Summary
El wormsorter facilita pantallas genéticas en Caenorhabditis elegans clasificando gusanos de acuerdo a la expresión de los reporteros fluorescentes. Aquí se describe un nuevo uso: la clasificación de acuerdo a la colonización por un patógeno que expresa GFP, y lo empleamos para examinar el papel poco conocido de reconocimiento de patógenos en la iniciación de la respuesta inmune.
Abstract
El wormsorter es un instrumento similar a una máquina de FACS que se utiliza en los estudios de Caenorhabditis elegans, típicamente para ordenar gusanos basados en la expresión de un indicador fluorescente. Aquí, destacamos un uso alternativo de este instrumento, para la clasificación de los gusanos de acuerdo a su grado de colonización por parte de un agente patógeno que expresa GFP. Este nuevo uso nos permitió abordar la relación entre la colonización del intestino del gusano y la inducción de la respuesta inmune. Mientras C. las respuestas inmunes frente a diferentes patógenos elegans se han documentado, todavía no se sabe lo que los inicia. Las dos posibilidades principales (que no son mutuamente excluyentes) son el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, y la detección de los daños causados por la infección. Para diferenciar entre las dos posibilidades, la exposición al patógeno debe disociarse del daño que causa. El wormsorter permitido la separación de los gusanos que fueron colonizados extensamente por el Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, con el probable daño causado por la carga de patógenos, de los gusanos que fueron expuestos de manera similar, pero no es así, o marginalmente, colonizado. Se utilizaron estas poblaciones distintas para evaluar la relación entre la carga de patógenos y la inducción de respuestas inmunes de la transcripción. Los resultados sugieren que los dos se disocian, el apoyo a la posibilidad de reconocimiento de patógenos.
Introduction
Clasificación automática gusano es muy similar a FACS, operando mediante la medición de una señal fluorescente en un tornillo sin fin (normalmente proporcionado por la expresión transgénica de las proteínas informadoras) a medida que pasa enderezó en un tubo, lo que permite la redirección ya sea a un tubo de recogida / o bien a un contenedor de residuos de acuerdo para conmutar parámetros establecidos por el investigador 1. El wormsorter puede facilitar la investigación de muchas maneras, un ejemplo de emplearlo como herramienta de análisis es un estudio que siguió los patrones espacio-temporales de la actividad promotora de casi 1.000 genes 2.
Sin embargo, el uso principal de la wormsorter es en pantallas genéticos, siguiente objetivo los niveles de expresión de genes o localización de la proteína fluorescente a lo largo del eje del gusano 3-5.
Aquí se describe una nueva aplicación para el wormsorter, en el seguimiento de la colonización del gusano por un patógeno marcado con fluorescencia. Con esto como una herramienta que se centró en la relación entre Pathogen la colonización / carga y la respuesta inmune, para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos responsables de la iniciación de la respuesta inmune en el gusano.
En casi todos los organismos estudiados hasta la fecha, la iniciación de la respuesta inmune innata a patógenos microbianos depende del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), y / o peligro / daño-patrones moleculares asociados (amortigua) 6,7. Las estructuras microbianas primero se conservan que incluyen componentes de la pared celular microbiana, su flagelo, o su bicapa lipídica 6; el segundo, incluyen tanto moléculas liberadas (por ejemplo ATP 8), proteínas alteradas u otros marcadores de los procesos celulares alterados 9,10. Ambos tipos de señales son reconocidas por proteínas designadas como receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que tras la unión específica de una molécula patrón activar una cadena de eventos que conducen a una respuesta protectora. C. elegans ha sido extremadamente útil como tractamodelo ble para diseccionar los diversos aspectos de las interacciones huésped-patógeno, pero una cosa que no es bien entendido es cómo se inician la respuesta inmune en el gusano. Ninguno de los supuestos receptores que son ortólogos a los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) en otros organismos se ha demostrado que se unen PAMP, y muchos de los ortólogos de PRRS que son fundamentales para la respuesta inmune en otros organismos mostrar una contribución sorprendentemente limitado a las respuestas de patógenos gusano y la resistencia. Por ejemplo, el receptor Toll de Drosophila, que es esencial para resistir los patógenos Gram positivos, se representa en C. elegans por un único homólogo, Tol-1, lo que contribuye a la protección contra el patógeno Gram negativa Salmonella typhimurium 11, pero no de otros patógenos Gram-negativas, o-positivos 11,12 probados. Estas observaciones, junto con datos que indican que las respuestas inmunes podría ser inducido mediante la interrupción de la proteína celular traducción hcomo llevado a algunos a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPS 9,13,14. Sin embargo, informes que describen la capacidad de los patógenos muertos para inducir respuestas inmunes sugerir que PAMP de unión puede ser tiene un papel importante en el reconocimiento de patógenos en C. elegans 15,16. El trabajo previo se centra en la respuesta inmune en sincronizada edad genéticamente idénticos C. elegans poblaciones, demostraron una gran variabilidad individual en la colonización intestinal por el Gram-negative bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa.
Sin embargo, los estudios de perfiles transcripcionales tratan estas poblaciones colonizadas de forma variable-como una entidad 17,18. Tomando ventaja de esta variabilidad, se desarrolló un protocolo de enfocar una wormsorter automatizado para separar las poblaciones colonizadas de forma diferencial Caenorhabditis elegans expuestos a GFP-expresando P. aeruginosa. El examen de la expresión de genes en las poblaciones colonizadas de forma diferente-Facilitated evaluación de la relación entre la carga de patógenos (y el daño asociado) y las respuestas inmunes y proporcionado nuevas perspectivas sobre el reconocimiento de patógenos en C. elegans 19. A continuación se describe el protocolo, que podría ser aplicado para ordenar los gusanos infectados por el patógeno cualquier etiqueta fluorescente.
Para los usuarios potenciales cabe señalar que el número de gusanos requeridos para ser resuelto depende de la naturaleza de los análisis posteriores y protocolos en uso. Por ejemplo, en el caso de análisis de microarrays de expresión génica,> se requerirán 1000 gusanos para obtener suficiente ARN, si se utilizan protocolos estándar, pero ~ 100 gusanos sería suficiente si se emplea la amplificación, permitiendo colección rápido de material y minimizando así el estrés a los gusanos.
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Protocol
1. La obtención de una Cultura Synchronized animales adultos jóvenes
- Crecer gusanos en varias NGM placas sembradas con OP50-1 E. bacterias coli (10x concentrado de un cultivo saturado) hasta muchos gusanos alcanzaron la etapa grávido.
- Tratar a los animales grávidos con solución huevo-prep para obtener un cultivo sincronizado (huevos).
- Huevos Placa en varios de 60 mm NGM placas sembradas con 10x OP50-1 concentrado a una densidad de aproximadamente 150 a 200 huevos / placa.
- Incubar las placas a 25 ° C durante 2 días (hasta que los gusanos han llegado a la L4 - etapa Adulto joven).
2. Preparación de las placas de Pseudomonas aeruginosa y la infección de Worms
- En el día de la huevo-PREP (paso 1.1) inocular un cultivo PA14 :: GFP en 2 ml de medio que contenía rifampicina B de King a una concentración final de 100 mg / ml. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación O / N.
- Placa del PA14 :: GFP cultura en el mayor número de placas Killing Lento (SKP), según sea necesario para el ensayo. En cada 150 mm SKP placa Petri pipeta 75-100 l de cultivo saturado y extender uniformemente usando un esparcidor de vidrio estéril. Incubar las placas a 37 ° C durante 20-24 h.
- Retire las placas de la incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente (~ 20 min). Uso de tampón M9, lavar los gusanos de la etapa 1.4 en PA14 :: placas de GFP en un volumen mínimo de líquido. Al utilizar placas de 150 mm, varios cientos de gusanos se pueden colocar en una sola placa.
- Incubar las placas a 25 ° C durante 18-21 horas. Para P. gusanos adultos jóvenes expuestos aeruginosa, esta es la ventana de tiempo que muestra la distribución óptima de los colonizados contra los animales no colonizados.
3. Configuración del Wormsorter
Antes de realizar la muestra tipo, asegúrese de que la máquina está funcionando correctamente. Los detalles se pueden obtener en http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, y thcorreos pasos esenciales se describen a continuación.
- Ajustar la presión de la válvula de la vaina de aproximadamente 5 psi (4.5 a 5.5 rango).
- Para comprobar que la velocidad de flujo de fluido de funda es apropiado, coloque un tubo cónico de 15 ml debajo del dispensador, gire la válvula de la vaina, y cierre la válvula del clasificador. Sostenga el tubo debajo del dispensador durante 60 segundos. El volumen en el tubo debe ser de 9-10 ml. Si es fuera de este rango, ajuste la presión de la válvula vaina consecuencia.
- Para garantizar que el caudal de fluido de funda (establecido como en el paso 3.2) permitirá la clasificación exacta, probar la velocidad de clasificación usando 40 partículas micras de control:
- Cierre la válvula de la vaina. Añadir aproximadamente 25 ml de solución de partículas de control al depósito.
- Abra la válvula de la vaina, y la válvula de muestra.
- En el software de su ordenador, vaya a la "partícula de modo de control" y haga clic en Adquirir.
- Asegúrese de que la velocidad de flujo de partículas es de ~ 5-8 partículas / seg, con un TOF (tiempo de vuelo) se aproxima a la anchurade la partícula, 40 micras. Tal TOF indica que sólo un único 40 micras objeto está pasando a través a la vez. Si los valores se encuentran fuera de este rango, ajuste la configuración (siguiendo las instrucciones anteriores) en consecuencia.
4. Ordenando Colonizada vs noncolonized Worms
- Uso de M9, lavar gusanos en tubos cónicos de 15 ml. Permitir gusanos adultos se hundan hasta el fondo del tubo por gravedad y eliminar el sobrenadante. Llene el tubo con frescos M9. Repita este proceso 3-4x. Esto elimina una gran proporción de larvas, así como el exceso de bacterias y tarda unos 10 min.
- Añadir gusanos al depósito wormsorter con una pequeña barra de agitación suavemente-mezclado.
- Ajuste la ganancia de la señal inicial estableciendo el PMT verde a 600 y el rojo y el amarillo PMT 200.
- Comience la adquisición de datos para ajustar la configuración.
- Trate de mantener un tipo de clase de 25 a 30 eventos (gusanos) por segundo. Si la tasa de número es demasiado alto, diluir los gusanos en el depósito con M9 en consecuencia. Si la tasa eso bajo, añada más gusanos en un pequeño volumen de M9.
- Si el experimento requiere una separación muy estricta de colonizado vs gusanos no colonizados, establezca el "control de coincidencia" a "puro". Esto asegura que en el caso de que dos objetos se producen demasiado cerca unos de otros o en la misma gota, la máquina rechaza la gota en lugar de recogerla.
- Para clasificar la población de interés, dibujar puertas alrededor de los ejes que indican el tamaño (para obtener gusanos adultos) y la intensidad de fluorescencia (es decir, alto para colonizada, baja para no colonizada). Los valores de fluorescencia para inyección deben ser determinadas empíricamente.
- Coloque una placa de múltiples pocillos o una placa de Petri debajo del dispensador para recoger gusanos a continuación, abra la válvula de tipo para comenzar a ordenar los gusanos.
- Se recoge una pequeña población de animales para verificar al microscopio que la población ordenados es la población de interés. Si no es así, ajuste los parámetros de compuerta de acuerdo y continuar con la recogida de muestras.
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Representative Results
Cuando se combina la edad, genéticamente idénticos C. elegans están expuestos a P. aeruginosa, una amplia distribución se observa en los niveles de colonización (Figura 1A). Con la ayuda del protocolo descrito aquí separación eficiente de no colonizada de gusanos colonizados se puede lograr (Figura 1B). A diferencia de los gusanos no colonizados, gusanos colonizados muestran signos de daño, tales como la lentitud y la reducción de la defecación al aire 19. Esta última puede ser una razón por la cual los gusanos colonizados por P. aeruginosa tiene dificultades para eliminar la infección. Esto tiene implicaciones directas para el protocolo descrito lo que sugiere que los gusanos ordenados como no colonizada no fueron colonizadas previamente. Para probar directamente si esta afirmación es correcta, gusanos colonizados recogidos a mano fueron sometidos a lavado de medidas similares a las del experimento de selección y posteriormente se examinan bajo un microscopio de fluorescencia, sólo 4/56 aclaró el patógeno. Por lo tanto, es probable ªen la proporción de gusanos previamente colonizados-entre aquellos clasificados como no colonizada es insignificante. Sin embargo, es recomendable monitorear los cambios en la colonización durante las etapas de lavado para prevenir los efectos de la clasificación errónea sobre el análisis, que pueden ser más de un problema para otros patógenos que P. aeruginosa.
El trabajo previo, con el protocolo descrito aquí utilizado gusanos ordenados para un análisis de microarrays de expresión génica y observaron respuestas esencialmente idénticas a P. aeruginosa en las poblaciones de gusano colonizados y no colonizados que habían sido expuestos al patógeno para la misma cantidad de tiempo 19. La figura 2 muestra la misma tendencia utilizando cuantitativa (Q) RT-PCR para medir la expresión de cuatro genes, que se sabe que parte de la C . elegans respuesta inmune: lys-2 codifica una lisozima, F08G5.6 y F55G11.2 dos genes no caracterizados, que responden específicamente a la infección, de los cuales el primero también contribuye a la infecciónresistencia ción, y pgp-5, que responde a la infección, así como al estrés por metales pesados. Todos los cuatro genes fueron inducidos de manera similar por P. la exposición aeruginosa, independientemente del estado de colonización de los gusanos. Esto corrobora los resultados publicados anteriormente indican que la colonización y el daño asociado no son necesarios para una respuesta inmune, en lugar que apunta a patrones moleculares asociados a patógenos como la señal. Que PGP-5 se induce en los animales no colonizados, que no se espera que se experimenta grandes daños, sugiere una superposición en los programas reguladores que controlan la respuesta inmune y las respuestas al estrés en general en C. elegans.
Figura 1. Colonizados y no colonizados C. elegans separada por medio de un wormsorter. (A) Imagen representativa de tipo salvaje adulto C. elegans expuestos a GFP-expresando P. aeruginosa durante 18 horas. (B) Imágenes representativas de unos gusanos noncolonized y colonizados separados utilizando la wormsorter. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La colonización no se requiere para la respuesta transcripcional a P. aeruginosa. los niveles de ARN de Lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), y pgp-5 (D) medido por QRT-PCR en animales de tipo salvaje expuestos a E. coli o P. aeruginosa </ Em> de ~ 18 hr. Se muestran los medios y desviación estándar de las mediciones duplicadas de un experimento, que es un representante de tres. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Materiales y reactivos necesarios para un experimento de wormsorter.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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