Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными В месте Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание

Published: January 23, 2014 doi: 10.3791/51091
Automatic Translation
1,2,5, 4, 4, 1,2,3
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

Summary

Мы установили флуоресцентной гибридизации протокола месте в для обнаружения упорной вирусной ДНК генома в пределах срезов ткани животных моделях. Этот протокол позволяет изучение инфекционного процесса по codetection вирусного генома, его РНК продуктов, а также вирусными или клеточными белками в пределах отдельных клеток.

Abstract

Одноместный клеток codetection гена, его продуктом РНК и клеточные регуляторные белки имеет решающее значение для изучения регуляции экспрессии генов. Это вызов в области вирусологии, в частности для применения в атомной тиражирование стойких вирусов ДНК, которые включают модели животных для их изучения. Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) устанавливает пожизненное латентной инфекции в периферических нейронах. Латентный вирус служит резервуаром, из которого он реактивирует и вызывает новую герпетической эпизод. Клеточной биологии ВПГ-1 задержки еще малопонятным, отчасти из-за отсутствия методов обнаружения ВПГ-1 геномов на месте в животных моделях. Мы описываем ДНК-люминесцентные в гибридизация (FISH) подход эффективно обнаруживать низким копирования вирусных геномов внутри разделов нейронных тканей от инфицированных животных моделях. Метод основан на основе термической антигена разоблачения, и непосредственно меченые самодельные ДНК-зонды, или коммерчески доступные датчики. Мы разработали тройную СтаиНин подход, сочетающий ДНК-FISH с РНК-FISH и иммунофлюоресценции, используя усиление сигнала пероксидазную основе для размещения каждое требование окрашивания. Основным усовершенствованием является возможность получения в течение 10 мкм срезов тканей, низкофоновых сигналов, которые могут быть отображены с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии и широким полем обычной эпифлуоресцентной. Кроме того, тройной окрашивание работал с широким спектром антител, направленных против клеточных и вирусных белков. Полный протокол занимает 2,5 дня, чтобы разместить антитела и проникающий зонд в ткани.

Introduction

Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) является постоянным человеческий вирус нейротропным, установление долгосрочного латентной инфекции в нейронах тройничного ганглиев (ТГ) периферической нервной системы, от которой он реактивирует периодически копировать и распространяться. ВПГ-1 геном является 150 кб днДНК локализация в ядре принимающей нейрона, где он остается как MultiCopy chromatinized плазмиды, которые не интегрироваться в принимающих-геном клетки 1,2. Во время задержки, генетический программа ВПГ-1 репликативной цикл сильно подавлены, и экспрессия гена ограничена латентного связанных транскрипта (LAT) локуса, от латентного установления к инициации реактивации 3. LAT выдает длинный 8.5 KB некодирующих РНК обработанный в крупный 2 кб стабильной лассо, и несколько микроРНК 4-7. ВПГ-1 задержки, таким образом, характеризуется наличием вирусной геномной ДНК, РНК LAT, а также отсутствие обнаруживаемых репликативных белков цикла.

ontent "> Животные модели, преимущественно мыши и кролика, экспериментальные модели Резюмируя несколько особенностей задержки в человека. Одним из главных интересов этих моделей является то, что они позволяют изучать физиологические аспекты HSV-1 задержки в иммунокомпетентных. За последние десятилетия , много экспериментальных инструментов, таких как генетически модифицированных вирусов и мышей, были разработаны для изучения физиологии, генетики и клеточной биологии HSV-1 задержки, из животных тканей. До сих пор вирусной геномной ДНК не была обнаружена и количественно с помощью саузерн-блоттинга и КПЦР от диссоциации ТГ. Тем не менее, в настоящее время нет доступный метод для выявления ВПГ-1 геном на в гибридизация на срезах тканей 8. Следовательно, задержка обычно начисленных на гистологических срезах путем выявления LAT РНК с помощью РНК в гибридизация, а не вирусная обнаружения генома. Потому что это было невозможно охарактеризовать инфицированные клетки в зависимости от наличия вирусных геномов, Тхис техническим ограничением была главным недостатком к анализу многими аспектами принимающей антивирусных взаимодействий, таких как отношения между вирусного генома и клеточной и генной экспрессии вирусного или клеточного иммунного ответа хозяина 9,10.

Самое главное, что неоднородность клетки к клетке из латентной инфекции остается относительно неисследованными и было показано, что одним из ключевых элементов задержки на мышах и в человеческих чувств нейронов ганглиев, имплантированных в SCID мышей 11-17. Как правило, было показано, кПЦР, что геном число копию HSV-1 в клетке колеблется от 5 до нескольких сотен. Хотя LAT появляется как ключевой регулятор латентности и реактивации, КПЦР данные о изолированных нейронов и в месте ПЦР показал, что только часть латентно инфицированных нейронов, по цене от 30%, выражает LAT локус 11,12,18-21. Как клетка-хозяин и сотовый среда, в воздействии ткани о создании латентного вируса ивыражение вирусный ген, остается неясным. Здесь мы опишем надежную люминесцентные в гибридизация (FISH) метод для эффективного обнаружения низкого копирования HSV-1 геномной ДНК в животных секциях нервной ткани. Такой метод был разработан и используется нами, чтобы получить доступ к высоким разрешением микроскопии изображений, которая необходима для изучения взаимодействия вирусного генома с клеткой-хозяином внутри ядерных компонентов 22. Кроме того, мы опишем метод множественного окрашивания для одновременного обнаружения вирусной ДНК с РНК и белков, что является уникальным инструментом для описания вирус-хозяин взаимодействий, которые регулируют экспрессию вирусных генов. Способ также может применяться для широкого диапазона испытаний, требующих обнаружения HSV-1 латентного генома, например, количественной зараженные нейроны в большом количестве секций. Ключевым шагом является применение антиген лечение извлечения сделать вирусная ДНК доступной для гибридизации. Таким образом, этот протокол также может быть эффективным для обнаружениядругих вирусов двухцепочечной ДНК, которые в настоящее время не обнаружено обычными подходов ДНК-промысел в тканях животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот метод был использован в исследовании, опубликованном ранее 22. Для общем фоне и описание обычного манипулирования на ISH, IF и рыбу, мы предлагаем следующую доступную литературу 23.

1. Животное Инфекция

Все процедуры, связанные с экспериментальных животных соответствовали этическим вопросам из Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление на использование животных в научных исследованиях, и они были одобрены местным комитетом по этике УПО-3296-CNRS, по в соответствии с Европейским сообществом Директива Совета 86/609/EEC. Все животные получали неограниченный доступ к пище и воде.

Способ инфекции мыши с HSV-1 описано ниже был использован в ранее опубликованных исследований 24-26.

  1. Подготовьте следующие решения для подготовки перед запуском:

    ВПГ-1 вируса раствор
    Обезболивающий решение - Ketaminэлектронной 100 мг / кг и ксилазина-10 мг / кг
  2. Поднимают 1 мкл вируса (10 6 БОЕ) в 5 мкл стекла микрошприца, подключенного к микрошприцу насоса устройства доставки 0,1 мкл / сек. Примечание: Ресуспендируют вируса запас в фенолового красного среде без видеть граница между красного масла представить в капилляре и раствора вируса и, чтобы избежать инъекции воздуха в месте инокуляции вируса.
  3. Положите наркозом мышь (Кетамин-100 мг / кг и Ксилазин-10 мг / кг) на его задней лицевой стороной вверх.
  4. Расположите наркозом голову мыши под бинокулярным стерео-микроскопа и вставить иглу в субэпителиальной слоем левой верхней губой на слизистых границы. Введите раствора вируса в два этапа (дважды 0,5 мкл) при скорости 0,5 мкл на 5 сек. Примечание: Респект 10 сек паузы между двумя 0,5 мкл инъекции, чтобы дать возможность вирусной суспензии поглощать в месте инъекции.
  5. Наведите в37 ° C инкубатор до пробуждения.
  6. Оставьте мышь в объектах животного восстановиться в течение необходимого времени. Примечание: В модели мыши, ВПГ-1 вызывает первичную инфекцию, которая называется острая инфекция, которая длится менее 10 дней на месте прививки и в течение нескольких нейронных тканей, включая ТГ, верхний шейный ганглий (SCG), и ганглии задних корешков (DRG) в зависимости от месте прививки. Признаки первичной инфекции постепенно исчезают и задержки считается полностью создана около 28-30 дней после заражения (DPI) и далее. Нейронов ткани могут быть собраны, как правило, от 4 руб за исследования по острой инфекции, и с 28 точек на дюйм для задержки исследований.

2. Мышь перфузии-фикс

  1. Подготовьте следующие решения перед началом: 50 мл буфер физиологического раствора

    60 мл 1x PBS
    150 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида в 1х PBS
    60 мл 20% сахарозы в 1х PBS. <бр />
  2. Подготовка трубки перфузии: подключение иглу в капилляр, который соединен с перистальтическим насосом.
  3. Обезболить мышь, как описано выше (SREP 1.2) и положите его на спину на рассечение лоток, придаваемом четырех ногах с булавками.
  4. Использование ножницами вырезать кожу от живота до горла *. Сорвите тонкий слой ткани, покрывающей органы. Открытый грудную клетку путем разрезания ребер на одной стороне грудины. Снимите кожу при отрыве. Отойдите от друга право и левые части грудной клетки, чтобы выявить сердце Примечание:. Обратите внимание, чтобы не надрезать кишки, легких и большие сосуды (сонные артерии и яремной вены), которые сделают заливать-фиксация невозможно.
  5. Вставьте иглу в левом желудочке *. Надрезать правое предсердие с ножницами. Продолжайте обескровливания путем введения 20 мл физиологического раствора в кровеносных сосудах в сердце. Пусть кровоток в лоток. Неттэ: Во время этой процедуры, обращать внимание не на прокол через другую сторону сердца.
  6. Заливать 150 мл 4% PFA в 1x PBS в течение 15 мин * (Внимание: PFA является токсичным, манипулировать под вытяжным шкафом). Заливать 60 мл 20% сахарозы в 1x PBS в течение 6 мин. На этом этапе мышь готова для TG заготовки. Примечание: Установить насос 10 мл / мин. Хороший перфузии заметен, когда хвост мыши застывает, подними затем снова упадет.

3. Т.Г. Уборочная

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    20% сахарозы в 1x PBS
  2. Отрежьте голову на уровне шеи. Отрежьте кончик носа позади резцов с целью выявления полости носа. Надрезать неба в два с ножницами и отойти каждую сторону неба. Примечание: ТГ появляется прямо под небом, в виде двух белых и продолговатой формы масс 2-3 мм в длину, расположенной на правой илевой стороны и подключен к тройничного нерва.
  3. Вырезать тройничного нерва филиалы на каждой стороне ТГ выпустить ТГ из ствола мозга. Снимите ТГ с хирургическими щипцами и держать их в 20% сахарозы стерильного раствора в течение 24 часов. Примечание: Использование двух различных получателей для левой и правой ТГ, чтобы избежать путаницы между левым ТГ (зараженной) и правой ТГ (не или слабо заражены). Выдержите ТГ в 20% сахарозы в 1x PBS в течение 24 часов перед вложением.
  4. Код ТГ в одном блоке в cryosectioning вложение среды и замораживание при -80 ° С
  5. Храните блоки при -80 ° С до секционирования.

4. Cryosection Подготовка

  1. Разрежьте продольном TGS как 10 мкм разделов на -20 ° C криостат, и разместить их на слегка подогретой (30 ° С) SuperFrost слайды. Пусть ломтики высохнуть в течение 5-10 мин, затем заморозить и хранить при температуре -80 ° С до использования. Примечание: До 4-5 секции могут быть плаКНИ на одном слайде, если большое количество секций должны быть обработаны одновременно. Мы проделайте следующее: серийные срезы наносят на 3 серии слайдов с надписью A1, B1 и C1, то A2, B2, C2 и так далее. Таким образом, каждая серия слайд (A, B, и C) могут быть обработаны для различного окрашивания (в гибридизация, рыба, на месте ПЦР, LCM) и данные, полученные с помощью различных методов можно сравнить зная, что слайды, несущие такое же количество соответствуют в той же области ТГ.

5. ВПГ-1 Маркировка зонд

Протокол, описанное ниже для обнаружения HSV-1 генома ДНК FISH был успешно использован с двумя типами датчиков. Первым из них является самодельным Су3 меченных флуоресцентного зонда, который подходит для тонкой анализа ядерной организации в отдельных клетках, по большом увеличении флуоресцентной микроскопии. Второй является коммерчески доступным биотинилированного зонда, который может быть комбинироватьг с усилением сигнала пероксидазой основе, чтобы обеспечить светлое сигнал. Последний подходит для идентификации и количественного определения вируса, содержащего нейроны при малом увеличении в цельной части, и для анализа HSV-1 шаблонов генома. Конечные пользователи должны оценить, какой подход лучше всего подходит цель их изучения. Коммерчески доступный зонд перечислены в разделе реагента, а также подготовка самодельного зонда описан ниже.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    ВПГ-1 генома, содержащие векторы (см. шаг 1)
    70% этанол, молекулярная биология класса.
  2. . Подготовка космиды, содержащие 30 Kb части HSV-1 геномов (космиды число 14, 28, 56 и описано со ссылкой 20 с использованием колонки очистки, предназначенные для больших векторов Примечание: Другой тип библиотек, содержащих HSV-1 геномы, например, бактериальных искусственных хромосом должен работать, а, пока зонд охватывает альArge часть ВПГ-1 генома производить достаточное сигнал 27-29. В наших руках, зонды, изготовленные из космиды векторного скелета не производить никаких сигналов, и были использованы в качестве отрицательного контроля. Таким образом целые космидных векторы, содержащие ВПГ-1 последовательность были использованы в нашем исследовании. Кроме того, можно вырезать последовательность HSV-1 и использовать его для приготовления зонд.
  3. . Этикетка 2 мкг каждого космиде с Cy3-дЦТФ использованием набора ник-трансляции в соответствии с рекомендациями производителя Примечание: Выполните маркировку с реакционной смеси, содержащей только Су3 дЦТФ и не имеющей маркировки дЦТФ.
  4. Остановить реакцию добавлением 3 мкл 0,5 М ЭДТА в смеси и нагреванием при 70 ° С в течение 10 мин. Охладите на льду.
  5. Очищают зонд на G50 гель отчуждения миниколонку. Добавить 150 мкг ДНК спермы лосося с зондом и осадок зонд осаждением этанолом. Осадок ДНК должны быть розовыми из-за Cy3 регистрации. Вымойте гранул с 70% этанола и удалить как можно больше этаноланасколько это возможно с помощью пипетки. Не позволяйте гранул сухой.
  6. Растворите таблетку 100 мкл деионизированной формамидом (Внимание! формамид токсичен Манипулирование под вытяжным шкафом.). Концентрация зонд не может быть достоверно определена в этой точке. Указанные в тексте зонд величины относятся к количеству ДНК-матрицы, используемой для изготовления зонда. Протокол основываясь на 2 мкг ДНК-матрицы и 100 мкл формамида, она считается 20 нг / мкл. Хранить при -20 ° С. Меченый зонд может быть получен в больших количествах и хранить в замороженном виде в течение нескольких месяцев.

6. ДНК-FISH

На рисунке 1 показан обзор основных шагов протокола ДНК-FISH, и как выполнить ДНК-FISH в рамках многократного эксперимента окрашивания в codetect РНК и белка, как описано в Протоколы 7-9.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    0,5% Тритон Х-100 в 1x PBS
    2x SSC и 0,2 x SSC буфера
    100 мМ рН 6,0 цитрат буфера (10x раствор) и 10 мМ рН 6,0 цитрат буфер (рабочий раствор)
    2x гибридизации буфер (см. Протокол 4)
  2. В день 1, поместите препараты на держателе слайдов при комнатной температуре, и пусть разделы высохнуть в течение 10 мин. Обведите разделы с гидрофобным пера. Увлажняет секции в 1x PBS в течение 10 мин. Инкубируйте секций 20 мин с 0,5% Triton X-100 в 1x PBS в проницаемыми ткани. Вымойте 3x 10 мин с 2х SSC, и держать в 2х SSC до разоблачение буфер не нагревается (см. ниже).
  3. Для разоблачения, подготовить слайд лоток стекла (20 скользит мощности), заполненную 200 мл 10 мМ цитрат натрия буфером (рН 6,0). Поместите лоток в емкости большего объема, заполненную 500 мл дистиллированной воды. Этот параметр позволяет лучше контролировать отопления импульсов. Перед размещением слайды в лоток, не разогрейте буфер в микроволновой печи, пока буffer достигает кипения (около 8 минут при 800 Вт).
  4. Поместите слайды в предварительно разогретой цитрат буфера, содержащего лоток, и убедитесь, что они полностью покрыты буфера. Тепло в течение 20 секунд, пока буфер не достигнет кипения. Внимание, не позволяйте буфер над кипения, что может привести к повреждению тканей. Охладить при комнатной температуре в течение 2 мин. Повторите 6x отопление цикла (всего 7 циклов нагрева) *. Охладить 2 мин и передавать слайды в 2х SSC в течение 5 мин.
    Примечание *: Это одна из наиболее важных стадий. Оптимальное количество и продолжительность циклов нагрева должна быть определена эмпирически и могут варьироваться в зависимости от типа ткани или типа используемого зонда. Микроволновая печь, лоток, контейнер и объем буфера в лоток и воды в контейнере должны храниться одинаковы для воспроизводимости разоблачения. Чрезмерное кипения может привести к потере тканей и поврежденных клеток. Для каждого отопительного импульса, появление кипения, тщательно наблюдал, и теплоIng следует прекратить при первых признаках кипения. После настройки демаскирования появляется надежной и воспроизводимой. Фиг.2А показывает, что ВПГ-1 геном могут быть обнаружены демаскации различных буферов, указывая, что демаскирующих условия могут быть дополнительно изучены. Цитрат основе разоблачение было установлено, последовательно обеспечить хороший сигнал рыбу, и сохранение тканей, с разделами из различных моделей лабораторных и животных.
  5. Инкубируйте слайдов в метанол: уксусная кислота: PBS смеси (3:01:04) в течение 15 мин, а затем в метанол: смеси уксусной кислоты (3:1) в течение 15 мин (Внимание: уксусная кислота вызывает коррозию Манипулирование под дыма. капот и использовать адекватную защиту. Подготовьте это решение непосредственно перед использованием).
  6. Обезвоживают путем последовательного раздел 10 мин инкубации в 70%, то 2x 10 мин в 100% этаноле. Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 10 мин. не допускайте попадания воды до зондирования.
  7. Подготовьте зондирования решение следующим образом: заранее подготовить 20 мл запас 2х гибридизации буфера сотрудничестваntaining 20% ​​декстрансульфат (MW 500000), решение 2x Денхардта, 4x SSC *. Алиготе решение как 500 мкл в микропробирок, и хранить при температуре -20 ° С. За 1 слайд (покровное 22 мм х 50 мм), смешать 90 нг HSV-1 Су3 меченым зондом (30 нг зонда для каждого космиде), и завершить объем до 40 мкл с формамидом. Добавить 40 мкл 2х буфера гибридизации. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
    Примечание *: Для приготовления буфера 2х гибридизации, смешать 4 г МВт сульфата декстрана 500000 в 10 мл дистиллированной воды. Это делает вязкую смесь, которая растворяет по 3-4 часов при 70 ° С Смешайте регулярно, чтобы помочь растворить. Добавить 4 мл 20x SSC, 400 мкл 100x раствор Денхардта. Заполните до 20 мл и хорошо перемешать с помощью вихрь.
  8. Падение 80 мкл раствора на зондировании высушенных секций. Накрыть 22 мм х 50 мм покровным стеклом, и убедитесь, что зондирования решение распространяется нався поверхность покровного стекла. Внимание: не должно быть никаких пузырей. Наличие пузырьков снижает эффективность гибридизации. Уплотнение покровное использованием резиновый клей, и дайте ему высохнуть. Хранить слайды в темноте при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часов для оптимального сигнала гибридизации по всей слайда.
    Примечание: Резина цемент удобно, поскольку это быстро сохнет, является водонепроницаемым, и защищает образец от высыхания во время гибридизации. Это также легко шелушится удалить покровное после гибридизации. Лак для ногтей является альтернативным эффективным, но менее удобный вариант.
  9. Продолжайте денатурации путем размещения слайдов на 80 ° C слайд-инкубаторе в течение 5 мин. Кроме того, поместите препараты на металлический поднос и поместите лоток на водяной бане 80 ° C (лоток должен плавать). Тогда быстро передавать слайды на металлическую лоток помещают на лед. Оставьте на 5 минут. Трансфер слайды при 37 ° C (нагревателя слайд или инкубатора) на одну гибридизации. Примечание: Мы не рекомендуем короткую гибридизации, в результате чего слабая или отсутствие сигнала.
  10. В день 2, снимите резиновый клей щипцами, сохраняя слайд на нагреватель сохранить раздел при 37 ° С Удалить покровное мягко кончиком лезвие скальпеля.
  11. Wash 3x с 2х SSC при 37 ° С в течение 5 мин, и в три раза с 0,2 × SSC при 37 ° С в течение 5 мин. Вымойте один раз 2х SSC при комнатной температуре в течение 5 мин и заполните окрашивания ДНК и монтажа (см. Протокол 10 ниже).
    Примечание: Этот метод позволяет для обнаружения клеточных геномных мишеней, с использованием соответствующих зондов на зондирующего растворе вместе с HSV-1 специфических зондов, опубликованной в центромерной и прицентромерных последовательностей 22.

7. Двойной РЫБЫ РНК-ДНК

См. рисунок 1, зеленые ящики для обзора.

Для кратногоокрашивания процедуры, включая в шаге РНК-FISH, как правило, рекомендуется сначала выполнить обнаружение РНК в качестве такого цели чувствителен к деградации РНКазой и химикатов. Кроме того, процедура ДНК-FISH включает процедуры, которые снижают эффективность других окрашивания. Для РНК-FISH, мы выбрали фермент подход обнаружения (Tyramide Усиление сигнала (TSA), используя биотинилированных зондов и пероксидазу (HRP) в сочетании стрептавидином). АСП на основе флуоресцентной tyramide подложки (см. таблицу реагентов для деталей), который ковалентно связан с тканью с помощью реакции ферментативного пероксидаза. Сигнал РНК-РЫБА, таким образом, сохраняется в течение ДНК-FISH.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    Вектор для транскрипции в пробирке LAT локуса (pSLAT-2)
    1X PBS, содержащем 2 мМ РВК
    0,5% Тритон Х-100 в 1x PBS, содержащем 2 мМ РВК
    3% H 2 0 2 в дистиллированной воде.
    70%, 80%, 95% этанол, молекулярная биология класса.
    4x РНК решение гибридизации (см. Протокол 4)
  2. По крайней мере, за один день до эксперимента РНК-FISH, подготовить РНК FISH зонд. Для обнаружения HSV-1 задержки связаны Стенограмма (LAT), готовят биотинилированный рибо-зонд от pSLAT-2 вектора 30, или другого вектора в пробирке транскрипции локуса LAT, как описано выше в ссылке 26. Кратко: линеаризуем 10 мкг pSLAT-2 с HindIII и очистить расщепленного вектора с комплектом очистки ДНК. Обобщение одной нити рибо-зонда от 2 мкг переваренной pSLAT-2 с Т7 в пробирке транскрипции комплекта в присутствии биотин-16-UTP *. Очищают зонд с мини-колонки РНК и количественного при 260 нм с помощью спектрофотометра. Развести зонда при 50 нг / мкл ДНКазы в / РНКазы свободной воды и хранить при температуре -80 ° С, в виде небольших аликвот, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
    Примечание *: биотин-16-UTP: соотношение UTP необходимо эмпирически определяется. Мы екруглый соотношение 40:60 создание зондов эффективно обнаруживая LAT РНК-FISH.
  3. В день 1, поместите препараты на держателе слайдов при комнатной температуре, и пусть разделы высохнуть в течение 10 мин. Обведите разделы с гидрофобным пера. Увлажняет разделы в 1x PBS, содержащем 2 мМ рибонуклеозид ванадильного комплекса (РВК) * в течение 10 мин. Инкубируйте разделы в течение 20 мин с 0,5% Triton X-100 в 1x PBS, содержащем 2 мМ РВК в проницаемыми ткани. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS, 2 мМ РВК. Утолить любой активности эндогенной пероксидазы, инкубировать раздел в 3% H 2 O 2 для 2х 10 мин, а затем мыть один раз с 1x PBS, 2 мМ РВК.
    Примечание *: Во время процедуры РНК-FISH, рибонуклеозид ванадильного комплекса (РВК) добавляется к буферов и решений для предотвращения деградации РНК.
  4. Выдержите 2x 10 мин в 70%-ном этаноле. На этом этапе секции могут быть сохранены в 70% этаноле при -20 ° С в течение нескольких недель. Высушить секции путем инкубации в 80%, 95% и 100% ETHAnol, 5 мин каждый. Пусть раздел высохнуть в течение не менее 10 мин.
    Примечание: В некоторых случаях лечение этанол может быть вредным для обнаружения других целей. Альтернативный протокол, используя шаг Предгибридизацию в 50% формамиде - 2x SSC может быть использован (см. ниже в Протоколе 9 Подробнее о тройной окрашивания). Однако лечение этанола является наиболее универсальным подходом для РНК-FISH и обеспечивает самую низкую фон.
  5. Подготовьте зондирования решение следующим образом: заранее подготовить 10 мл запас 4-кратным РНК гибридизации раствора, содержащего 8x SSC, 20x раствор Денхардта, 4 мМ ЭДТА, 40% декстран *. Алиготе решение как 500 мкл в микропробирок, и хранить при температуре -20 ° С. За 1 слайд подготовить 80 мкл раствора (покровное 22 мм х 50 мм), путем смешивания 20 нг биотинилированного LAT рибозонд, 40 нг тРНК дрожжей, 2 мм РВК и полное 20 мкл водой. Добавить 20 мкл 4-кратным РНК гибридизации решения, и 40 мклформамида (50% конечная концентрация). Для облегчения пипетки и перемешивания, рекомендуется prewarm на 4x РНК решение гибридизации при 75 ° С Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
    Примечание *: Для приготовления РНК гибридизации решение 4x, смешать 4 г сульфата декстрана (MW 500000) в 3 мл дистиллированной воды и 4 мл 20х SSC. Это делает вязкую смесь, которая растворяется при 3-4 ч при 70 ° С Смешайте регулярно, чтобы помочь растворить. Добавить 2 мл 100x раствор Денхардта и 80 мкл ЭДТА 0,5 М. Заполните до 10 мл воды и хорошо перемешать с помощью вихрь. Внимание: используйте только РНКазы / ДНКаза бесплатные продукты.
  6. Денатурация зонд 10 мин при 75 ° С Между тем, поместите препараты на слайд инкубатор до 65 ° С Оставьте 80 мкл раствора зонда на секциях и быстро разместить покровное на капли. Внимание: не должно быть ни один пузырь. Наличие пузырьков уменьшается гибридизации эффiciency. Инкубационный должно происходить во влажной камере с покровное не запечатан. Используйте либо слайд-инкубатор, который может удерживать воду (см. материал таблицу), или подготовить влажной камере в запечатанной коробке и поместить его в 65 ° C гибридизации духовке.
  7. Выдержите в течение ночи при 65 ° C. Примечание: LAT RNA-FISH проводится при 65 ° С для предотвращения неспецифического связывания зонда, которое наблюдается при 37 ° С Многие другие РНК-зонды FISH должно привести к хорошим сигналом при 37 ° С
  8. В день 2, перед началом стирки, приготовления реагентов обнаружения в соответствии с инструкциями завод-изготовитель комплекта обнаружения TSA. Обнаружение осуществляется с помощью коммерческого набора TSA обнаружения, включающей в себя пероксидазой хрена (HRP) в сочетании стрептавидином и зеленого или синего флуоресцентного субстрата.
  9. Держите слайды на слайде нагревателя при 65 ° С Осторожно снимите покровное и быстро добавить 1 мл 50% формамида в 2х SSC, предварительно нагретойт 65 ° С. Внимание, не позволяйте раздел сухой. Промыть два раза 10 мин при 65 ° С в 50% формамиде в 2х SSC и 2x 10 мин в 2х SSC при 65 ° С Вымойте еще раз с 2х SSC и поместить слайд на 37 ° C слайд нагревателя.
  10. Продолжайте этапе обнаружения в соответствии с инструкцией обнаружения комплект TSA производителя. Концентрацию HRP-стрептавидина, концентрация флуоресцентного субстрата и время реакции должны быть определены эмпирически *. Для LAT обнаружения РНК, мы обычно используется следующее условие: HRP-стрептавидин разбавляют в 1/500, флуоресцентный реагент на 1/100 для синей флуоресценции и 1/500 для зеленой флуоресценции и время реакции 10 мин. Сигнал может быть быстро проверил с перевернутой флуоресцентного микроскопа без монтажной, прежде чем приступить к ДНК-FISH.
    Примечание *: Протокол усиление будет дизайн в соответствии с основными целями эксперимента. Например, чтобы точно локализовать целевую РНК, это объявлениевизируются использовать короткое время реакции. В противоположность этому, быстро определить и считать положительных клеток при малом увеличении, время реакции может быть увеличена, чтобы генерировать яркий сигнал.
  11. Для ДНК-FISH, следуйте процедуре, указанной выше, начиная с разоблачительной стадии (шаг 6.2).

8. РЫБЫ Иммуно-ДНК

См. рисунок 1, фиолетовые ящики для обзора.

Подобно РНК-ДНК-FISH, рекомендуется выполнить сначала иммунофлюоресценции, так как ДНК-FISH, вероятно, денатурации белков и предотвращения их обнаружения антител. Качество иммунофлуоресцентного сигнала сильно зависит от характеристик антитела, и несколько антитела должны быть проверены, когда это возможно. Эпитоп разоблачение выполняется один раз перед иммунофлюоресценции улучшить как обнаружение белка и ДНК-FISH. Чтобы сохранить иммунофлюоресценции сигнал на образце во время процедуры ДНК-FISH необходимо COValently связать его с ткани. Мы приведем здесь два подхода, которые обеспечили хорошие результаты в наших руках, антитела после фиксации и tyramide обоснованное выявление (см. шаг 8.5). Выбор должен быть обусловлен предварительных испытаний для каждой пары цель / антител.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом:

    1X PBS, содержащем 3% нормальной козьей сывороткой (NGS).
    2% PFA в 1x PBS (разведение от 4% раствора)
  2. В день 1, первые шаги идентичны ДНК-FISH, до разоблачения шаг (шаги 6.1-6.2).
  3. После демаскируя, инкубировать секции с 1X PBS, содержащем 3% NGS в течение 1 часа.
  4. Инкубировать с первичным антителом, разведенным в 1х PBS, содержащем 3% NGS в течение 24 часов. Нижняя Инкубационный период может быть использован, чтобы сократить протокол, хотя мы обнаружили, что инкубации в течение ночи, как правило, приводит к более сильным сигналом. До 48-72 ч инкубации может потребоваться для низкое сродство первичных антител, таких как IgM.
  5. В день2, мыть 3x 10 мин с 1x PBS.
  6. Протокол с антителом после фиксации: Инкубируют 1 час с вторичным антителом в сочетании с зеленым флуоресцентным красителем, на 1/200 в 1 × PBS, содержащем 3% NGS. Вымойте три раза 10 мин с 1x PBS. После фиксация осуществляется с помощью 2% PFA в 1x PBS в течение 10 мин *. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Протокол с обнаружением TSA: инкубировать 1 час с HRP-в сочетании вторичным антителом на 1/250 в 1x PBS, содержащего 3% NGS. Вымойте три раза 10 мин с 1x PBS. Продолжайте обнаружения tyramide в соответствии с инструкциями производителя. Как было указано выше (этап 7.9), разбавление реагентов и времени реакции должны быть определены эмпирически. В большинстве случаев, наш протокол был основан на разведении 1/500 флуоресцентного субстрата и 10 мин времени реакции. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Примечание *: Сообщение-фиксация является важным шагом в иммуно-FISH, и требует тщательного настройку. Чем сильнее после фиксациилучше сигнал ПЧ, и тем ниже эффективность ДНК-FISH.
  7. Продолжайте ДНК-FISH со стадии кислоты метанол-уксусная (шаг 6.3). Продолжительность иммуно-ДНК-FISH, как правило, 3 дня, с первого антитела инкубировали в течение ночи.

9. Двойной ДНК-РНК FISH В сочетании с иммунофлуоресценции

См. рисунок 1, оранжевые ящики для обзора.

РНК-РЫБА выполняется в первую очередь, а затем иммунофлюоресценции, и, наконец, ДНК-FISH. Если иммунофлюоресценции обнаруживается реакции tyramide, он является ключевым, чтобы утолить полностью деятельность HRP на стадии РНК-FISH с Н 2 О 2, и чтобы убедиться, что тушение эффективно. Это делается с помощью одного слайда в качестве контроля "нет первичного антитела".

Поскольку этанол на основе обезвоживание является вредным для некоторых белков растворителей чувствительны, этот шаг РНК-FISH может ингибировать иммунофлюоресценции. Если это так, РНК-FISH может быть выполнена WIth альтернативный протокол, как описано ниже в stpe 9,3.

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    50% формамида в 1х PBS, содержащем 2 мМ РВК
  2. В день 1, подготовить РНК-FISH зонд и выполните для двойного РНК-FISH, до H 2 O 2 тушение шага (шаг 7.2).
  3. Случай 1, окрашивание иммунофлюоресценции работает после этанола обезвоживания: продолжить РНК-FISH, как указано выше в шагах 7,3-7,9. Затем переходите к шагу 9.6 ниже.
  4. Случай 2, окрашивание иммунофлюоресценции предотвращается путем обработки этанолом: Поместите слайды в увлажненной камере на слайд нагревател, установленного на 65 ° С и выдержать в течение 1,5 ч в прегибридизационным раствором, содержащем 50% формамид, 1X PBS и 2 мМ РВК. Слейте Предгибридизацию решение и падение 80 мкл раствора гибридизации, как указано в пунктах 7.4 и 7.5. Затем переходите с РНК-FISH-гибридизации и обнаружения, как указано Абовэ с шагом 7,6-7,9 (день 2 и 3).
  5. На 2-й день, после РНК-FISH завершена, приступить к иммуно-ДНК-FISH начиная с разоблачительной стадии (см. шаг 6.2). Затем выполните протокол иммуно-ДНК-FISH, как указано выше в шагах 8,2-8,6.

10. Презентация Монтаж и обработка изображений

  1. Подготовьте следующее решение, прежде чем начать:

    Hoechst 33342 на 0,5 мкг / мл в 1 × PBS
  2. Пятно ядра в течение 10 минут с DAPI или Hoechst 33342 * в 0,5 мкг / мл в 1x PBS в течение 10 мин. Вымойте 3x 10 мин с 1x PBS.
    Примечание *:. Внимание Если одна из систем обнаружения использует флуоресцентные синий краситель, не используйте DAPI или Hoechst. Вместо этого используйте флуоресцентные красители ДНК с спектров излучения в дальней красной волны, таких как Topro3.
  3. Слейте столько жидкости, как можно дальше от слайда. Оставьте 80 мкл монтажной среды, содержащие antifading агента на одном конце слайда. Покройте участки с высоким оптическим качествомпокровное (№ 1,5 стакана). Пусть покровное спуститься медленно, поддерживая его на одном конце щипцами, с тем чтобы позволить монтажную среду спред разделе без пузырьков.
  4. Печать с лаком для ногтей и хранить при температуре 4 ° С в темном поле слайда.
  5. Прямое наблюдение ДНК-FISH сигнала латентных HSV-1 геномов требует 40X или большем увеличении масло погружения цели, с высокой числовой апертурой (например 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) и источник света возбуждения по крайней мере, эквивалентно 100 Вт ртутной лампы. Мы советуем с помощью микроскопа передачи высокой эффективности, такие как те, которые предусмотрены производителей в последние 5 лет (см. таблицу оборудования). Конфокальной микроскопии предоставляет инструменты для сбора изображений с низкой фоне из-за автофлуоресценции ткани, такие как тонкий срезов или спектральных изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После нескольких месяцев тщательного тестирования, мы обнаружили, что на основе термической химической разоблачение сделал скрытая ВПГ-1 геном доступны для люминесцентных в гибридизация. В процессе, мы попробовали различные разоблачения процедуры, и только тепловые основе лечения (то есть нагревание разделы до температуры суб-кипения в микроволновой печи) оказался верным. Затем мы протестировали несколько буферов соли, которые обычно используются в иммуногистохимии (IHC) и электронной микроскопии для получения эпитопы 31,32, в том числе 0,01 М рН 6,0 цитрат буфера (который мы использовали во всех наших исследованиях), 1x PBS, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М рН Трис-HCl 7,4 и дистиллированную воду. В то время как ЭДТА буферы, как правило, привести к повреждению тканей, все другие буферы были пригодны к ВПГ-1 обнаружения, который выглядит как один или несколько пятен в ядре нейронов (рис. 2, отметим, что эти ткани обладают высокой самофлюоресцирующими, которая появляется в некоторых изображения как однородной сигнала в CYTOPLASM). В наших руках, цитрат буфера, казалось, постоянно обеспечивают хороший сигнал, не повреждая ткани и, таким образом, был выбран для нашей повседневной протокола.

Использование непосредственно меченых зондов Су3 ДНК (сделанных из частей HSV-1 генома, клонированного в космид) предоставляет надежные и воспроизводимые результаты. Тем не менее, она требует наличия доступа к HSV-1 геномных библиотек. Таким образом, мы убедились, что наш протокол будет работать на любой имеющий доступ только к коммерческим зондов. 2В показывает ВПГ-1 скрытую обнаружение генома ДНК-FISH с использованием пан-ВПГ-1 биотинилированного зонда, полученного из Enzo Biochem. Вдоль этих линий, мы проверяли, действительно ли протокол ДНК-FISH потенциально могут быть использованы учеными, использующих другие ВПГ-1 модели животных. 3А иллюстрирует обнаружение ВПГ-1 генома на образцах из мыши и кролика, инфицированного трех наиболее часто используемых штаммов, SC16, 17syn + и McKrae, в любом острой или латентной стадии инфекции, в разделах тройничного гAnglia. Во всех случаях ВПГ-1 геномы показывают как пятнистые сигнала, яркости и интенсивности, которая варьируется от клетки к клетке. Наконец, мы расширили применимость нашего протокола к репликативного цикла ВПГ-1, выполняя ДНК-FISH на тканях мышей, перенесших общую инфекцию герпеса. У этих животных большие и светлые агрегаты HSV-1 геномов могут быть обнаружены в различных тканях, включая мозг, спинной мозг, глаза и ганглиях задних корешков (рис. 3В).

Многие аспекты HSV-1 задержки еще мало изучены, например, как экспрессия генов ВПГ-1 регулируется с помощью его взаимодействия с ядерной архитектуры 33-35, являются предпочтительными, является ли конкретный подмножество нейронов клетки-хозяина для задержки создания и реактивации 13 , 14,36,37, или как иммунный надзор происходит в ганглиях в соответствии с вирусной нагрузкой или генной экспрессии вируса 9,10. Протокол, описанный здесь, поможет решить эти вопросы, поcodetection ВПГ-1 генома и вирусных или клеточных РНК и белков. Рисунок 4 иллюстрирует codetection ВПГ-1 генома вместе с HSV-1 LAT РНК (фиг.4А и 4С) с клеточными белками, такими как центромерной белка CENP-A (фиг.4В, если им следовать по PFA после фиксации), или хроматина и PML-NB, связанного белка ATRX (фиг.4С, если им следовать при обнаружении на основе TSA). фиг.4С иллюстрирует данные из тройного окрашивания эксперимента показаны HSV-1 ДНК ( красный), его LAT RNA продукт (синий) и регуляторный белок кандидат, ATRX (зеленый). Сочетание нашего протокола ДНК-FISH и прямого или фермента на основе выявления РНК-FISH и иммунофлюоресценции сигнала, представляют собой универсальный и широко применимый набор инструментов для изучения на месте на вирус-хозяин отношения на уровне клеток и тканей.

Рисунок 1 Рисунок 1. Обзор протокола ДНК-FISH и интеграции в многократной окраски целевой. Схематически представлены основные этапы протокола ДНК-FISH и связи с протоколами для codetection из РНК и белков. Критические шаги обозначены предупреждающими знаками. ДНК-FISH основные шаги регидратации, пермеабилизации, разоблачение, лечение метанол-уксусная кислота и гибридизации. В рамках процедуры, разоблачение является важным шагом, который должен быть тщательно настройки и уважаемым. Две другие важные шаги в зависимости от технических процедур, которые совместимы с антителами, используемых для иммунологического анализа. Они будут влиять на процедуры РНК-FISH для тройного окрашивания, и на стратегии обнаружения иммунофлюоресценции. Cлизать здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Обнаружение HSV-1 латентного генома после демаскацию антигена. A. TG секции от 28 руб инфицированных мышей получали, как указано в разделе протокола. Разделы TG были обработаны для ДНК-FISH, как показано на рисунке 1, и на основе теплового разоблачение было выполнить с помощью буфера, указанный в верхней части каждого изображения. Контур ядра изображен в виде пунктирной линии. Сигнал наблюдалась в цитоплазме связано с авто-флуоресценции ткани. B. TG секции, полученные, как в A. были обработаны для ДНК-FISH с применением коммерчески полученного биотинилированного HSV-1 зонда. Гибридизовалась зонд был обнаружен с помощью АСП и Alexa Fluor надписью substraтэ (зеленый). Ядра контрастно с Hoechst 33352 (голубой). Увеличены обрезанное изображение показано в правой колонке. Два типа HSV-1 генома рисунка показаны для иллюстрации типичный HSV-1 локализацию внутриядерную. Все изображения были собраны на эпифлуоресцентной микроскопом широкого поля. Шкала бар составляет 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. Обнаружение HSV-1 генома в нескольких моделях. А. Стандартный протокол ДНК-FISH была применена к разделам TG различного происхождения. SC16 инфицированных мышь секции TG получали, как описано в разделе протокола. 17syn + инфицированных разделы мыши и McKrae инфицированных разделы кролика были предоставлены седловинеlaborators. Изображения были собраны на эпифлуоресцентной микроскопом широким полем. Шкала бар составляет 5 мкм. Б. SC16 инфицированных мышей, перенесших общую инфекцию герпеса умерщвляли на 6 точек на дюйм и несколько тканей были собраны, замороженные и секционные. Стандартный протокол ДНК-FISH наносили, как указано на рисунке 1. Изображения были собраны на эпифлуоресцентной микроскопом широким полем. Шкала бар составляет 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 4. Codetection ВПГ-1 геномной ДНК и РНК и белков на отдельные секции. SC16 инфицированных мышей TG срезы обработаны для FISH РНК-ДНК, рыба иммуно-ДНК или тройной staininг, как указано на рисунке 1. А. РЫБЫ РНК-ДНК с использованием ВПГ-1 геном Cy3 меченным зондом (красный) и РНК-LAT биотинилированное рибо-зонда (зеленый). LAT РНК зонд детектировали с использованием АСП и Alexa Fluor 488 меченого субстрата. Ядра контрастно с Hoechst 33352 (голубой) РЫБА Б. Иммуно-ДНК, используя анти-CENP-антитела (зеленый) и ВПГ-1 геном Су3 меченным зондом (красный). Антитела были пост-фиксированная 10мин с 1% PFA в PBS перед запуском ДНК-FISH. Ядра контрастно с Hoechst 33352 (голубой). С. Иммуно-РНК-ДНК-FISH с использованием РНК-LAT биотинилированный рибо-зонда (синий), антитело против ATRX (зеленый) и ВПГ-1 геном Су3 меченным зондом ( красный). Проба РНК LAT было обнаружено с использованием обнаружения tyramide и синий флуоресцентно меченого субстрата, а также анти-ATRX и вторичные антитела были обнаружены при обнаружении tyramide и зеленый флуоресцентно меченого субстрата. Все изображения были собраны на широкого поля эпифлуоресцентной мicroscope. Шкала бар составляет 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный здесь позволяет обнаружить ВПГ-1 латентной генома в нейронах мыши секциях нервной ткани. Наше понимание путей регуляции экспрессии вирусного гена была ограничена отсутствием метода для выявления ВПГ-1 геномной ДНК на месте внутри нейронов тканей. Информация о генома числа копий и доля инфицированных нейронов пришли в основном из ПЦР-анализа на диссоциированных нейронов 11,12. В выяснении роли ядерной архитектуры хост-клеток на HSV-1 задержки, мы устанавливаем для определения локализации скрытой HSV-1 геном ДНК-FISH, в пределах ядра нейронов латентно инфицированных мышей. Мы протестировали широкий спектр протоколов ДНК-FISH и тканевых лечения, и нашел на основе тепла-"эпитопную разоблачение" в качестве важного шага в обнаружении вирусной ДНК-FISH. Такое лечение обычно используется, чтобы показать белка эпитоп в парафином для иммуногистохимии. Хотя это почти повсеместно используетсяв патологии, это не обычно используемые в ДНК-FISH. Хотя многие исследования подтверждают, что эта техника сохраняет морфологию ткани в масштабе световой микроскопии, конечный пользователь должен включать соответствующие элементы управления по подтверждению эту точку в его конкретном биологической системы 38. В наших руках, другие демаскирующих процедуры, такие как протеазы лечения не позволяют ВПГ-1 обнаружение ДНК, в то время как на основе теплового разоблачение используя различные буферы последовательно сделал ВПГ-1 скрытую геномной ДНК доступной для FISH зондов (рис. 2). Тепло основе демаскирования, как полагают, чтобы устранить часть сшивок между белками, указывая, что ВПГ-1 ДНК плотно связаны с белками. Это согласуется с недавней демонстрации того, что ВПГ-1 и латентный геном литического связанного с сотовой гистонов 2,39,40. Потому что геномы других герпесвирусов связаны с гистонов: ВВЗ 41; HCMV 42,43; EBV 44-46; KHSV 47-49, протocol описано здесь может быть применен для обнаружения геномы этих вирусов герпеса, а также многие другие, но, вероятно, также для обнаружения других стойких ядерных вирусов, таких как вирус папилломы, вируса гепатита В, и ретровирусов. Интересно, что использование текущего протокола на различных экспериментальных условиях (ткани от инфицированных мышей и кроликов, разделов, подготовленных различными лабораториями, а также использование различных штаммов ВПГ-1) не требует дополнительного настройки для выявления ВПГ-1 генома. Чтобы применить протокол для других биологических систем, мы ожидаем, что процедура фиксации и антиген методы извлечения может быть направления дальнейшего развития.

Классический подход в оценке HSV-1 задержки, чтобы обнаружить присутствие РНК LAT в сочетании с отсутствием обнаружения генных литический цикл продуктов в нейронах. Тем не менее, исследования, основанные на на месте ПЦР и КПЦР на изолированных нейронов из мышиных моделях задержки указано, что число инфицированных нейтроновадроны (т.е. ВПГ-1 генома положительные нейроны) было 2:58 время выше, чем LAT выражая нейроны 12,18. Использование РНК-ДНК-FISH, было подтверждено, что в нашей модели мыши 20-30% HSV-1 ДНК-положительных нейронов также положительны для LAT RNA 22. Использование ДНК-FISH и codetection вирусной и клеточной ДНК, РНК и белковые компоненты даст новый набор инструментов для характеризуют пути, регулирующие ВПГ-1 выражение скрытой генов. Кроме того, ВПГ-1 задержки, как известно, гетерогенный явление, как это имеет место в самых разнообразных нейронных подтипов, и оно характеризуется неоднородности в количестве копий генома и в LAT экспрессии РНК 12,22. Основным преимуществом ДНК-FISH, чтобы обеспечить доступ к одной анализа клеток в пределах от сложности ткани, и таким образом, чтобы учесть неоднородность HSV-1 задержки. Например, мы связаны выражение LAT RNA с обилием HSV-1 генома в отдельных нейронов 22. В рекламуусловие, этот метод может быть применим и к оценке состояния вирусных геномов с использованием в пробирке моделей клеточных культур, а также животных моделях, использующих человеческий ганглий имплантированный в SCID мышей 13-17. Будущее применение нашего протокола ДНК-FISH будет возможность охарактеризовать ВПГ-1 задержки через число HSV-1 генома положительных нейронов. Это может быть выполнено с использованием биотинилированных зондов и tyramide основе обнаружения, который производит достаточно сильный сигнал, чтобы быть обнаружены при малом увеличении. Такое заявление стало возможным благодаря очень низкой фоне порожденного системой обнаружения tyramide. Cy3 помечены HSV-1 зонды, описанные в данном протоколе могут быть использованы также, однако, требуется наблюдение при большем увеличении, которое было бы очень много времени, чтобы прочитать большое количество секций.

Возможно, основные свойства протокола ДНК-FISH, описанные здесь, универсальность и надежность, что делает его совместимым с тон codetection обоих РНК и белка. Действительно, мы обнаружили, что все процедуры, необходимые для выявления РНК или белок, или оба, не изменяют качество и яркость сигнала ДНК-FISH. РНК-рыба может быть выполнена до ДНК-FISH, используя либо этанол обезвоживание или формамида основе Предгибридизацию. Мы рекомендуем протокол этанола на основе, что приводит к меньшему фоне с АСП реагентов обнаружения. Протокол формамид основе следует использовать, когда РНК-FISH следует иммунофлуоресценции с антителами, которые не работают на этаноле обрабатывали образцов. При выполнении иммуно-ДНК-FISH, ковалентная связывание сигнала иммунофлюоресценции может быть выполнена tyramide основе обнаружения (который усиливает сигнал), либо на почте-фиксации, чтобы сохранить детали узора локализации белка. Для оптимизации пост-фиксацию, протокол иммунофлюоресценции сначала должен быть установлен, чтобы получить сильный сигнал, и самый сильный процедура пост-фиксация позволяет хороший сигнал ДНК-рыба должна быть определена. Это Вильл предоставляют широкий спектр условий, в рамках которой лучший компромисс между сохранением иммунофлюоресценции и ДНК-FISH сигнала могут быть получены. Что касается любого другого способа детектирования на основе антител, качество сигнала и лучший протокол сильно зависит от самого антитела. Наш протокол не является исключением, и мы заметили, что некоторые антитела работают очень хорошо с любым из протокола, описанного здесь (например анти-ПМЛ МКА клон 36.1) и некоторые другие нуждаются в значительном тестирование. В целом, мы успешно обнаружил большую часть нашего намеченной цели (исключение было SP100 белка), в том числе цитоплазматических и мембранных белков и ядерных белков, связанных с различными ядерных доменов (хроматин-HP1-, центромеры-CENP-A, CENP-B-, ПМЛ ядерные тельца-ПМЛ, Daxx, ATRX-). На основании нашего тестирования мы ожидаем, что наш протокол ДНК-FISH быть совместимы с иммуно-codetection из репортеров конструкций (β-галактозидазы, флуоресцентных белков ...), которые обычно используются для анализа промотер деятельности от вирусных геномов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Н. Sawtell (Hospital Medical Center Цинциннати Детская, Цинциннати, Огайо, США), С. Efstathiou (Кембриджский университет, Великобритания) и Джеймс Хилл (ЛГУ Health Sciences Center, Новый Орлеан, США) за предоставление образцов из ВПГ-1 -инфицированных мышей и кроликов, соответственно, и для реагентов; Х. Масумото (Kazusa НИИ ДНК, Чиба, Япония) и С. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Гренобль, Франция) за полезные обсуждения.

Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального центра де-ла-Научных Исследований (CNRS) (программа ATIP, к ЛП, http://www.cnrs.fr), Национальное агентство исследований Французский (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), FINOVI Фонд ( http://www.finovi.org/:fr:start ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) из Университете Лиона, в рамках программы "Investissemenц d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) управляется ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association Pour La Recherche Контр ле Рак (АРК-7979 и ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), ла Лига Nationale Контр ле Рак (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), и инков (программа EPIPRO, http://www.e -cancer.fr ). ФК и ЛП CNRS исследователи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015  
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound SAKURA 4583  
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001  
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5 M EDTA Sigma E6758  
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01  
Salmon sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe  Enzo Life Sciences ENZ-40838  
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000  
20x Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099  
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415  
Dextran sulfate - MW 500,000 Euromedex EU0606-A  
Denhardt's solution (100x) Euromedex 1020-A  
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000  
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104  
T7 in vitro transcription kit Ambion Life Technologies AM1314  
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910  
RNA purification minicolumn Qiagen 73404  
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S  
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000  
Primary antibodies any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen Life Technologies H3570 Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass Electron Microscopy Sciences 72204-04  
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15  
Equipment/Material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310  
Cryostat Leica France CM 1510-1  
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven  
Dry block heater Eppendorf 022670204  
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000  
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512  
Staining glass container Dominique Dutscher 68506  
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Tags

Неврология выпуск 83 науки о жизни (Общие) вирусология Вирус простого герпеса (ВПГ) Задержка, ядерной организация экспрессии генов микроскопия
Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными<i> В месте</i> Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, … More

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter