Summary
我们原位杂交协议建立一个荧光供于动物模型的组织切片中的持久DNA病毒基因组的检测。这个协议允许研究感染过程由codetection病毒基因组，它的RNA产物，以及单细胞内的病毒或细胞蛋白。
Abstract
的基因的单细胞codetection，其RNA产物和细胞调节蛋白是关键的，研究基因表达的调控。这是在病毒学领域的挑战，特别对于核复制的持久性DNA病毒，涉及动物模型的研究。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）建立在神经元末梢终身潜伏感染。潜隐病毒作为水库，从它重新激活并诱导新的疱疹发作。的HSV-1的等待时间的细胞生物学仍知之甚少，部分原因是由于缺乏方法来检测HSV-1基因组原位的动物模型。我们描述了DNA的荧光原位杂交（FISH）方法有效地检测来自被感染的动物模型神经组织切片，在低拷贝病毒的基因组。该方法依赖于基于热的抗原修复，和直接标记的自制的DNA探针，或可商购的探针。我们开发了一个三重的领带宁方法，结合DNA-FISH与RNA-FISH和免疫荧光，使用基于过氧化物酶信号放大，以适应每个染色要求。一个主要的改进是获得，在10μm的组织切片，低背景信号，可以在高分辨率的共聚焦显微镜和宽视场常规落射荧光成像的能力。此外，三重染色加工具有广泛的针对细胞和病毒蛋白质的抗体。完整的协议需要2.5天，适应组织内抗体和探针的渗透。
Introduction
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种持久性人神经病毒，在周围神经系统，从它周期性地重新激活的复制和蔓延的三叉神经节（TG）的神经元建立长期潜伏感染。在HSV-1基因组是一个150 kb的双链DNA本地化主机神经元那里仍然是多拷贝chromatinized质粒，不整合到宿主细胞基因组1,2的核心。期间延时，HSV-1复制周期的遗传程序，强烈抑制，基因表达被限制在潜伏相关转录物（LAT）基因，从延迟建立到活化3的起始。土地增值税产生加工成一个主要的2 kb的稳定套索长8.5 kb的非编码RNA，和几个miRNA的4-7。因此，HSV-1的延迟为特征的病毒基因组DNA，RNA LAT，以及没有可检测的复制周期蛋白的存在。
ontent“>动物模型，主要是鼠和兔，是实验模型扼要的人为延迟的几个特点，其中之一这些模型的主要利益是他们让学习HSV-1潜伏在免疫活性宿主的生理方面的问题。在过去的几十年许多实验性的工具，如遗传修饰的病毒和小鼠中，已经开发研究生理学，遗传学和HSV-1的延迟，从动物组织中的细胞生物学。到现在为止，病毒基因组DNA的检测和定量通过Southern印迹和从定量PCR分离甘油三酯，然而，目前还没有检测HSV-1基因组原位杂交组织切片8，因此，延迟是经常通过土地增值税的RNA的检测采用原位杂交的RNA，而不是评估的组织切片方法可用病毒基因组的检测，因为它已经不可能表征感染细胞中基于病毒的基因组的存在下，噻的技术限制是一个主要的缺点的宿主-病毒相互作用，例如病毒基因组和细胞和病毒基因的表达，或在宿主细胞介导的免疫应答9,10之间的关系的许多方面进行分析。最重要的是，在潜伏感染的细胞-细胞间的异质性保持相对未开发的，并已被证明是延迟的一个重要特征在小鼠和在植入到SCID小鼠中11-17人体感觉神经节的神经元。通常情况下，它表明通过qPCR即每个细胞的HSV-1的基因组拷贝数变化从5到几百。尽管土地增值税表现为潜伏期和活化的关键调节因子，对离体神经元和原位 PCR定量PCR的数据显示，潜伏感染神经细胞的一个子集，低至30％，体现了土地增值税轨迹11,12,18-21。如何在宿主细胞内，并在病毒潜伏期成立组织影响的细胞环境和病毒基因表达仍不清楚。这里我们描述了原位杂交（FISH）方法用于有效地检测的动物的神经组织切片内的低拷贝的HSV-1基因组DNA的荧光健壮。这种方法已被设计和使用我们进入到高分辨率显微成像也就是要研究的病毒基因组的相互作用与宿主细胞内的核部件22。此外，我们描述了用于同时检测病毒DNA与RNA和蛋白质，这是一个独特的工具来描述，调节病毒基因表达的病毒 - 宿主相互作用的倍数染色方法。该方法也可以应用于范围广泛的要求的检测HSV-1的潜伏基因组中，如在大量切片的量化被感染的神经元的分析。一个关键的步骤是应用抗原修复治疗，使病毒DNA访问杂交。因此，该协议也可能是有效的，以检测其他双链DNA病毒，这是目前无法检测动物组织中传统的DNA-FISH方法。
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Protocol
这种方法被用于先前22发表的一项研究。对于一般的背景和常规操作的描述在ISH，IF和鱼，我们建议如下现有的文献23。
1。动物感染
所有涉及实验动物的程序符合伦理问题的研究协会在视觉与眼科在研究中使用的动物（ARVO）声明，并批准了UPR-3296-CNRS的地方伦理委员会，按照欧洲共同体理事会指令86/609/EEC。所有动物无限制的获得食物和水。
小鼠感染了HSV-1下面描述的方法已被用于此前公布的24-26研究。
- 准备了以下解决方案出发前的准备：
HSV-1病毒原液
麻醉解决方案 - 氯胺酮E-100 mg / kg和赛拉嗪10毫克/千克 - 占用1微升病毒（10 6 pfu的）转换成连 接到一个微量注射泵装置提供0.1微升/秒的5微升玻璃微量注：重悬病毒原液中的酚红的培养基看到红色油之间的界限呈现在毛细管和病毒溶液，并避免空气喷射在病毒接种的部位。
- 打好麻醉小鼠（氯胺酮-100 mg / kg和甲苯噻嗪-10毫克/千克）在其背面朝上。
- 定位在麻醉的小鼠头部双目立体显微镜下，并在皮肤粘膜边界插入针在左上唇的皮下层。在每5秒0.5微升的速度注入的病毒溶液中的两个步骤（两次0.5微升） 注：尊重2 0.5微升注射之间有10秒的停顿，使病毒悬浮液以吸收在注射部位。
- 鼠标放置在37℃培养箱中培养，直到觉醒。
- 离开鼠标在动物设施恢复为所需的时间。 注意：在小鼠模型中，HSV-1诱导原发性感染，称为急性感染，这在接种现场，并在几个神经组织，包括持续时间不到10天甘油三酯，颈上神经节（SCG），和背根神经节（DRG）取决于接种部位。原发性感染的症状逐渐消失，延迟被认为是完全建立约28-30天感染后（DPI）起。神经组织通常可以从4 DPI为急性感染研究中有所收获，并从28 dpi的对延迟的研究。
2。鼠标灌注修复
- 生理盐水缓冲液50ml中：在开始之前，请准备以下解决方案
60毫升1X PBS中
150毫升在1x PBS中新鲜制备的4％多聚甲醛的
60毫升在1x PBS中的20％的蔗糖。<BR /> - 制备灌注管：所述针连接到毛细管，其连接到蠕动泵。
- 麻醉以上（SREP 1.2）所描述的鼠标，奠定它在它的后面的夹层托盘，连接由四条腿用大头针。
- 用剪刀剪从腹部的皮肤向上至喉*。撕去覆盖器官的薄组织层。通过切断肋骨胸骨一侧打开胸腔。由撕下去除皮肤。远离对方的肋骨显露心脏的左右两部分注意：注意不要切开胆，肺和大血管（颈动脉和颈静脉），这将使灌流，固定是不可能的。
- 插入在左心室针*。切开右心房与剪刀。通过在心脏注入血液中的船只20 1ml生理盐水进行放血。让血流在托盘中。 无德：在此过程中，注意不要刺穿心脏的另一边。
- 灌注用150毫升4％PFA在1x的PBS在15分钟*（注意：PFA是有毒的，在通风橱中操作）。灌注60毫升20％蔗糖中的1×PBS中6分钟。在该阶段鼠标准备TG收获注：该泵设置为10毫升/分钟。一个良好的灌注是明显，当鼠标尾部僵硬起来，抬起然后再次下降。
3。 TG收获
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
在1x PBS中20％蔗糖 - 切割头在颈部的水平。切开鼻子只是门牙后面的尖端，以揭示鼻腔。切开腭两个用剪刀和上腭的每一侧移开注：本甘油三酯正好出现在腭下，为2-3毫米长位于右侧两个白色长方形和群众，左侧，并连接到三叉神经。
- 切断对甘油三酯的每一侧三叉神经分支从脑干释放甘油三酯。除去甘油三酯与手术钳，让他们在24小时注一20％的蔗糖无菌溶液：使用两种不同的收件人为左，右甘油三酯，避免留下TG（感染），右边TG（或没有方寸之间弱感染）。孵育的甘油三酯中在1×PBS中20％蔗糖的嵌入前24小时。
- 甘油三酯嵌入在cryosectioning在-80包埋剂和冷冻℃，单块
- 存储块在-80°C，直到切片。
4。冷冻切片制备
- 切甘油三酯纵向为10微米的部分在-20°C的低温恒温器，并把他们放在稍微加热（30℃）的Superfrost幻灯片。让切片干燥5-10分钟，然后在-80℃直至使用注意事项冷冻和储存：可达4-5节，è土木工程署在一个幻灯片，如果大量部分，是在同一时间进行处理。我们进行如下：连续切片沉积到3一系列幻灯片标记为A1，B1和C1，然后A2，B2，C2等。因此，每个滑动系列（A，B和C）可以为不同的染色处理（ 原位杂交，FISH， 原位 PCR，LCM），并使用不同的技术获得的数据可以比知道滑动携带相同数量的对应对TG的相同区域。
5。 HSV-1探针标记
该协议描述为以下的HSV-1的基因组DNA通过FISH检测已成功地应用于两种类型的探针。第一个是自制Cy3标记的荧光探针，其适合于精细分析单个细胞内的核的组织，通过高倍率荧光显微镜。第二是市售生物素化的探针，其可以结合D与过氧化物酶为基础的信号放大，以提供一个明亮的信号。后者适合于鉴定含神经元在整个截面低倍率病毒和量化，而对于HSV-1基因组模式的分析。最终用户应该评估哪种方法最适合自己的学习目标。市售的探针被列出的试剂部中，并且自制探针的制备方法如下所述。
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
HSV-1基因组含向量（见步骤1）
70％乙醇，分子生物学级。 - 。制备含HSV-1基因组的30 kb的部分粘粒（数量粘粒14，28，和56中描述的参考20使用专门为大载体纯化柱注：其他类型含HSV-1基因组，如细 菌人工染色体文库的应工作为好，只要耳套人在HSV-1基因组的ARGE部分产生足够的信号27-29。在我们手中，从柯斯质粒载体骨架制成的探针没有产生任何信号，并用作阴性对照。含HSV-1序列因此整个粘粒载体在我们的研究中使用。另外，也可以切出HSV-1的序列，并用它来制备探针。
- 。标签2使用按照制造商的指引一个缺口转译试剂盒各粘粒用Cy3-dCTP标记的微克注：与反应混合物仅含有Cy3标记的dCTP和无未标记的dCTP进行标记。
- 停止反应，在70℃下10分钟，将混合物加热并加入3微升的0.5M EDTA中。在冰上冷却。
- 净化探头在G50凝胶排阻微柱。加150微克的鲑鱼精子DNA的探针和用乙醇沉淀沉淀探针。 DNA沉淀，应因掺入Cy3的粉红色。用70％乙醇洗涤沉淀并除去尽可能多的乙醇尽可能地用移液管。不要让沉淀干燥。
- 溶解沉淀用100μL去离子甲酰胺（注意：甲酰胺是有毒物质在通风柜操纵）。该探针浓度不能可靠计量的在这一点上。在文本中提及的探针量是指用于使所述探针模板DNA的量。是基于2微克的DNA模板和100微升甲酰胺中的协议，它被认为是20毫微克/微升。储存在-20℃。标记的探针可以在大量的准备和几个月冷冻保存。
6。 DNA-FISH
图1显示的DNA-FISH协议，以及如何进行DNA-FISH作为多染色实验的一部分，以codetect RNA和蛋白质，如在协议7-9所描述的主要步骤的概述。
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
0.5％的Triton X-100在1×PBS中
2×SSC和0.2×SSC缓冲液
100 mM的pH6.0的柠檬酸盐缓冲液（10×原液）和10mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液（工作液）
2X杂交缓冲液（见协议4） - 在第1天，将载玻片上的滑动支架在室温下，让部分干燥10分钟。圈出部分具有疏水笔。补充水分在1×PBS中的部分为10分钟。孵育切片20分钟，用0.5％Triton X-100在1×PBS中，以透化组织。洗涤3次10分钟，2×SSC，和保持在2×SSC，直到去掩蔽缓冲器被加热（见下文）。
- 为揭露，准备一个玻璃载片托盘（20滑动容量）填充有200ml的10mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）。将托盘在一个较大的容器中填充500ml的蒸馏水中。此设置允许更好地控制加热脉冲。之前放置在滑动托盘，预热缓冲区中的微波炉，直到BUFFER达到沸点（约在800瓦8分钟）。
- 将玻片在预热的含柠檬酸缓冲液托盘，并确认它们完全覆盖缓冲区。火煮约20秒，直到缓冲区达到沸点。注意， 不要让缓冲区超过烧开，这可能会损坏组织。冷却，在室温下放置2分钟。重复加热循环6X（7加热循环总数）*。冷却2分钟，5分钟传送的幻灯片在2x SSC。
注*：这是最关键的步骤之一。最佳数量的加热周期和持续时间应根据经验来确定，并且可以根据组织的类型或所使用的探针的类型而改变。微波，托盘，集装箱和缓冲区中的托盘和容器中的水体积应保持相同的揭露的重现性。过度沸腾，可能会导致组织损失和受损细胞。对于每一个加热脉冲，沸腾的外观仔细观看，并热荷兰国际集团应停在沸腾的最初迹象。一旦设置，揭露出现稳健和可重复性。 图2A显示了HSV-1基因组可以通过不同的缓冲区揭露被检测到，表明揭露条件可以进一步探讨。基于柠檬酸盐的揭露，发现始终如一地提供良好的FISH信号，并组织保存，与来自不同实验室和动物模型部分。 - 孵育在甲醇幻灯片：乙酸：PBS混合物（3点01分04秒）搅拌15分钟，然后在甲醇：乙酸混合物（3:1）处理15分钟（注意：乙酸是腐蚀性烟气下操纵。油烟机，并使用适当的保护，使用前右侧准备这个解决方案）。
- 通过连续温育10分钟以70％的脱水段，然后2倍10分钟，100％乙醇中。让干在室温下10分钟。保持干燥，直到探测。
- 准备探测解决方案如下：提前准备20ml的股票2X杂交缓冲合作ntaining 20％硫酸葡聚糖（分子量500,000），2×Denhardt溶液，4×SSC中*。等分的溶液为500μl，以微管，并储存在-20℃。 1幻灯片（22毫米×50毫米盖玻片），混合90纳克的HSV-1 Cy3标记的探针（30纳克探针对每个粘粒的），并完成量40μL与甲酰胺。加入40μl2×杂交缓冲液。移液器向上和向下几次拌匀。
注*：要准备2个杂交缓冲液，将4克分子量500,000硫酸葡聚糖在10毫升蒸馏水。它使粘稠的混合物在3-4个小时内溶解，在70℃下经常混用，以帮助溶解。加4毫升20×SSC，400微升的100倍Denhardt溶液。完成〜20毫升拌匀使用旋涡。 - 滴80微升的探测解决方案到干燥的部分。覆盖22毫米×50毫米的玻璃盖玻片，并确认探测解决方案遍及盖玻片的整个表面上。注意：不应该有气泡。气泡的存在降低了杂交效率。用橡皮泥密封盖玻片，并让其干燥。保持在黑暗中的载玻片在室温下至少2小时，以获得最佳的杂交信号在整个滑动。
注：橡胶水泥是方便，因为它干得很快，是防水的，并且杂交过程中保护样品的干燥。它也很容易脱落杂交之后，除去盖玻片。指甲油是一种有效的替代，但不太方便的选择。 - 通过将玻片在80℃的恒温箱滑动5分钟进行变性。或者，将载玻片上的金属托盘，将托盘在80℃水浴（托盘应该浮动）。然后迅速转移的幻灯片到金属盘置于冰上。离开5分钟。转移的幻灯片，在37°C（载玻片加热器或孵化器），用于杂交过夜。
注意：我们不建议较短的杂交，从而导致弱或无信号。 - 在第2天，取下橡胶水泥用钳子，同时保持滑动到加热器以保持部分中，在37℃下用手术刀刀片尖轻轻取出盖玻片。
- 洗涤3次用2×SSC在37℃下保持5分钟，3次，0.2×SSC在37℃下5分钟。用2×SSC洗一次，在室温下放置5分钟，并进行DNA染色和安装（见协议10以下）。
注意：此方法允许对细胞基因组的检测指标，通过使用相应的探头伸入探测解决方案与HSV-1特异性探针所公布的着丝粒和近着丝粒序列22。
7。双RNA-DNA FISH
参见图1，绿色框的概述。
对于多染色过程包括一种RNA-FISH步骤，所以一般应先进行RNA检测为这样的目标是通过降解RNA酶和化学物质敏感。此外，DNA-FISH方法包括治疗方法，降低其他染色效率。对于RNA的鱼，我们选择了一个基于酶的检测方法（酪胺信号放大（TSA）使用生物素化的探针和过氧化物酶（HRP）偶联链霉亲和）。 TSA是基于荧光底物的酪酰胺（见试剂表的细节），其共价键由过氧化物酶反应连接至所述组织。将RNA-FISH信号在DNA-FISH从而保留。
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
矢量用于体外转录的LAT轨迹（pSLAT-2）
1X PBS含2毫米RVC
含有2mM RVC 0.5％的Triton X-100在1×PBS中
3％H 2 O 2在蒸馏水中。
70％，80％，95％乙醇，分子生物学级。
4倍的RNA杂交液（见协议4） - 至少有一天的RNA-FISH实验之前，请准备鱼的RNA探针。检测到HSV-1潜伏相关转录（LAT）时，从pSLAT-2载体30，或另一个向量用于体外转录的LAT轨迹的制备生物素标记的核糖探针，如前面参照图26所述。简述：线性化10微克pSLAT-2用HindⅢ和净化消化载体用DNA纯化试剂盒。合成的单链核糖核酸探针从2微克的消化pSLAT-2与T7 体外转录试剂盒生物素-16-UTP的存在*。纯化的探针与RNA微型柱，并用分光光度计在260nm处定量。稀释探头在50纳克/微升的DNA酶/ RNA酶自由水并储存在-80℃下，在小等分，以避免冻融循环。
注*：生物素-16-UTP：UTP比例必须根据经验来确定。我们fOUND 40:60的比例提供探针通过RNA-FISH检测效率土地增值税。 - 在第1天，将载玻片上的滑动支架在室温下，让部分干燥10分钟。圈出部分具有疏水笔。在补充水分的1X PBS含2 mM的氧钒核糖核苷复合物（RVC）* 10分钟的部分。孵育20分钟的部分用含有2mM RVC可渗透组织的0.5％的Triton X-100在1×PBS中。用1×PBS，2mM的RVC洗3次10分钟。以淬灭任何内源性过氧化物酶的活性，在3％H 2 O 2孵育部分为2×10分钟，然后用1×PBS，2mM的RVC洗一次。
注*：在整个RNA-FISH程序，核糖核苷氧钒配合物（RVC）加入到缓冲液和溶液，以防止RNA降解。 - 孵育2×10分钟，在70％乙醇中。在此阶段，区段可以被存储在70％的乙醇在-20℃下几个星期。温育在80％，95％和100％乙脱水段anol，每次5分钟。让该部分干燥至少10分钟。
注意：在某些情况下，乙醇的治疗可能是有害用于检测其他目标。用50％甲酰胺预杂交一步一个备用协议 - 2X SSC可以使用（见下面的协议9三重染色详情）。然而，乙醇的治疗是进行RNA-FISH最通用的方法，并提供了最低的背景。 - 准备探测解决方案如下：预先准备一个10ml含有8倍的SSC，20倍的Denhardt溶液，4毫摩尔EDTA，40％葡聚糖* 4倍的RNA杂交溶液的股票。等分的溶液为500μl，以微管，并储存在-20℃。 1滑动制备80微升溶液（22毫米×50毫米的盖玻片），通过混合20毫微克的生物素化的LAT核糖核酸探针的，40毫微克酵母的tRNA，2mM的RVC和完整，以20微升水。加20μl的4倍RNA杂交溶液，和40μl甲酰胺（50％终浓度）。为了更容易吸液和混合，建议prewarm在4x RNA杂交溶液在75℃下移液器向上和向下几次拌匀。
注*：为了制备在4x RNA杂交溶液，混匀4克硫酸葡聚糖（分子量500,000）在3ml蒸馏水和4ml的20×SSC。它使粘稠的混合物溶解在3-4小时内，在70℃下经常混用，以帮助溶解。加入2毫升100×Denhardt氏溶液，和80微升0.5M的EDTA溶液。完成10毫升水拌匀使用旋涡。注意：只能使用RNA酶/ DNA酶免检产品。 - 变性探针10分钟，在75℃下同时，放置在载玻片上培养箱设定为65℃的幻灯片滴80微升探针溶液到切片，并迅速置于盖玻片上的压降。注意：应该没有泡沫。气泡的存在降低了杂交EFFiciency。孵化必须发生在湿盒，因为盖玻片不密封。使用一个滑动孵化器可以装水（见材料表），或在一个密封的盒子准备湿盒，并将其放置在65℃杂交炉。
- 孵育过夜，在65℃， 注意：LAT RNA-FISH是在65℃，以防止探针，其在37℃下观察到的非特异性结合许多其他的RNA-FISH探针应导致良好的信号，在37°C。
- 在第2天，开始洗涤之前，根据TSA检测试剂盒的生产商的说明制备的检测试剂。检测是用市售的TSA检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶（HRP）偶联链霉亲和绿色或蓝色荧光底物进行的。
- 保持对载玻片加热器的幻灯片，在65°C。小心取出盖玻片并迅速加入1毫升2×SSC 50％甲酰胺，一预热T 65°C。小心，不要让部分干。在2×SSC 50％甲酰胺在65℃，在65℃洗两次10分钟，在2×SSC 2×10分钟用2×SSC洗一次，并放置在幻灯片上37℃载玻片加热器。
- 继续根据该协议检测试剂盒制造商的指令的检测步骤。 HRP-链霉亲和的浓度，荧光底物的浓度和反应的时间必须根据经验来确定*。为LAT RNA检测，我们经常使用以下条件：HRP-链霉抗稀释于1/500，荧光试剂在1/100为蓝色荧光和1/500的绿色荧光，并且在10分钟的反应时间。该信号可以用一个倒置荧光显微镜进行快速检查无安装，在进行DNA-FISH之前。
注*：该扩增将根据本实验的主要目的是设计。例如，以精细地定位靶RNA，它是广告vised使用短的反应时间。与此相反，以快速识别和计数阳性细胞在低放大倍率，反应时间可以增加，以产生亮信号。 - 对于DNA-FISH，按照上面指示的步骤，从揭露步骤（步骤6.2）开始。
8。免疫鱼的DNA
参见图1，紫色框的概述。
类似于RNA-DNA-FISH，它表示第一个来执行免疫荧光，由于DNA-FISH很可能使蛋白质变性，并防止其检测由抗体。免疫荧光信号的质量高度依赖于所述抗体的特征，并且几种抗体应该尽可能测试时。表位去掩蔽进行一次免疫前同时提高蛋白的检测和DNA-FISH。到DNA-FISH过程期间保留在样品上的免疫荧光信号，有必要冠状病毒alently将其链接到组织。我们在座的两种方法，在我们的手中提供了良好的成绩，抗体后固定和酪胺为基础的检测（见步骤8.5）。的选择应通过为每个目标/抗体对初步测试驱动。
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
含有1x PBS中3％正常山羊血清（NGS）。
2％PFA在1x PBS（稀释从4％原液） - 第1天，第一个步骤是相同的DNA-FISH，直至揭露步骤（步骤6.1-6.2）。
- 揭露后，孵化用1×PBS含3％NGS 1小时的部分。
- 孵育稀释在1×PBS中含3％NGS 24小时的初级抗体。下温育时间可以用来缩短协议，尽管我们发现，过夜温育通常会产生更强的信号。可能需要的低亲和力初级抗体，诸如IgM抗体达48-72小时培养的。
- 每天上2，洗3次10分钟，用1×PBS。
- 与抗体后定影协议 ：孵育1小时以加上一个绿色荧光染料的二抗，在1X PBS中的1/200含有3％NGS。洗3次10分钟，用1×PBS。后固定为10分钟*进行2％PFA中的1X PBS。用1×PBS洗涤3次10分钟。
与TSA检测协议 ：孵育1小时用在1X PBS 1/250含3％NGS的HRP偶联的第二抗体。洗3次10分钟，用1×PBS。根据制造商的说明用酪胺的检测进行。如上所示，（步骤7.9），试剂稀释和反应时间，必须根据经验来确定。在大多数情况下，我们的协议是基于一个1/500稀释的荧光底物，并用10分钟的反应时间。用1×PBS洗涤3次10分钟。
注*：后固定在免疫鱼的关键一步，需要仔细设置。在后固定，更强更好的IF信号，和较低的DNA-FISH效率。 - 进行DNA-FISH从甲醇 - 乙酸步骤（步骤6.3）。免疫的DNA-FISH的持续时间一般为3天，孵育过夜第一抗体。
9。双DNA-RNA鱼加上免疫荧光
参见图1，橙色框的概述。
RNA-FISH是第一次演出，其次是免疫，最后的DNA-FISH。如果免疫荧光是由酪胺反应检测到，它的关键是从RNA-FISH步与H 2 O 2完全熄灭的HRP活性，并验证淬火是有效的。这是通过使用一个滑动作为“无第一抗体”控制完成的。
因为基于乙醇的脱水是有害于某些溶剂敏感的蛋白质，RNA-FISH的这个步骤可以抑制免疫荧光。如果是这样，RNA-FISH可以进行瓦特第i个备用协议，在STPE 9.3详述如下。
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
含有2mM RVC 50％甲酰胺中的1×PBS - 第1天，准备RNA-FISH探针，并继续为双RNA的鱼，直到H 2 O 2的淬火步骤（步骤7.2）。
- 案例1，免疫荧光染色乙醇脱水后的作品：进行RNA-FISH按照步骤7.3-7.9以上表示。然后继续下面的步骤9.6。
- 案2中，免疫荧光染色，防止由乙醇处理：放置在潮湿的腔室玻片上的载玻片加热器设为65℃孵育1.5小时，在含有50％甲酰胺，1×PBS中，和2mM RVC一个预杂交溶液。沥干预杂交溶液和下降80微升的杂交溶液如在步骤7.4和7.5所示。然后进行RNA-FISH杂交和检测所示ABOVE在步骤7.6-7.9（一天2和3）。
- 第2天，RNA-FISH完成后，进行免疫的DNA-FISH首先是揭露步骤（见步骤6.2）。然后，按照按照步骤8.2-8.6上面指出的免疫DNA-FISH协议。
10。滑动安装和成像
- 在开始之前，请准备以下解决方案：
赫斯特33342在1×PBS中0.5微克/毫升 - 染色核10分钟用DAPI或Hoechst公司33342在0.5微克/毫升在1×PBS中10分钟*。用1×PBS洗涤3次10分钟。
注*：注意如果检测系统之一采用了蓝色的荧光染料，不要用DAPI或Hoechst公司。相反，使用荧光DNA染料与发射光谱的远红外波长如Topro3内。 - 排水尽可能多的液体尽可能从幻灯片。滴80微升安装介质中含有幻灯片上的一端的抗褪色剂。顶盖采用了高光学质量的部分盖玻片（N°1.5玻璃）。让盖玻片下去慢慢地用钳子保持它的一端，以便让安装介质中传播超过部分无气泡。
- 密封在一个黑暗的滑动盒指甲油和储存在4℃。
- 直接观察潜伏的HSV-1基因组的DNA的FISH信号，需要一个40倍或更高的放大率油浸物镜，具有高数值孔径（例如40X NA 1.1，60X-63X NA 1.4，100X NA 1.3）和激励光源至少相当于一个100瓦汞灯。我们建议使用高效率的透射显微镜，如那些在过去5年中所提供的制造商（见表设备）。共聚焦显微镜提供了一些工具来收集，由于自体荧光的组织的图像具有较低的背景下，如薄切片或光谱成像。
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Representative Results
经过几个月的广泛测试，我们发现，热基化学揭露原位杂交技术制成潜伏的HSV-1基因组可用于荧光。在这个过程中，我们尝试了各种去掩蔽过程，并仅基于热的处理（ 即加热部分到子沸点温度在微波炉中）出现的效率。然后，我们测试所使用的常规免疫组织化学（IHC）和电子显微镜来检索表位31,32，包括0.01M的pH值为6.0柠檬酸缓冲液（我们在所有的研究中使用），1×PBS中，1mM的EDTA，0.1M几种盐缓冲剂的Tris-HCl pH 7.4和蒸馏水。而EDTA缓冲液趋向于损坏的组织，所有其它缓冲液是合适的对HSV-1的检测，从而出现神经细胞的细胞核内的单个或多个点（ 图2A中 ，请注意，这些组织是高度自体荧光，出现在某些图像作为在CYTOP均相信号LASM）。在我们的手中，柠檬酸缓冲液出现，不断提供良好的信号不破坏组织，因此被选定为我们的日常协议。
采用直接标记的Cy3-DNA探针（从HSV-1基因组克隆粘粒部分制造）提供了强大的和可重复的结果。但是，它需要具有访问HSV-1基因组文库。因此，我们证实了我们的协议将工作具有只能访问商业探针任何人。 图2B示出了使用从恩佐生化获得的泛HSV-1的生物素化的探针HSV-1的潜伏基因组中检测通过DNA-FISH。沿着这些线路，我们测试是否该DNA-FISH协议可能被用于通过使用其他的HSV-1的动物模型。 图3A示出的HSV-1基因组的小鼠和兔的样品的检测，感染了三种常用的菌株的科学家， SC16，17syn +和McKrae，在感染的急性或潜伏阶段，三叉克段内英吉利。在所有情况下，HSV-1基因组中显示为一个参差不齐的信号的亮度和强度而变化从细胞到细胞的。最后，我们扩大了我们的协议是否适用于HSV-1的复制周期，通过对小鼠进行一般的疱疹病毒感染的组织进行的DNA-FISH。在这些动物中的HSV-1基因组的大和明亮的聚集体可以在各种组织中，包括脑，脊髓，眼和背根神经节（ 图3B）进行检测。
的HSV-1潜伏许多方面仍然知之甚少，比如如何HSV-1基因的表达是通过其与核架构33-35相互作用调节，无论是神经元的特定子集是首选宿主细胞的延迟建立和激活13 ，14,36,37，还是怎么的免疫监视，根据病毒负荷或病毒的基因表达9,10取神经节内的地方。这里描述的协议将有助于解决这些问题，通过的HSV-1基因组和病毒或细胞的RNA和蛋白质codetection 图4示出了连同HSV-1 LAT核糖核酸的HSV-1基因组的codetection（ 图4A和4C），与细胞的蛋白质，如着丝粒蛋白CENP-A （ 图4B，如果随后的PFA后固定），或染色质和PML-NB相关蛋白ATRX（ 图4C，IF随后TSA基于检测）。 图4C示出了从三重染色实验显示HSV-1 DNA的数据（红色），其RNA产物土地增值税（蓝色）和一个候选调节蛋白，ATRX（绿色）。我们的DNA-FISH协议，直接或酶为基础的检测RNA-FISH和免疫荧光信号的组合，代表了多功能的，广泛适用的工具集， 就地在细胞和组织水平的病毒-宿主关系的探讨。
图1。将DNA-FISH协议和融入多个目标染色的概述 。该DNA-FISH协议和其他协议用于RNA和蛋白质的codetection连接的主要步骤是示意性地表示。关键步骤是由警告标志指示。 DNA-FISH主要步骤是补液，透化，去掩蔽，甲醇 - 乙酸处理和杂交。在过程中，揭露是关键的一步，这需要仔细设置和尊敬。另外两个关键的步骤取决于它的技术程序与用于免疫检测抗体兼容。这些都会影响到对三联染色的RNA-FISH程序，并就免疫。的检测策略ç舔这里查看大图。
图2。检测抗原修复后的HSV-1潜伏基因组 。制备从28 dpi的感染小鼠A.变装部分在协议中部分所示。 TG切片进行处理，进行DNA-FISH， 如图1所示，热系揭露是执行使用每个图像的顶部所表示的缓冲区。细胞核的轮廓被示出为虚线。在细胞质中观察到的信号是由于自体荧光的组织。制备如甲B. TG部分。曾经处理使用市售获得的生物素标记的HSV-1 DNA探针-FISH。使用TSA和的Alexa Fluor标记substra检测杂交探针TE（绿色）。细胞核用Hoechst 33352（蓝色）。扩大后的裁剪图像显示在右列。两种类型的HSV-1基因组的模式都显示了一个典型的HSV-1核内的定位。所有图像收集在宽视场落射荧光显微镜。比例尺为5微米。 点击这里查看大图 。
图3。在几种型号的检测HSV-1基因组。答：标准的DNA-FISH协议被应用到TG部分来自各种来源。 SC16感染小鼠TG切片在协议中部分描述的方法制备。 17syn +感染小鼠部分和McKrae感染兔切片进行山坳提供laborators。图像收集在宽视场落射荧光显微镜。比例尺为5μm。B. SC16感染小鼠进行一般的疱疹病毒感染处死6 dpi与几种组织收集，冷冻并切片。在标准DNA-FISH协议应用于如图1所示。图像收集在宽视场落射荧光显微镜。比例尺是10微米。 点击这里查看大图 。
图4。的HSV-1基因组DNA和单段的RNA和蛋白质Codetection。SC16感染小鼠TG切片加工的RNA-DNA FISH，免疫DNA FISH或三重stainin克作为使用的HSV-1基因组的Cy3 如图1所示。A. RNA-DNA FISH标记的探针（红色）和RNA-LAT生物素化的核糖探针（绿色）。使用TSA和的Alexa Fluor 488标记的底物检测土地增值税的RNA探针。细胞核用抗CENP-A抗体（绿色）用Hoechst 33352（蓝色）B.免疫DNA FISH和HSV-1基因组中的Cy3标记的探针（红色）。该抗体是后固定10分钟，用1％PFA的PBS运行的DNA-FISH之前。细胞核用Hoechst 33352（蓝色）。C.使用RNA-LAT生物素化的核糖探针（蓝色）的免疫RNA-DNA-FISH，抗ATRX抗体（绿色）和HSV-1基因组中的Cy3标记的探针（红色）。采用酪酰胺的检测和蓝色荧光标记的底物检测出的LAT核糖核酸探针和抗ATRX和第二抗体是由酪胺的检测和绿色荧光标记的底物进行检测。所有图像收集在宽视场落射荧光米icroscope。比例尺为5微米。 点击这里查看大图 。
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Discussion
这里所描述的协议允许的小鼠神经组织切片的神经元内HSV-1潜伏基因组的检测。我们的调节病毒基因表达的途径的理解已经由缺乏方法来检测HSV-1基因组DNA 的原位神经组织内的限制。基因组拷贝数和被感染的神经元比例的信息主要来自PCR分析对分离的神经元11,12。在阐明作用的宿主细胞的核架构对HSV-1的延迟，我们设置确定潜伏的HSV-1基因组的国产化通过DNA-FISH，潜伏感染的小鼠神经元的细胞核内。我们已经测试了多种DNA-FISH协议和组织的治疗，并发现热为基础的“表位揭露”病毒的DNA-FISH检测的一个重要步骤。这种治疗是经常用来揭示蛋白质的表位内的石蜡包埋切片进行免疫组化分析。虽然这几乎是普遍使用的在病理上，它不是通常用于在DNA-FISH。虽然许多研究支持这种技术保留在组织的光学显微尺度的形态，终端用户应包括适当的对照来验证这一点在他特定生物系统38。在我们的手中，其他揭露程序，如蛋白酶处理并没有让HSV-1 DNA检测，同时采用各种缓冲区热为基础的揭露一贯做的HSV-1潜伏基因组DNA可用于FISH探针（ 图2）。基于热的去掩蔽被认为是消除蛋白质之间的交联键的一部分，这表明HSV-1 DNA是紧密相关的蛋白质。这与HSV-1潜伏和裂解基因组与细胞组蛋白2,39,40相关联的最近的示范一致。 ; HCMV 42,43; EBV 44-46; KHSV 47-49时，普罗特VZV 41：因为其他疱疹病毒的基因组与组蛋白相关这里描述OCOL可能被应用到检测到这些疱疹病毒的基因组，以及许多其他国家，但也可能以检测其他持久性核病毒如乳头瘤病毒，乙肝病毒，和逆转录病毒。有趣的是，在不同的实验设置（组织免受感染的小鼠和兔，制备不同实验室的部分，并使用不同的HSV-1菌株）使用当前协议不要求额外的设定用于检测HSV-1基因组中。要应用协议的其他生物系统，我们预计固定方法和抗原修复技术可以进一步发展的领域。
在评价HSV-1延时的经典方法是检测的结合，不存在检测的裂解周期基因产物在神经元中的LAT RNA的存在。然而， 原位 PCR和qPCR基于从延迟的小鼠模型分离的神经元的研究表明，感染的神经数RONS（ 即 HSV-1基因阳性神经元）比土地增值税表达神经元12,18高两到三年的时间。利用RNA-DNA的鱼，它证实了在我们的小鼠模型中的HSV-1 DNA阳性神经元的20-30％，也积极为土地增值税的RNA 22。使用DNA-FISH和病毒和细胞的DNA codetection的，RNA和蛋白质的组件将提供一种新的工具集来表征调节HSV-1的潜伏基因表达的途径。此外，HSV-1的延迟时间是已知的异构现象，因为它发生在各种神经元亚型的，而在基因组中的拷贝数和在LAT RNA表达12,22它的特点是异质性。 DNA-FISH的一个主要优点是提供访问单细胞分析中的组织的复杂性，从而考虑到HSV-1潜伏的异质性。例如，我们已经把土地增值税RNA的表达与HSV-1基因组中单个神经元22的丰度。在广告DITION，该技术还可以应用于评估采用体外细胞培养模型以及利用人类神经节植入到SCID小鼠中13-17动物模型中的病毒基因组的状态。我们的DNA-FISH协议的一个未来的应用将通过HSV-1基因阳性神经元的数量来表征HSV-1潜伏的可能性。这可以通过使用生物素化的探针和酪胺为基础的检测，其产生的信号足够强以低倍率进行检测来进行。这样的应用是由酪胺的检测系统所产生的非常低的背景而成为可能。该Cy3标记在本协议中所述的HSV-1探测器可以作为很好但是需要观察在更高的放大倍率，这将是非常耗时的阅读大量章节。
也许这里所述的DNA-FISH协议的主要品质是通用性和鲁棒性，这使得它与T兼容他codetection RNA和蛋白质。事实上，我们发现，以检测RNA或蛋白质，或两者所需的所有处理，不改变DNA-FISH信号的质量和亮度。 RNA-FISH可以的DNA-FISH之前，无论是使用乙醇脱水或甲酰胺为基础的预杂交进行。我们推荐的乙醇为基础的协议，这会导致与TSA检测试剂较少的背景。当RNA-FISH其次是免疫与不上乙醇处理样品工作抗体甲酰胺为基础的协议应该被使用。当进行免疫的DNA-FISH，免疫荧光信号的共价连接可以通过酪胺为基础的检测（放大了的信号），或由后固定以保持蛋白质定位图案的细节的情况下进行的。为了优化后固定，免疫荧光协议首先应设置以得到一个强烈的信号，和最强的后固定程序，允许良好的DNA-FISH信号应确定。这西港岛线升提供的范围内，可以得到保存免疫和DNA-FISH信号之间的最佳折衷条件。为任何其他基于抗体的检测方法中，信号的质量，最好的协议是高度依赖于该抗体本身。我们的协议也不例外，我们已经观察到一些抗体很好地工作与任何此处所描述的协议（例如抗PML单抗克隆36.1）和其他一些需要显著的测试。总体而言，我们成功地检测到大部分的预定目标（一个例外是SP100的蛋白质），包括细胞质和细胞膜蛋白，并与各种核域（染色质HP1-，着丝粒-CENP-A，CENP-B-PML相关的核蛋白核小体，PML，Daxx蛋白，ATRX-）。我们的测试的基础上，我们预期，我们的DNA-FISH协议是与免疫codetection记者构造兼容（β-半乳糖苷酶，荧光蛋白...），是常用来分析促销从病毒基因组之三的活动。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢N.萨维特尔（辛辛那提儿童医院医学中心，辛辛那提，俄亥俄州，美国），S. Efstathiou（英国剑桥的大学）和詹姆斯·希尔（路易斯安那州立大学健康科学中心，新奥尔良，美国）提供的样品从HSV-1感染的小鼠和兔子分别和试剂; H.增本（上总DNA研究所，千叶县，日本）和S. Khochbin（阿尔贝研究所Bonniot，格勒诺布尔，法国）的有益讨论。
这项工作是由该中心法国国家科学研究（CNRS）（ATIP程序，PL，http://www.cnrs.fr）资助，法国国家研究署（ANR）（ANR-05-MIIM- 008-01，CENTROLAT， http://www.agencenationale-recherche.fr ），该FINOVI基金会（ http://www.finovi.org/:fr:start ），该LabEX DEVweCAN（ANR-10的LabX-61大学德里昂），在程序中“InvestissemenTS D'艾文莉“（ANR-11-IDEX-0007）的ANR操作（ http://www.agence-nationale-recherche.fr ），L'协会倒拉RECHERCHE CONTRE乐巨蟹座（ARC-7979和ARC- 4910， http://www.arc-cancer.net ），LA法甲驳国立癌症勒（LNCC， http://www.ligue-cancer.net ），和印加（EPIPRO程序， http://www.e - cancer.fr ），FC和PL是法国国家科学研究中心的研究人员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
References
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