufen der Kolonisation (Fig. 1A) beobachtet. Mit Hilfe des hier beschriebenen effiziente Trennung von noncolonized kolonisiert Würmer erreicht werden (Abbildung 1B) Protokoll. Im Gegensatz zu noncolonized Würmer, Würmer kolonisiert zeigen Anzeichen von Schäden, wie Trägheit und reduziert Stuhlgang 19. Letzteres kann ein Grund, warum Würmer von P. besiedelt sein aeruginosa haben Schwierigkeiten Clearing-Infektion. Dies hat direkte Auswirkungen auf die beschriebenen Protokoll darauf hindeutet, dass Würmer sortiert, als noncolonized bisher nicht besiedelt. Um direkt zu testen, ob diese Aussage richtig ist, wurden handverlesen kolonisiert Würmer ähnliche Waschschritte wie die in dem Sortier Experiment unterzogen und anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, und nur 4/56 gelöscht Erregers. Daher ist es wahrscheinlich, thden Anteil der zuvor besiedelt Würmer unter denen, sortiert, als noncolonized ist vernachlässigbar. Allerdings ist es ratsam, Änderungen bei der Kolonisation während Waschschritte, um Effekte von falschen Sortierung auf der Analyse zu verhindern, die eher ein Problem sein kann für andere Erreger als P. überwachen aeruginosa.
Frühere Arbeiten unter Verwendung der hier beschriebenen für einen Microarray-Genexpressionsanalyse verwendet sortiert Würmer und beobachtet im Wesentlichen identisch Antworten auf P. Protokoll aeruginosa kolonisiert noncolonized Schneckenpopulationen, die mit dem Krankheitserreger für die gleiche Zeitdauer 19 ausgesetzt worden waren. Fig. 2 zeigt den gleichen Trend mit quantitativen (q) RT-PCR auf die Expression von vier Genen, bekannt, einen Teil des C messen . elegans Immunantwort: lys-2 kodiert für ein Lysozym, F08G5.6 und F55G11.2 zwei nicht charakterisierte Gene, die spezifisch an Infektion reagieren, von denen die erste ebenfalls zur Infektiontion Widerstand und pgp-5, die zu Infektionen sowie Schwermetallstress reagiert. Alle vier Gene wurden ebenfalls durch P. induzierte aeruginosa Belichtung, unabhängig von der Kolonisierungsstatus der Würmer. Dies bestätigt die zuvor veröffentlichten Ergebnissen anzeigt, dass Kolonisation und der zugehörigen Schädigung nicht für eine Immunantwort erforderlich ist, sondern zeigt auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie das Signal. Das pgp-5 ist in noncolonized Tiere, die vermutlich nicht zu erleben umfangreiche Schäden induziert, schlägt eine Überlappung in den regulatorischen Programme steuern Immunantworten und allgemeine Stressreaktionen in C. elegans.
Fig. 1 ist. Kolonisiert und noncolonized C. elegans mit einem wormsorte getrenntr. (A) Repräsentatives Bild von Wildtyp-erwachsenen C. elegans mit GFP-exprimierenden S. ausgesetzt aeruginosa 18 Stunden. (B) Repräsentative Bilder eines noncolonized und kolonisierten Würmer mit der wormsorter getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Kolonisation ist für die Transkriptionsreaktion auf P. erforderlichen aeruginosa. RNA-Spiegel von lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), und PGP-5 (D) durch qRT-PCR in Wildtyp-Tiere gemessen, um E. ausgesetzt coli oder P. aeruginosa </ Em> für ~ 18 Stunden. Dargestellt sind Mittel und SD von zwei Messungen von einem Experiment, das ein Vertreter der drei ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Materialien und Reagenzien für einen wormsorter Experiment benötigt.
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Discussion
Die Methode, die wir beschreiben, nutzt Fluoreszenzmarkierung von Einrichtungen außerhalb der Schnecke, um Wechselwirkungen zwischen der Schnecke und ihrer Umgebung zu folgen. In dem Fall, wir präsentieren, wurde die Trennung über die Kennzeichnung von einem Krankheitserreger und wurde zu trennen Würmer mit schweren Krankheitserreger Last von diejenigen, die keine (oder Licht) Last eingesetzt. Nachfolgende Genexpressionsanalyse fanden keinen Unterschied in der Immunantworten zwischen den beiden Gruppen nahe legt, dass sie unabhängig von der Keimmenge waren. Das Signal, das die Reaktion initiiert wurde an anderer Stelle gezeigt, um physisch mit den Bakterien assoziiert werden, anstatt ausgeschieden wird, was darauf hindeutet, dass dieses Signal kann ein PAMP sein. Gemeinsam unterstützten diese Ergebnisse die Hypothese, dass PAMP Anerkennung spielt eine Rolle bei der Initiierung Immunantwort in C. elegans 19.
Ein Vorteil der oben beschriebenen Sortierprotokolls ist, dass sowohl besiedelt und noncolonized Würmer aus einer Population isoliert. Thist, hängt mit einer Bevölkerung mit einer optimalen Verteilung der Tiere, die gegen noncolonized besiedelt sind. Wir haben festgestellt, dass bei jungen Erwachsenen infiziert, Wildtyp-Würmer mit P. aeruginosa, das entsprach einer Belichtungszeit von etwa 18 Stunden. Diese Belichtungszeit erzeugt eine Bevölkerung, wo die Mehrheit der Tiere wurden einem "Zwischen"-Grad besiedelt, aber mehrere hundert Würmer zeigten vollen Kolonisation, und eine ähnliche Anzahl noncolonized wurden. Obwohl damit eine optimale Verteilung für unsere Zwecke, andere können ihre eigene optimale Verteilung zu definieren.
Bei Sortierung, ist es ratsam, "Qualitätskontrolle" in jedem Experiment gebaut haben. Wir haben das in zweierlei Hinsicht. Eins, für Genexpressionsstudien, die wir handverlesen eine kleine Anzahl von (kolonisiert und noncolonized) Würmer unter einem Fluoreszenz-Binokular, die für die qRT-PCR auf eine begrenzte Anzahl von Genen verwendet werden kann. Diese dienen als "Goldstandard" für das, was Gen expressiauf in einem wirklich reinen Population aussehen würde. Zweitens ist es gute Praxis, 20 oder mehr Würmer an einer Platte für jede automatisch sortiert Bevölkerung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop, dass das Gerät wie erwartet überprüfen zu sortieren. Je nach vorhandener Downstream-Anwendung können unterschiedliche Grade der "Treue" des Sortier-Protokoll erforderlich. Wenn sortiert Würmer nicht zu dem gewünschten Grad der Besiedelung entsprechen sollte Gating-Parameter (Schritt 4.7) eingestellt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die strengere die Gatter, je höher die Anfangszahl der Würmer benötigt und Experimente sollten entsprechend skaliert werden.
Das hier beschriebene Experiment konnte mit jedem Krankheitserreger von Interesse (solange es fluoreszierend markiert ist) durchgeführt werden. Nach der Sortierung, keine weiteren Analysen nicht brauchen, um zu Genexpressionsanalyse haften und könnte auf das Überleben oder gar Verhaltensanalyse konzentrieren. Darüber hinaus könnten ähnliche Protokolle für analytische Zwecke verwendet werden,, Um Stoffwechselabsorption zu folgen, oder Keimmenge, letztere um eine einfachere Alternative zu Keimzahlen, die sehr unterschiedlich sind 20,21 quantifizieren. Die Zunahme der Zahl und Geschwindigkeit erleichtern könnte Quantifizierung Erreger Last unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich genetischer Störungen in der Host-oder den Erreger und verschiedene Umweltbedingungen. Darüber hinaus müssen, da die wormsorter ausgestattet, um mehrere fluoreszierende Moleküle nachzuweisen, Tracking Besiedlung werden nicht auf eine einzige Art von Bakterien begrenzt. Diese Fähigkeit würde nützlich für ökologische Studien sein, so dass verschiedene Mikroben für die Besiedlung zu konkurrieren. In Laborstudien der Pathogenese, C. elegans ist typischerweise auf einem Bakterienmonokultur. Allerdings ist die Untersuchung der Mechanismen der angeborenen Immunität in der Wildnis, wo Krankheitserreger unter Hunderten von anderen Mikroorganismen, die Immunität beeinflussen können, gibt es ab 22,23, die Aufmerksamkeit zu sammeln.
Zusammenfassend using der wormsorter für eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht Experimente in kurzer Zeit durchgeführt werden, und / oder in großem Maßstab. Die Erweiterung des Repertoires für solche Anwendungen könnten unser Verständnis von C voran elegans Physiologie. Insbesondere im Bereich der C elegans angeborenen Immunität, ist Überleben eine oft verwendete Metrik für die Prüfung der Beiträge verschiedener Gene. , Ist die Besiedlung jedoch mehr proximal zu den Ereignissen, die Immunität zu initiieren, während immer noch ein Funktionsausgang. Verwendung von Protokollen, wie hier beschrieben, zu isolieren und / oder zu analysieren Populationen von Interesse ist ein wertvolles Werkzeug, um verschiedene Aspekte der frühen Ereignisse von Immunantworten in der Schnecke zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Ellison Medical Foundation für ihre Unterstützung. Wir möchten auch die Mitglieder der Abby Dernburg Labor für die Unterstützung bei Verwendung des wormsorter danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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