Summary
Den wormsorter underlättar genetiska skärmar i Caenorhabditis elegans genom att sortera maskar enligt uttryck av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi en ny användning: sortering efter kolonisering av en GFP-uttryckande patogen, och vi använder den för att undersöka dåligt förstådda roll patogen erkännande i att initiera immunsvar.
Abstract
Den wormsorter är ett instrument som är analogt med en FACS-maskin som används i studier av Caenorhabditis elegans, typiskt för att sortera maskar baserade på expression av en fluorescerande reporter. Här lyfter vi en alternativ användning av detta instrument, för att sortera maskar i förhållande till graden av kolonisering av en GFP-uttryckande patogen. Denna nya användning tillät oss att få förhållandet mellan koloniseringen av masken tarmen och induktion av immunsvar. Medan C. elegans immunsvar mot olika patogener har dokumenterats, det är fortfarande okänt vad som initierar dem. De två möjligheter (som inte utesluter varandra) är erkännandet av patogen-associerade molekylära mönster, och upptäckt av skador som orsakas av infektion. För att skilja mellan de två möjligheter, måste exponering för patogenen att skilja från de skador den orsakar. Den wormsorter aktiverat separation av maskar som extensivt koloniserades av Gram-negative patogen Pseudomonas aeruginosa, med skador som sannolikt orsakats av patogener last, från maskar som exponerats på liknande sätt, men inte, eller marginellt, koloniserade. Dessa skilda populationer användes för att bedöma förhållandet mellan patogen belastning och induktion av transkriptionsimmunsvar. Resultaten tyder på att två dissocieras, stödja möjligheten att patogenen erkännande.
Introduction
Automatisk mask sortering är ungefär som FACS, som verkar genom att mäta en fluorescerande signal i en mask (normalt från transgent uttryck av reporterproteiner) när den passerar rätade i ett rör, vilket gör omdirigering antingen till ett provrör / bra eller till en avfallsbehållare enligt till slussning parametrar som forskaren 1. Den wormsorter kan underlätta forskning på många sätt, ett exempel på att använda det som ett analytiskt verktyg är en studie som följde Spatiotemporal mönster av promotoraktivitet för nästan 1.000 gener 2.
Emellertid är den huvudsakliga användningen av wormsorter i genetiska skärmar, efter målgenuttryck nivåer eller lokalisering av fluorescerande protein längs axeln av snäck 3-5.
Här beskriver vi en ny ansökan om wormsorter, i följande koloniseringen av masken med en fluorescensmärkta patogen. Med detta som ett verktyg som vi fokuserat på förhållandet mellan Pathogsv kolonisering / belastning och immunförsvaret, för att få nya insikter i de mekanismer som ansvarar för initiering av immunsvar i masken.
I praktiskt taget alla organismer som studerats hittills, initiering av medfödda immunsvar mot patogena mikroorganismer är beroende av erkännande av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), och / eller fara / skada-associerade molekylära mönster (dämpas) 6,7. Den första är bevarade mikrobiella strukturer som inkluderar komponenter i den mikrobiella cellväggen, dess flagellum, eller dess membranet 6, den andra omfattar både släppt molekyler (t.ex. ATP 8), förändrade proteiner eller andra markörer för förändrade cellulära processer 9,10. Båda typerna av signaler känns igen av proteiner som betecknas som mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS), som vid specifik bindning av en mönstermolekyl aktiverar en kedja av händelser som leder till ett skyddande svar. C. elegans har varit extremt användbar som en tractable modell att dissekera olika aspekter av värd-patogen interaktioner, men en sak som inte har förstått är hur immunsvar initieras i masken. Ingen av de förmodade receptorer som är ortologa till mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) i andra organismer har visat sig binda PAMPs, och många av ortologer PRRS som är avgörande för immunsvar hos andra organismer visar en förvånansvärt begränsat bidrag till mask patogena svar och motstånd. Till exempel är Drosophila Toll-receptorn, som är nödvändig för att motstå grampositiva patogener, som representeras i C. elegans med en enda homolog, tol-1, vilket bidrar till skydd mot gramnegativa patogener Salmonella Typhimurium 11, men inte från andra testade gramnegativa, eller positiva patogener 11,12. Dessa observationer i kombination med data som indikerar att immunsvar kan induceras genom att störa cellulära proteinet översättnings hsom ledde en del som tyder på att C. elegans detekterar primärt dämpar 9,13,14. Trots rapporter som beskriver förmåga döda patogener för att inducera immunsvar tyder på att PAMP bindning kan ha en viktig roll i patogen erkännande i C. elegans 15,16. Tidigare arbete med inriktning på immunsvar i ålders synkroniseras genetiskt identiska C. elegans populationer, visade stor individuell variation i intestinal kolonisering av den bakteriella gramnegativa patogener Pseudomonas aeruginosa.
Men transkriptionsprofileringsstudier behandlade dessa variabelt-koloniserade befolkningsgrupper som en enhet 17,18. Med utnyttjande av denna variation, utvecklade vi ett protokoll fokuserar en automatiserad wormsorter att separera differentiellt koloniserade populationer av Caenorhabditis elegans som utsätts för GFP-uttryck P. aeruginosa. Undersöka genuttryck i olika-koloniserade befolknings facilitated bedömning av förhållandet mellan patogen belastning (och tillhörande skador) och immunsvar och som nya insikter om patogen erkännande i C. elegans 19. Nedan beskriver vi de protokoll, som skulle kunna tillämpas för att sortera maskar infekterade med någon fluorescerande patogen.
Till potentiella användare bör det noteras att antalet maskar som måste redas ut beror på typen av efterföljande analyser och protokoll som används. Till exempel, i fallet med mikroarray genuttrycksanalys,> 1000 maskar kommer att krävas för att erhålla tillräckligt med RNA, om standardprotokoll används, men ~ 100 maskar skulle räcka om förstärkning används, tillåter snabb insamling av material och på så sätt minimera stress för maskarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skaffa en synkroniserad Kultur för unga vuxna djur
- Odla maskar på flera NGM plattor ympats med OP50-1 E. coli-bakterier (10x koncentrerad från en mättad kultur) förrän många maskar har nått gravid scenen.
- Behandla gravida djur med ägg-prep-lösning för att erhålla en synkroniserad kultur (ägg).
- Tallrik ägg på flera 60-mm NGM plattor ympades med 10x koncentrerad OP50-1 vid en densitet av ungefär 150 till 200 ägg / platta.
- Inkubera plattorna vid 25 ° C under två dagar (tills maskar har nått L4 - Ung vuxen steg).
2. Förbereda Pseudomonas aeruginosa Plattor och Infecting Worms
- På dagen för ägget-prep (steg 1,1) ympa en PA14 :: GFP kultur i 2 ml av Kings B-medium innehållande rifampicin vid en slutlig koncentration av 100 ug / ml. Inkubera kulturen vid 37 ° C under omröring O / N.
- Plate den PA14 :: GFP culture på så många Långsam Killing Plates (SKP) som behövs för analysen. På varje 150 mm SKP petriskål pipett 75-100 pl mättad kultur och fördela det jämnt med en steril glasspridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 20-24 timmar.
- Ta bort plattorna från inkubatorn och låt dem svalna till rumstemperatur (~ 20 min). Använda M9-buffert, tvätta maskar från steg 1,4 till PA14 :: GFP plattorna i en minimal volym av vätska. Vid användning av 150 mm plattor, kan flera hundra maskar placeras på en enda skylt.
- Inkubera plattorna vid 25 ° C under 18-21 timmar. För P. aeruginosa-utsatta unga vuxna maskar, är det dags fönster som visar den optimala fördelningen av koloniserade vs noncolonized djur.
3. Ställa in Wormsorter
Innan provet sortera, se till att maskinen fungerar som den ska. Detaljer kan erhållas http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, och the viktiga steg beskrivs nedan.
- Ställ manteln ventiltrycket till ca 5 psi (4,5-5,5 intervall).
- För att kontrollera att mantelvätskeflöde är lämpligt, placera en 15 ml koniskt rör under dispensern, slå på skidan ventilen och stäng av sorteringsventilen. Håll röret under dispensern för 60 sek. Volymen i röret ska vara 9-10 ml. Om den är utanför detta område, justera fodralet ventiltrycket i enlighet därmed.
- För att säkerställa att flödet omslutande vätska (satt som i steg 3.2) tillåter noggrann sortering, testa sorteringshastighet med 40 ìm kontroll partiklar:
- Stäng av mantelventil. Lägg till ca 25 ml kontroll partikellösningen till reservoaren.
- Slå på manteln ventilen och provet ventilen.
- På datorprogram, navigera till "kontrollpartikelläge" och klicka förvärva.
- Se till att partikelflödet är ~ 5-8 partiklar / sek, med en TOF (Time Of Flight) approximera breddav partikeln, 40 | im. En sådan TOF indikerar att endast en enda 40 fim objektet passerar genom åt gången. Om värden utanför detta område, justera inställningarna (efter anvisningarna ovan) i enlighet därmed.
4. Sortering koloniseras vs Noncolonized Worms
- Med hjälp av M9, tvätta maskar i 15 ml koniska rör. Tillåt vuxna maskar att sjunka till botten av röret genom gravitation och avlägsna supernatanten. Fyll röret med färsk M9. Upprepa denna process 3-4x. Detta tar bort en stor del av larver liksom skjutande bakterier och tar ca 10 min.
- Lägg maskar till wormsorter behållaren med ett lätt-att blanda små omrörare.
- Justera inledande signalförstärkningen genom att ställa den gröna PMT till 600 och den röda och gula PMT till 200.
- Börja skaffa information för att justera inställningarna.
- Sikta på en sorts hastighet av 25-30 händelser (maskar) per sekund. Om antalet är för hög, späd maskarna i reservoaren med M9 därefter. Om priset är atto låg, lägga till fler maskar i en liten volym av M9.
- Om försöket kräver en mycket stringent separation av koloniserade vs noncolonized maskar, ställ in "slump check" för att "rena". Detta garanterar att om två objekt inträffar alltför nära varandra eller i samma droppe, avvisar maskinen nedgången snarare än att samla in den.
- För att sortera population, rita grindar runt axlarna anger storlek (för att få vuxna maskar) och fluorescensintensiteten (dvs. högt för koloniserade, låg för noncolonized). Värdena för fluorescens gating måste bestämmas empiriskt.
- Placera en flerbrunnsplatta eller en petriskål under dispensern för att samla maskar sedan öppnar sorterings ventilen att börja sorting maskar.
- Samla en liten population av djur för att kontrollera i mikroskop att den sorterade befolkningen är populationen av intresse. Om inte, justera grindparametrarna i enlighet med detta och fortsätta med provtagning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När åldersmatchade, genetiskt identiska C. elegans utsätts för P. aeruginosa, är en bred spridning observerades i nivåer av kolonisering (Figur 1A). Med hjälp av det protokoll som beskrivs här för effektiv separation av noncolonized från koloniserade maskar kan uppnås (Figur 1B). Till skillnad noncolonized maskar, koloniserade maskar visar tecken på skada, som till exempel långsamma och minskad avföring 19. Det senare kan vara en anledning till varför maskarna koloniserades av P. aeruginosa har svårt att rensa infektion. Detta får direkta konsekvenser för den beskrivna protokollet tyder på att maskar sorterade som noncolonized inte tidigare koloniserade. För att direkt testa om detta påstående är korrekt, var handplockade koloniserade maskar utsatts för liknande tvättsteg som de i sortering experimentet och därefter undersöks under ett fluorescerande mikroskop, endast 4/56 rensas patogenen. Därför är det sannolikt thpå andelen tidigare koloniserade maskar bland de som har sorterats som noncolonized är försumbar. Men är det lämpligt att övervaka förändringar i kolonisering under tvättsteg för att förhindra effekterna av felaktig sortering på analys, som kan vara mer av en fråga för andra patogener än P. aeruginosa.
Tidigare arbete som utnyttjar det protokoll som beskrivs här används sorterade maskar för en microarray genuttrycksanalys och observeras i huvudsak identiska svar på P. aeruginosa i koloniserade och noncolonized snäckpopulationer som hade exponerats för patogenen för samma tid 19. Figur 2 visar samma trend med hjälp av kvantitativa (q) RT-PCR för att mäta uttrycket av fyra gener, kända för att vara en del av C . elegans immunsvar: lys-2 kodar för ett lysozym, F08G5.6 och F55G11.2 finns två okarakteriserade gener, som reagerar specifikt till infektion, av vilka den första också bidrar till infektiontion motstånd, och pgp-5, som svarar på infektion samt heavy metal stress. Alla fyra gener inducerades likaledes av P. aeruginosa exponering, oberoende av kolonisering statusen av maskar. Detta bekräftar tidigare publicerade resultat som visar att kolonisation och dess associerade skador inte krävs för ett immunsvar, i stället pekar på patogen-associerade molekylära mönster som signalen. Att pgp-5 induceras i noncolonized djur, som inte förväntas ha drabbats av omfattande skador, föreslår en överlappning i de reglerande program som styr immunsvar och allmänna stressreaktioner i C. elegans.
Figur 1. Koloniseras och noncolonized C. elegans separerades med användning av en wormsorter.. (A) representant bild av vildtyp vuxen C. elegans exponerade för GFP-uttryck P. aeruginosa i 18 timmar. (B) Representativa bilder av en noncolonized och koloniserade maskar separeras med hjälp av wormsorter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Colonization krävs inte för den transkription svar på P. aeruginosa. RNA-nivåer av lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C), och PGP-5 (D) mätt genom QRT-PCR i vildtyp djur exponerades för E. coli eller P. aeruginosa </ Em> för ~ 18 timmar. Här visas medelvärden och SD av dubbla mätningar från ett experiment, vilket är en representant för tre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Material och reagens som behövs för en wormsorter experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod vi beskriva utnyttjar fluorescerande märkning av enheter utanför masken, för att följa växelverkan mellan masken och dess miljö. I det fall vi presenterar, var separation baserad på märkning av en patogen och var anställd för att separera maskar med tung patogen lasten från de utan (eller ljus) belastning. Efterföljande genuttrycksanalys fann ingen skillnad i immunsvar mellan de två grupperna tyder på att de var oberoende av patogen belastning. Signalen som initierar svaret visades någon annanstans för att vara fysiskt associerade med bakterierna, i stället för att utsöndras, vilket tyder på att denna signal kan vara en PAMP. Tillsammans stödde dessa resultat hypotesen att PAMP erkännande spelar en roll i att initiera immunsvar i C. elegans 19.
En fördel med sorteringsprotokoll som beskrivs ovan är att både koloniseras och noncolonized maskar är isolerade från en enda population. Thär beroende av att ha en befolkning med en optimal fördelning av djur som koloniseras vs noncolonized. Vi har funnit att när infekterar unga-vuxna, vildtyp maskar med P. aeruginosa, innebär detta en exponeringstid på ca 18 timmar. Denna exponering-tid producerat en befolkning där majoriteten av djuren koloniserades till en "intermediär" grad, men flera hundra maskar visade fullt kolonisering, och lika många var noncolonized. Detta är visserligen en optimal fördelning för våra syften, andra kan definiera sina egna optimal fördelning.
Under sortering, är det lämpligt att ha "kvalitetskontroller" som är inbyggda i varje experiment. Vi gjorde det på två sätt. En, för genuttryck studier, vi handplockade ett litet antal (koloniserade och noncolonized) maskar under ett fluorescerande dissekera mikroskop, som kan användas för QRT-PCR på ett begränsat antal gener. Dessa fungerar som den "gyllene standarden" för vilken gen expressipå i en verkligt ren population skulle se ut. För det andra är det bra att sortera 20 eller fler maskar på en plåt för varje sorteras automatiskt population för att kontrollera under ett fluorescerande mikroskop att instrumentet fungerar som förväntat. Beroende på nedströms ansökan, kan olika grader av "trohet" i sorteringsprotokollet krävas. När sorterade maskar inte överensstämmer med den önskade graden av kolonisering, bör grindparametrarna justeras (steg 4,7). Det bör noteras att den strängare grindarna är, desto högre det initiala antalet maskar som behövs, och experiment bör ökas i enlighet därmed.
Det experiment som beskrivits här kan utföras med någon patogen av intresse (så länge som det är fluorescensmärkta). Efter sortering, behöver efterföljande analyser behöver inte följa genuttryck analys, och kunde fokusera på överlevnad eller till och med beteendeanalys. Dessutom kan liknande protokoll användas för analysändamål, Följa metabolit absorption, eller att kvantifiera patogen belastning, varvid de senare ger ett enklare alternativ till CFU-räkningar, som är mycket variabel 20,21. Ökningen i antal och i hastighet kan underlätta kvantifiering patogen belastning under olika förhållanden, inklusive genetiska störningar i den mottagande eller patogenen, och olika miljöförhållanden. Eftersom vidare wormsorter kan utrustas för att detektera flera fluorescerande molekyler, spårning kolonisering behöver inte begränsas till en enda typ av bakterier. Denna förmåga skulle vara användbart för ekologiska studier, vilket gör att olika mikrober att konkurrera om kolonisering. I laboratoriestudier av patogenes, C. elegans typiskt odlat på en bakteriell monokulturer. Dock är studiet av mekanismer för medfödd immunitet i naturen, där patogener finns bland hundratals andra mikroorganismer som kan påverka immuniteten börjar samla uppmärksamheten 22,23.
Sammanfattningsvis using den wormsorter för ett brett spektrum av applikationer tillåter experiment som skall utföras på en kort tid, och / eller på stor skala. Utöka repertoaren av sådana ansökningar skulle kunna förbättra vår förståelse av C. elegans fysiologi. I synnerhet inom området för C. elegans medfödd immunitet, är överlevnaden ett ofta använt mått för att testa bidragen från olika gener. Dock är kolonisering mer proximal till de händelser som initierar immunitet samtidigt som det ger en funktionell utgång. Med hjälp av protokoll som beskrivs här för att isolera och / eller analysera populationer av intresse är ett värdefullt verktyg för att studera olika aspekter av de tidiga händelserna i immunsvar hos masken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Ellison Medical Foundation för deras stöd. Vi vill också tacka medlemmarna av Abby Dernburg laboratorium för hjälp med att använda wormsorter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
- Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
- Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
- Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
- McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
- Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
- Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
- Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
- Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
- Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).
