Summary
O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.
Abstract
O wormsorter é um instrumento semelhante a uma máquina de FACS que é utilizado em estudos de Caenorhabditis elegans, tipicamente para classificar vermes baseados na expressão de um repórter fluorescente. Aqui, destacam-se um uso alternativo deste instrumento, para classificar os vermes de acordo com seu grau de colonização por um patógeno expressando GFP. Este novo uso nos permitiu resolver a relação entre a colonização do intestino sem-fim e a indução de respostas imunitárias. Enquanto C. elegans respostas imunes a diferentes patógenos têm sido documentados, ainda é desconhecido o que os inicia. As duas possibilidades principais (que não são mutuamente exclusivos) são o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, e detecção de danos causados por infecção. Para diferenciar entre as duas possibilidades, a exposição ao patógeno deve ser dissociado do dano que ela causa. A separação wormsorter habilitado de vermes que foram amplamente colonizados pela Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, com a provável dano causado pela carga de patógenos, de vermes que foram igualmente expostos, mas não, ou marginalmente, colonizado. Estas populações distintas foram usadas para avaliar a relação entre a carga e o agente patogénico a indução de respostas imunitárias de transcrição. Os resultados sugerem que os dois são dissociados, apoiando a possibilidade de reconhecimento do patógeno.
Introduction
Classificação automática verme é muito parecido com FACS, operando através da medição um sinal fluorescente em um sem-fim (normalmente fornecida pela expressão transgênica de proteínas repórter) que passa ajeitou em um tubo, o que permite o redirecionamento ou a um tubo de coleta / bem ou para um recipiente de resíduos de acordo para modular parâmetros definidos pelo pesquisador 1. O wormsorter pode facilitar a pesquisa de várias maneiras; um exemplo de empregá-la como instrumento de análise é um estudo que seguiu os padrões espaço-temporais de atividade do promotor para quase 1.000 genes 2.
No entanto, o uso principal do wormsorter é nas telas genéticas, a seguir os níveis de expressão do gene alvo ou a localização da proteína fluorescente ao longo do eixo do sem-fim de 3-5.
Aqui, descrevemos uma nova aplicação para o wormsorter, seguindo a colonização do worm por um patógeno fluorescente etiquetado. Com isto como uma ferramenta que incidiu sobre a relação entre Pathogen colonização / carga e da resposta imune, para ganhar novos insights sobre os mecanismos responsáveis pela iniciação das respostas imunes do worm.
Em praticamente todos os organismos estudados até o momento, o início da resposta imune inata a patógenos microbianos depende do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), e / ou padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece) 6,7. As estruturas microbianas primeiro são conservadas que incluem componentes da parede celular microbiana, seu flagelo, ou sua bicamada lipídica 6, o segundo, incluem ambas as moléculas libertadas (por exemplo ATP 8), as proteínas modificadas ou outros marcadores de processos celulares alterados 9,10. Ambos os tipos de sinais são reconhecidos pelas proteínas designadas como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), que, após a ligação específica de uma molécula padrão activam uma cadeia de eventos que conduzem a uma resposta protectora. C. elegans foi extremamente útil como um Tractamodelo ble dissecar vários aspectos da interação patógeno-hospedeiro, mas uma coisa que não é bem compreendido é a forma como as respostas imunes são iniciadas no worm. Nenhum dos receptores putativos que são ortólogos de receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) em outros organismos demonstraram ligar PAMPs, e muitos dos ortólogos de PRRs que são cruciais para as respostas imunes em outros organismos mostram surpreendentemente uma contribuição limitada para respostas verme patógeno e resistência. Por exemplo, o receptor Toll de Drosophila, que é essencial para resistir Gram positivos patogénicos, é representada em C. elegans por um único homólogo, tol-1, o que contribui para a protecção contra o agente patogénico Gram negativa Salmonella typhimurium 11, mas não a partir de outros agentes patogénicos, ou-positivas gram-negativas testadas 11,12. Estas observações, em conjunto com os dados que indicam que as respostas imunitárias poderia ser induzida por perturbar a tradução da proteína celular hcomo levou alguns a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPs 9,13,14. No entanto, relatos que descrevem a capacidade de agentes patogénicos mortos para induzir respostas imunológicas sugerem que a ligação pode ser PAMP têm um papel importante no reconhecimento de patógenos em C. elegans 15,16. Trabalhos anteriores com foco em respostas imunes em sincronizado idade geneticamente idênticos C. elegans populações, demonstraram grande variabilidade individual na colonização intestinal pela Gram-negativo patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa.
No entanto, estudos de perfis de transcrição tratada essas populações variavelmente-colonizados como uma entidade 17,18. Aproveitando essa variabilidade, foi desenvolvido um protocolo visando ao wormsorter automatizado para separar populações colonizadas diferencialmente de Caenorhabditis elegans expostos a expressando GFP P. aeruginosa. Examinando a expressão genética em populações de forma diferente-colonizados FACIavaliação litated da relação entre a carga de patógenos (e os danos associados) e as respostas imunes e fornecidos novos insights sobre o reconhecimento do patógeno em C. elegans 19. A seguir descreve-se o protocolo, o qual podia ser aplicado para classificar vermes infectadas com qualquer agente patogénico marcado por fluorescência.
Para potenciais utilizadores deve notar-se que o número de vermes necessários para ser resolvido depende da natureza das análises subsequentes e protocolos de uso. Por exemplo, no caso de análise de expressão do gene de microarray,> 1000 vermes será necessária para obter o ARN suficiente, se os protocolos padrão são usadas, mas aproximadamente 100 vermes seria suficiente, se é utilizada a amplificação, permitindo rápida recolha de material e, assim, minimizar o stress aos os vermes.
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Protocol
1. A obtenção de uma Cultura Synchronized de Jovens Adultos Animais
- Crescer vermes em várias placas NGM semeados com OP50-1 E. bactérias coli (10x concentrada a partir de uma cultura saturada) até muitos vermes atingiram a fase gravídico.
- Trate os animais grávidas com solução ovo-prep para obter uma cultura sincronizado (ovos).
- Ovos placa em várias placas NGM 60 mm semeado com 10x concentrado OP50-1 a uma densidade de cerca de 150-200 ovos / placa.
- Incubar as placas a 25 ° C durante 2 dias (até que os vermes têm alcançado o L4 - fase de adulto jovem).
2. Preparando Pseudomonas aeruginosa Placas e infectando Worms
- No dia da preparação, ovo (passo 1.1) inocular uma cultura PA14 :: GFP em 2 ml de meios contendo rifampicina B de King, a uma concentração final de 100 ug / ml. Incubar a cultura a 37 ° C com agitação de O / N.
- Placa da PA14 :: GFP cultura para o maior número de placas Killing Lenta (SKP), conforme necessário para o ensaio. Em cada 150 milímetros SKP Petri pipeta prato 75-100 mL de cultura saturada e espalhar uniformemente com uma espátula de vidro estéril. Incubar as placas a 37 ° C durante 20-24 horas.
- Retirar as placas do incubador e permitir-se arrefecer até à temperatura ambiente (~ 20 min). Usando tampão M9, lavar vermes do passo 1.4 em PA14 :: placas GFP em um volume mínimo de líquido. Ao utilizar placas de 150 mm, centenas de vermes podem ser colocados em uma única placa.
- Incubar as placas a 25 ° C durante 18-21 horas. Para P. vermes aeruginosa expostas jovens adultos, esta é a janela de tempo exibindo a distribuição ideal de colonizado vs animais não colonizados.
3. Configurando o Wormsorter
Antes de executar a amostra tipo, verifique se a máquina está funcionando corretamente. Detalhes podem ser obtidos no http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, e the etapas essenciais são descritas abaixo.
- Ajuste a pressão da válvula bainha para cerca de 5 psi (4,5-5,5 intervalo).
- Para verificar que a taxa de fluxo de fluido bainha é apropriado, colocar um tubo de 15 ml por baixo do distribuidor, ligue a válvula de bainha e desligue a válvula de classificador. Segurar o tubo abaixo do distribuidor durante 60 seg. O volume no tubo deve ser de 9-10 ml. Se estiver fora dessa faixa, ajuste a pressão da válvula de bainha em conformidade.
- Para garantir que a taxa de fluxo do fluido do invólucro (definido como no passo 3.2), vai permitir a classificação exata, testar a taxa de ordenação utilizando 40 partículas mM de controle:
- Desligue a válvula de bainha. Adicionar cerca de 25 ml de solução de partículas de controlo para o reservatório.
- Ligar a válvula de bainha e a válvula de amostra.
- No software de computador, navegar para o "modo de controle de partículas" e clique em adquirir.
- Certifique-se que a taxa de fluxo de partículas é de aproximadamente 5-8 partículas / s, com um TOF (tempo de vôo) aproximar a largurada partícula, de 40 ^ m. Tal TOF indica que apenas um único 40 um objecto está a passar através de cada vez. Se os valores estão fora dessa faixa, ajuste as configurações (seguindo as instruções acima) em conformidade.
4. Ordenando Colonizada vs não colonizados Worms
- Usando M9, lavar vermes em tubos cónicos de 15 ml. Permitir que os vermes adultos de afundar para o fundo do tubo por gravidade e remove-se o sobrenadante. Encha o tubo com fresco M9. Repita este processo 3-4x. Isto remove uma grande proporção de larvas, bem como as bactérias em excesso e demora cerca de 10 minutos.
- Adicionar vermes para o reservatório wormsorter com uma barra de agitação pequena delicadamente-mistura.
- Ajuste o ganho do sinal inicial, definindo o PMT Verde para 600 eo vermelho e amarelo PMT a 200.
- Comece a aquisição de dados para ajustar as configurações.
- Apontar para uma taxa tipo de 25-30 eventos (vermes) por segundo. Se a taxa for demasiado elevado número, diluir os vermes no reservatório com M9 conformidade. Se a taxa éo baixo, adicione mais vermes em um pequeno volume de M9.
- Se o experimento requer uma separação muito rigoroso de colonizado vs vermes não colonizados, defina a "verificação de coincidência" a "pura". Isto assegura que, no caso de dois objectos ocorrer demasiado perto um do outro ou na mesma queda, a máquina rejeita a gota em vez de a sua recolha.
- Para classificar a população de interesse, desenhar portas em torno dos eixos indicando o tamanho (para obter vermes adultos) e intensidade de fluorescência (ou seja, alta de colonizado, de baixo para não colonizados). Os valores de fluorescência gating deve ser determinada empiricamente.
- Colocar uma placa multi-bem ou uma placa de Petri sob o dispensador de recolher vermes em seguida, abra a válvula de tipo para começar a triagem worms.
- Recolha de uma pequena população de animais para verificar ao microscópio que a população é classificada a população de interesse. Se não, ajustar os parâmetros de propagação de acordo e continuar com a coleta de amostras.
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Representative Results
Quando a idade-pareado, geneticamente idênticos C. elegans estão expostos a P. aeruginosa, uma ampla distribuição é observado em níveis de colonização (Figura 1A). Com a ajuda do protocolo descrito aqui a separação eficiente de não colonizados de vermes colonizados pode ser conseguida (Figura 1B). Ao contrário dos worms não colonizados, vermes colonizados mostrar sinais de danos, tais como lentidão e reduziu a defecação 19. Este último pode ser uma razão pela qual os vermes colonizado por P. aeruginosa têm dificuldade em limpar a infecção. Isto tem implicações diretas para o protocolo descrito sugerindo que vermes classificadas como não colonizados não foram previamente colonizado. Para testar diretamente se essa afirmação é correta, vermes colonizados escolhidos a dedo foram submetidos a etapas de lavagem semelhantes aos do experimento triagem e posteriormente analisada sob um microscópio de fluorescência, apenas 4/56 abriu o patógeno. Portanto, é provável thna proporção de vermes previamente colonizado entre aqueles classificados como não colonizadas é negligenciável. No entanto, é aconselhável monitorar mudanças na colonização durante as etapas de lavagem para prevenir os efeitos de classificação equivocada em análise, que pode ser mais um problema para outros patógenos do que P. aeruginosa.
Trabalhos anteriores empregando o protocolo descrito aqui utilizado vermes ordenados para uma análise de expressão gênica por microarrays e observaram respostas essencialmente idêntico ao P. aeruginosa em populações colonizados e não colonizadas sem-fim, que tinham sido expostas ao agente patogénico para o mesmo período de tempo 19. Figura 2 mostra a mesma tendência utilizando quantitativa (q) RT-PCR para medir a expressão de quatro genes, conhecidos como sendo parte do C . elegans resposta imune: lys-2 codifica uma lisozima, F08G5.6 e F55G11.2 são dois genes não caracterizados, que respondem especificamente a infecção, dos quais o primeiro, também contribui para a infecçãoresistência ção, e o pgp-5, o qual responde a infecção, bem como a tensão de metal pesado. Todos os quatro genes foram induzidos de forma semelhante por P. exposição aeruginosa, independentemente do estado de colonização dos vermes. Isto corrobora os resultados publicados anteriormente, indicando que a colonização e seus danos associados não são necessários para uma resposta imune, em vez apontando para padrões moleculares associados a patógenos como o sinal. Isso pgp-5 é induzida em animais não colonizados, o que não se espera que sejam experimentando grandes danos, sugere uma sobreposição nos programas reguladores que controlam as respostas imunes e respostas gerais de estresse em C. elegans.
Figura 1. Colonizada e não colonizados C. elegans separados utilizando uma wormsorter. (A) Imagem representativa de tipo selvagem adulto C. elegans expostos a expressando GFP-p aeruginosa por 18 hr. (B) imagens representativas de um vermes não colonizados e colonizados separados usando o wormsorter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A colonização não é necessária para a resposta transcricional de P. aeruginosa. os níveis de ARN de lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), e o pgp-5 (D) medido por qRT-PCR, em animais de tipo selvagem expostas a E. coli ou P. aeruginosa </ Em> durante ~ 18 horas. São mostrados os meios e SD de medições duplicadas de um experimento, que é um representante de três. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Materiais e reagentes necessários para uma experiência wormsorter.
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Discussion
O método que descrevemos aproveita de marcação fluorescente de entidades fora do worm, para acompanhar as interações entre o vírus e seu ambiente. No caso que apresentamos, a separação foi baseada em rotulagem de um patógeno e foi empregado para vermes separados com carga de patógenos pesado daqueles sem (ou luz) de carga. Análise de expressão gênica Subsequente não encontraram nenhuma diferença nas respostas imunes entre os dois grupos, sugerindo que eles foram independentes da carga de patógenos. O sinal que inicia a resposta foi mostrado noutro local a ser fisicamente associado com as bactérias, em vez de ser segregada, sugerindo que este sinal pode ser um PAMP. Juntos, estes resultados suportam a hipótese de que o reconhecimento PAMP desempenha um papel na iniciação da resposta imune em C. elegans 19.
Uma vantagem do protocolo de triagem descrito acima é que ambos colonizados e não colonizados vermes são isolados a partir de uma única população. Thé depende da existência de uma população com uma distribuição ideal de animais que são colonizados versus não colonizados. Descobrimos que quando infectar jovem-adulto, tipo selvagem vermes com P. aeruginosa, isso correspondia a um tempo de exposição de cerca de 18 horas. Este tempo de exposição produziu uma população onde a maioria dos animais foram colonizados em um grau "intermediário", mas várias centenas de vermes mostrou colonização completa, e um número semelhante foi não colonizados. Enquanto isso representa a distribuição ideal para os nossos propósitos, outros podem definir a sua própria distribuição ideal.
Durante a triagem, é aconselhável ter "controle de qualidade" construídas em cada experimento. Fizemos isso de duas maneiras. Um deles, por estudos de expressão gênica, que escolheu a dedo um pequeno número de colonizados e não colonizados (vermes) sob um microscópio de dissecação fluorescente, que pode ser usado para qRT-PCR em um conjunto limitado de genes. Estes servem como o "padrão ouro" para o que expressi geneem em uma população verdadeiramente puro seria semelhante. Em segundo lugar, é uma boa prática para ordenar 20 ou mais vermes para uma placa para cada população automaticamente classificadas para verificar sob um microscópio fluorescente que o instrumento está funcionando como o esperado. Dependendo da aplicação, a jusante, diferentes graus de "fidelidade" do protocolo de triagem pode ser necessária. Quando vermes ordenados não estão em conformidade com o grau desejado de colonização, os parâmetros de propagação deve ser ajustada (passo 4.7). Deve notar-se que o mais rigoroso das portas, quanto maior o número inicial de vermes necessários, e as experiências devem ser aumentadas proporcionalmente.
A experiência descrita aqui pode ser realizada com qualquer agente patogénico de interesse (contanto que é marcado por fluorescência). Após classificação, análises subsequentes não precisa de aderir a análise de expressão gênica, e poderia incidir sobre a sobrevivência ou mesmo análise comportamental. Além disso, os protocolos semelhantes pode ser usado para fins analíticos, A seguir a absorção de metabolito, ou para quantificar a carga de patógenos, este último fornecer uma alternativa mais simples para contagens de UFC, que são altamente variável 20,21. O aumento no número e na velocidade poderia facilitar a quantificação da carga de patógenos em diferentes condições, incluindo distúrbios genéticos no hospedeiro ou patógeno, e diferentes condições ambientais. Além disso, uma vez que o wormsorter pode ser equipado para detectar várias moléculas fluorescentes, a colonização rastreamento não precisa de estar limitado a um único tipo de bactérias. Esse recurso pode ser útil para estudos ecológicos, permitindo que diferentes micróbios para competir para a colonização. Em estudos de laboratório de patogênese, C. elegans é tipicamente cultivado numa monocultura bacteriana. No entanto, o estudo dos mecanismos da imunidade inata na natureza, onde existem patógenos, entre centenas de outros microorganismos que podem afetar a imunidade está começando a atrair a atenção 22,23.
Em resumo, using o wormsorter para uma ampla gama de aplicações permite experiências para ser realizada num curto espaço de tempo, e / ou em grande escala. Expandindo o repertório de tais aplicações poderia avançar nossa compreensão da C. elegans fisiologia. Em particular, no campo de C. elegans imunidade inata, a sobrevivência é uma métrica muitas vezes usado para testar as contribuições de vários genes. No entanto, a colonização é mais proximal para os eventos que iniciam a imunidade enquanto continua a fornecer uma saída funcional. Usando protocolos como descrito aqui para isolar e / ou analisar as populações de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos dos primeiros eventos de respostas imunes no verme.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Fundação Médica Ellison pelo seu apoio. Gostaríamos também de agradecer aos membros do laboratório de Abby Dernburg para a assistência com o uso do wormsorter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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