Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Påvisning af genom og Udskrifter af en Vedvarende DNA-virus i neuronvæv af Fluorescent In situ Hybridization Kombineret med Immunfarvning

Published: January 23, 2014 doi: 10.3791/51091
Automatic Translation
1,2,5, 4, 4, 1,2,3
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

Summary

Vi har etableret en fluorescerende in situ hybridisering protokol til påvisning af en vedvarende DNA-virus genom inden vævssnit af dyremodeller. Denne protokol gør det muligt at studere infektion ved at codetection af det virale genom, dets RNA-produkterne, og virale eller cellulære proteiner i enkeltceller.

Abstract

Enkelt celle codetection af et gen, dens RNA-produkt og cellulære regulatoriske proteiner er afgørende for at undersøge genekspression regulering. Dette er en udfordring inden for virologi, især for nuklear-replikerende vedvarende DNA-virus, der involverer dyremodeller for deres undersøgelse. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) indfører en livslang latent infektion i perifere neuroner. Latent virus tjener som reservoir, hvorfra det genaktiveres og inducerer en ny herpes episode. Cellebiologi af HSV-1 latency stadig dårligt forstået, delvis på grund af mangel på metoder til påvisning af HSV-1-genomer in situ i dyremodeller. Vi beskriver en DNA-fluorescerende in situ hybridisering (FISH) metode effektivt at detektere lav kopi virusgenomer inden sektioner af neuronale væv fra inficerede dyremodeller. Metoden bygger på varme-baserede antigen demaskering, og direkte mærkede hjemmelavede DNA-prober eller kommercielt tilgængelige prober. Vi udviklede en tredobbelt staining tilgang, der kombinerer DNA-FISH med RNA-FISH og immunfluorescens, ved hjælp af peroxidase baseret signal forstærkning til at rumme hver farvning krav. En vigtig forbedring er evnen til at opnå inden for 10 um vævssnit, lav baggrund signaler, der kan afbildes ved høj opløsning ved konfokal mikroskopi og bredt synsfelt konventionel epifluorescens. Derudover tredobbelt farvning arbejdede med en bred vifte af antistoffer rettet mod cellulære og virale proteiner. Den fuldstændige protokol tager 2,5 dage til at rumme antistof og probe penetration i vævet.

Introduction

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) er en vedvarende human neurotropisk virus, oprettelse af en langsigtet latent infektion i neuronerne i trigeminale ganglier (TG), i det perifere nervesystem, hvorfra det genaktiveres periodisk at replikere og sprede sig. HSV-1-genomet er et 150 kb dsDNA lokalisering i kernen af værten neuron, hvor den forbliver som multikopi chromatinized plasmider, som ikke integreret i værtscelle-genomet 1,2. Under latenstid, er HSV-1-replikation cyklus genetisk program stærkt undertrykt, og genekspression er begrænset til latens-associerede udskrift (LAT) locus, fra latency etablering initiering af reaktivering 3.. LAT producerer en lang 8,5 kb noncoding RNA forarbejdet til en større 2 kb stabil lasso, og flere miRNA 4-7. HSV-1-latens er således kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​det virale genomiske DNA, LAT RNA og ved fravær af påviselige replikative cyklus proteiner.

NDHOLDET "> Dyremodeller, overvejende mus og kanin, er eksperimentelle modeller opridset flere funktioner af latens i menneskelig. En af de vigtigste interesser på disse modeller er, at de tillader at studere fysiologiske aspekter af HSV-1 latens i immunkompetente værter. Gennem de seneste årtier mange eksperimentelle værktøjer, såsom genetisk modificerede vira og mus, er blevet udviklet til at studere fysiologi, genetik og cellebiologi af HSV-1 latency fra dyrevæv. Indtil nu viralt genomisk DNA påvises og kvantificeres ved Southern blot og qPCR fra dissocieret TG'er. Der er imidlertid ingen metode til at detektere HSV-1-genomet ved in situ hybridisering på vævssnit 8. Følgelig latenstid rutinemæssigt vurderes på histologiske snit gennem påvisning af LAT RNA ved RNA in situ hybridisering snarere end virale genom detektion. Fordi det har været umuligt at karakterisere inficerede celler baseret på tilstedeværelsen af ​​virale genomer, This tekniske begrænsninger har været en stor ulempe ved analyse af mange aspekter af vært-virus-interaktioner, såsom forholdet mellem det virale genom og cellulære og viral genekspression eller immunrespons 9,10 værtscelle-medieret.

Vigtigst er det, at celle-til-celle heterogenitet af latent infektion er fortsat relativt uudforsket og har vist sig at være et centralt element i latens i mus og i humane sensoriske ganglion neuroner implanteret i SCID mus 11-17. Typisk blev det vist af qPCR, at HSV-1-genomet kopiantal per celle varierer fra 5 til flere hundrede. Selv LAT vises som en vigtig regulator af latens og reaktivering qPCR data vedrørende isolerede neuroner og i situ-PCR viste, at kun en delmængde af latent inficerede neuroner, så lavt som 30%, udtrykker LAT locus 11,12,18-21. Hvor værtscellen og cellulære miljø i vævet indvirkning på virus latency etablering ogviral genekspression stadig uklar. Her beskriver vi en robust fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) fremgangsmåde til effektiv påvisning af lav-kopi HSV-1-genomisk DNA i animalske neuronale vævssnit. Denne metode er blevet udviklet og bruges af os til at få adgang til høj opløsning mikroskopi billeddannelse, der er nødvendig for at studere interaktion mellem det virale genom med værtscellesystemerne intra-nukleare komponenter 22. Derudover beskriver vi en multipel farvning fremgangsmåde til samtidig påvisning af det virale DNA med RNA og proteiner, som er et unikt værktøj til at beskrive virus-værts-interaktioner, der regulerer viral genekspression. Metoden kan også anvendes til en bred vifte af analyser, der kræver påvisning af HSV-1 latent genom, såsom kvantificere inficerede neuroner i mange sektioner. Et vigtigt skridt er at anvende antigengenfinding behandling for at det virale DNA tilgængelige til hybridisering. Således kan protokollen også være effektiv til påvisningandre dsDNA virus, som i øjeblikket ikke kan påvises ved konventionelle DNA-FISH fremgangsmåder i dyrevæv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne metode blev anvendt i en undersøgelse offentliggjort tidligere 22. For generelle baggrund og beskrivelse af konventionel manipulation på ISH, IF og FISH, foreslår vi følgende tilgængelige litteratur 23.

1.. Animal Infektion

Alle procedurer, der involverer forsøgsdyr var i overensstemmelse med etiske spørgsmål fra Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi (ARVO) Redegørelse for anvendelse af dyr til forskning, og blev godkendt af lokale etiske udvalg UPR-3296-CNRS, i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv 86/609/EØF. Alle dyr modtog ubegrænset adgang til foder og vand.

Fremgangsmåden mus infektion med HSV-1 beskrevet nedenfor er blevet anvendt i undersøgelser tidligere offentliggjorte 24-26.

  1. Forbered følgende løsninger for at forberede før start:

    HSV-1-virus-stamopløsning
    Bedøve løsning - Ketamine-100 mg / kg og Xylazin-10 mg / kg
  2. Tage 1 ml af virus (10 6 pfu) i en 5 pi glas mikrosprøjte forbundet til en mikrosprøjte pumpeindretning levere 0,1 ul / sek Bemærk:. Resuspendér virusstamopløsningen i et phenolrødt-frit medium for at se grænsen mellem rød olie præsentere i kapillarrøret og virus-opløsning og for at undgå lufttilførsel på stedet for virusinokulering.
  3. Læg den bedøvede mus (ketamin-100 mg / kg og Xylazin-10 mg / kg) på ryggen opad.
  4. Placer den bedøvede mus hovedet under en kikkert stereomikroskop og indfør nålen i subepithelial lag af den venstre overlæbe ved mukokutan grænse. Injicer virus løsning i to trin (dobbelt 0,5 ul) ved en hastighed på 0,5 pi per 5 sek Bemærk:. Overholde en 10 sek pause mellem de to 0,5 pi injektioner, for at aktivere den virale suspension absorberer ved injektionsstedet.
  5. Placer musen ien 37 ° C inkubator indtil vækket.
  6. Lad musen i dyrefaciliteternes at inddrive for den ønskede tid Bemærk:. I musemodel HSV-1 inducerer en primær infektion, kaldet akut infektion, der varer mindre end 10 dage i stedet for podning og inden for flere neuronale væv, herunder TG, overlegen cervikale ganglier (SCG), og dorsalrodsganglier (DRG) afhængig podningsstedet. Tegn på primær infektion gradvist forsvinde og latenstid anses fuldt etableret omkring 28-30 dage efter infektion (dpi), og frem. Neuronvæv kan høstes sædvanligvis fra 4 dpi for undersøgelser af akut infektion, og fra 28 dpi til latency studier.

2. Mus perfusion-fix

  1. Forbered følgende løsninger, før du begynder: 50 ml fysiologisk saltvand buffer

    60 ml 1x PBS
    150 ml frisk fremstillet 4% paraformaldehyd i 1x PBS
    60 ml 20% sucrose i 1x PBS. <br />
  2. Forbered perfusionsslange: forbinde nålen til et kapillarrør, som er forbundet til en peristaltisk pumpe.
  3. Bedøver musen som beskrevet ovenfor (SREP 1.2) og lægge den på ryggen på en dissektion bakke, fastgjort med de fire ben med ben.
  4. Brug saks skære huden fra maven op til halsen *. Riv den tynde væv lag, der dækker de organer. Åbn brystkassen ved at skære ribberne på den ene side af brystbenet. Fjern huden ved afrivning. Flyt væk fra hinanden i højre og venstre dele af brystkassen til at afsløre hjerte Bemærk:. Vær opmærksom på ikke at incise modet, lunger og store fartøjer (carotis arterier og halsvener), som vil gøre det umuligt perfuse-fiksering.
  5. Stik nålen i venstre ventrikel *. Incise højre atrium med en saks. Fortsæt med afblødning ved at injicere 20 ml fysiologisk saltvand i blodkarrene gennem hjertet. Lad blodgennemstrømningen i bakken. Nejte: Under denne procedure, er opmærksomme på ikke at punktere gennem den anden side af hjertet.
  6. Perfuse med 150 ml 4% PFA i 1x PBS i 15 min * (Forsigtig: PFA er giftigt, manipulere under emhætte). Perfuse 60 ml 20% sucrose i 1x PBS i løbet af 6 min. På dette tidspunkt er musen klar til TG høst Bemærk:. Indstil pumpen til 10 ml / min. En god perfusion er mærkbar, når musen halen stivner op, løft op derefter falder igen.

3. TG Høst

  1. Forbered følgende løsning, før du begynder:

    20% sucrose i 1x PBS
  2. Skær hovedet på niveau af halsen. Skær spidsen af ​​næsen lige bag fortænder for at afsløre næsen hulrum. Incise ganen i to med en saks og bevæge sig væk hver side af ganen Bemærk:. TGS vises lige under ganen, som to hvide og aflange masser af 2-3 mm i længden placeret på højre ogvenstre side og forbundet til trigeminal nerve.
  3. Skær trigeminal nerve grene på hver side af TG'er at frigive TG'er fra hjernestammen. Fjern TGS med kirurgiske tænger og holde dem i en 20% sucrose steril opløsning i 24 timer Bemærk:. Brug to forskellige modtagere for venstre og højre TG, for at undgå forveksling mellem venstre TG (inficerede) og retten TG (ikke eller svagt inficerede). Inkubér TGS i 20% sucrose i 1x PBS i 24 timer, før indstøbning.
  4. Indlejring TG'er i en enkelt blok i cryosectioning indstøbningsmedium og fryse ved -80 ° C.
  5. Store blokke ved -80 ° C indtil skæring.

4.. Kryosektion Forberedelse

  1. Skær TGS på langs som 10 um snit på -20 ° C cryostat, og placere dem på lidt varme (30 ° C) SuperFrost dias. Lad skiverne tørre i 5-10 minutter og derefter fryse og opbevares ved -80 ° C indtil brug Bemærk:. Op til 4-5 sektioner kan være placeres på et enkelt objektglas, hvis store antal sektioner skal behandles på samme tid. Vi fortsætter som følger: serielle sektioner er deponeret på 3 serier af lysbilleder mærket A1, B1 og C1, så A2, B2, C2 og så videre. Derfor kan hver slide serie (A, B og C) behandles til forskellige farvning (in situ hybridisering, FISH, in situ-PCR, LCM) og data opnået under anvendelse af de forskellige teknikker kan sammenlignes vide, at objektglas der bærer det samme antal svarer til den samme region af TG.

5.. HSV-1 Probe Mærkning

Protokollen beskrevet herefter til påvisning af HSV-1-genomet ved DNA FISH held har været anvendt to typer prober. Den første er en hjemmelavet Cy3-mærket fluorescerende probe, som er passende for den fine analyse af nukleart organisation inden for de enkelte celler, ved høj forstørrelse fluorescerende mikroskopi. Den anden er en kommercielt tilgængelig biotinyleret probe, som kan kombinered med peroxidase-baseret signalforstærkning at give et lyst signal. Sidstnævnte er egnet til identifikation og kvantificering af virus indeholdende neuroner ved lav forstørrelse i hele afsnittet, og til analyse af de HSV-1-genom-mønstre. Slutbrugerne bør vurdere, hvilken tilgang der passer bedst målet for deres undersøgelse. De kommercielt tilgængelige sonde er opført i reagenset sektion, og forberedelsen af ​​den hjemmelavede sonde er beskrevet nedenfor.

  1. Forbered følgende løsninger, før du begynder:

    HSV-1-genomet indeholder vektorer (se trin 1)
    70% ethanol, molekylærbiologisk kvalitet.
  2. Bemærk Forbered cosmider indeholdende 30 kb dele af HSV-1-genomer (cosmider nummer 14, 28 og 56 beskrevet i reference 20 ved hjælp oprensningssøjlerne dedikeret til store vektorer:. Anden type biblioteker indeholdende HSV-1-genomer, såsom bakterielle kunstige kromosomer bør arbejde så godt, så længe sondeovertræk alarge del af HSV-1-genomet til at producere tilstrækkelig signaleffekt 27-29. I vore hænder har prober fremstillet fra cosmidvektoren rygraden producerer ikke noget signal, og blev anvendt som negativ kontrol. Således hele cosmid vektorer indeholdende HSV-1-sekvensen blev anvendt i vores undersøgelse. Det er også muligt at skære HSV-1-sekvens og bruge det til at forberede sonden.
  3. Bemærk Label 2 ug af hver cosmid med Cy3-dCTP ved hjælp af et nick-translation-kit i henhold til retningslinjerne producenten:. Udfør mærkning med en reaktion mix, der kun indeholder Cy3-dCTP og ingen umærket dCTP.
  4. Reaktionen standses ved tilsætning af 3 pi 0,5 M EDTA i blandingen, og opvarmning ved 70 ° C i 10 min. Cool på is.
  5. Renses sonden på en udelukkelse G50 gel minisøjle. Tilsæt 150 pg laksesperma-DNA til proben og udfældning af sonden ved ethanoludfældning. DNA pellet bør pink grund Cy3 inkorporering. Vask pelleten med 70% ethanol og fjerne så meget ethanolsom muligt med en pipette. Lad ikke pille tørre.
  6. Pellet opløses med 100 ul deioniseret formamid (Forsigtig: formamid er giftigt Manipulere under emhætte.). Koncentrationen Sonden kan ikke måles pålideligt på dette punkt. Sonden mængder nævnt i teksten henviser til mængden af ​​template-DNA anvendes til at gøre proben. Protokollen er baseret på 2 ug DNA-skabelon og 100 ul formamid, anses det for at være 20 ng / ul. Opbevar ved -20 ° C. Den mærkede probe kan fremstilles i store mængder og opbevares frosset i flere måneder.

6.. DNA-FISH

Figur 1 viser en oversigt over de vigtigste trin i DNA-FISH-protokollen, og hvordan du udfører DNA-fisk som en del af en multipel farvning eksperiment at codetect RNA og protein, som er beskrevet i protokol 7-9.

  1. Forbered følgende løsninger, før du begynder:

    0,5% Triton X-100 i 1x PBS
    2x SSC og 0,2 x SSC-buffer
    100 mM pH 6,0 citratbuffer (10x stamopløsning) og 10 mM pH 6,0 citratpuffer (arbejdsopløsning)
    2x hybridiseringspuffer (se protokol nr. 4)
  2. På dag 1 placere dias på et dias holder ved stuetemperatur, og lad afsnittene tørre i 10 min. Cirkel sektionerne med en hydrofob pen. Rehydrere sektioner i 1x PBS i 10 min. Inkuber sektionerne 20 min med 0,5% Triton X-100 i 1x PBS til permeabilisere væv. Wash 3x 10 min med 2 x SSC, og holde i 2 x SSC indtil afsløringen buffer opvarmes (se nedenfor).
  3. For demaskering, forberede et objektglas bakke (20 glider kapacitet) fyldt med 200 ml 10 mM natriumcitrat-puffer (pH 6,0). Placer bakken i en større beholder fyldt med 500 ml destilleret vand. Denne indstilling giver mulighed for en bedre styring af varme impulser. Før du placerer dias i bakken, forvarme buffer i mikrobølgeovn, indtil buffer når kogning (ca. 8 min ved 800 W).
  4. Anbring dine dias i den forvarmede citrat buffer indeholdende bakke, og kontroller, at de er helt dækket med buffer. Varme til omkring 20 sek indtil bufferen når kogningen. Forsigtig, lad ikke bufferen i kog, som kan beskadige vævet. Afkøl ved stuetemperatur i 2 minutter. Gentag opvarmning cyklus 6x (7 opvarmningscykler alt) *. Køl ned 2 min og overføre dias i 2x SSC for 5min.
    Bemærk *: Dette er en af de mest kritiske trin. Det optimale antal og varighed opvarmningscykler skal bestemmes empirisk, og kan variere afhængigt af typen af ​​væv eller typen af ​​anvendte probe. Mikrobølgeovnen, bakke, container og omfanget af buffer i bakken, og vand i beholderen bør holdes identisk for reproducerbarhed demaskering. Overdreven kogning kan resultere i tab af væv og beskadigede celler. For hver varme puls, er forekomsten af ​​kogende nøje overvåget, og varmeING bør stoppe ved første tegn på kogning. Når det er konfigureret, demaskering synes robust og reproducerbar. Figur 2A viser, at HSV-1-genomet kan påvises ved demaskering med forskellige buffere, hvilket indikerer, at demaskering forhold kan undersøges nærmere. Citrat-baserede demaskering fandtes til konsekvent at tilbyde god FISH signal, og vævskonservering, med sektioner fra forskellige laboratorie-og dyremodeller.
  5. Glassene inkuberes i en methanol: eddikesyre: PBS mix (3:01:04) i 15 min, og derefter i en methanol: eddikesyre mix (3:1) i 15 min (Forsigtig: eddikesyre er ætsende Manipulere under røg. hætte og bruge passende beskyttelse. denne løsning Forbered lige før brug).
  6. Dehydrere snit gennem successive 10 min inkubation i 70%, så 2x 10 min i 100% ethanol. Lad tørre ved stuetemperatur i 10 min. Opbevares tørt indtil sondering.
  7. Forbered sondering løsning som følger: forberede sig på forhånd en 20 ml bestand af 2x hybridiseringspuffer containing 20% ​​dextransulfat (MW 500.000), 2 x Denhardts opløsning, 4x SSC *. Afmål løsning som 500 pi i mikrorør og opbevares ved -20 ° C. For 1 slide (dækglas på 22 mm x 50 mm), bland 90 ng af HSV-1 Cy3-mærket probe (30 ng probe for hver cosmid), og færdiggøre volumen til 40 ul med formamid. Tilsæt 40 ​​pi 2x hybridiseringspuffer. Bland godt ved pipettering op og ned adskillige gange.
    Bemærk *: At forberede 2x hybridisering buffer, blande 4 g MW 500.000 dextransulfat i 10 ml destilleret vand. Det gør en viskos blanding, der opløses på 3-4 timer ved 70 ° C. Bland regelmæssigt for at hjælpe med at opløse. Tilsæt 4 ml 20x SSC, 400 pi 100x Denhardts opløsning. Komplet til 20 ml og bland godt ved hjælp af en vortex.
  8. Drop 80 pi sondering løsning på de tørrede sektioner. Dæk med et 22 mm x 50 mm dækglas, og kontroller, at sondering løsning breder sig overhele overfladen af ​​dækglasset. Advarsel: Der bør ikke være nogen bobler. Tilstedeværelse af bobler falder hybridisering effektivitet. Forsegl dækglasset hjælp gummi cement, og lad det tørre. Hold dias i mørke ved stuetemperatur i mindst 2 timer for optimal hybridisering signal i hele diaset.
    Bemærk: Gummi cement er praktisk, da det tørrer hurtigt, er vandtæt og beskytter prøven fra tørring under hybridisering. Det er også nemt at skrælle at fjerne dækglasset efter hybridisering. Neglelak er en alternativ effektiv, men mindre praktisk mulighed.
  9. Fortsæt med denaturering ved at placere dias på en 80 ° C slide inkubator i 5 min. Alternativt, skal du placere dias på en metalbakke og placere bakken i en 80 ° C vandbad (bakken skal flyde). Så hurtigt overføre slides på en metalbakken anbragt på is. Lad i 5 min. Overfør dias ved 37 ° C (slide varmeapparat eller inkubator) for overnight hybridisering.
    Bemærk: Vi anbefaler ikke kortere hybridisering, hvilket resulterer i svagt eller intet signal.
  10. På dag 2, skal du fjerne gummi cement med en pincet, samtidig med at slide på varmelegeme til at holde sektionen ved 37 ° C. Fjern dækglasset forsigtigt med spidsen af ​​en skalpel.
  11. Vask 3 x med 2x SSC ved 37 ° C i 5 min, og tre gange med 0,2 x SSC ved 37 ° C i 5 minutter. Vask en gang med 2 x SSC ved stuetemperatur i 5 minutter og fortsæt med DNA-farvning og montering (se protokol 10 nedenfor).
    Bemærk: Denne metode giver mulighed for påvisning af cellulære genomiske mål, ved hjælp af tilsvarende sonder til sondering løsning sammen med HSV-1-specifikke prober, som offentliggøres for centromerregionen og pericentromeric sekvenser 22.

7.. Dual RNA-DNA-FISH

Se figur 1, grønne bokse for et overblik.

For multiplefarvning procedurer, herunder en RNA-FISH trin, er det generelt tilrådes at først udføre RNA detektion som sådan målsætning er følsom for nedbrydning af RNAse og kemikalier. Derudover DNA-FISH procedure omfatter behandlinger, der mindsker effektiviteten af ​​anden farvning. For RNA-FISH, valgte vi et enzym baseret detektion tilgang (Tyramide Signal Amplification (TSA) ved hjælp af biotinylerede prober og peroxidase (HRP) koblet streptavidin). TSA er baseret på en fluorescerende tyramid substrat (se reagens tabel for detaljer), som er kovalent bundet til vævet ved et peroxidase enzymatisk reaktion. RNA-FISH signal er således bevaret under DNA-fisk.

  1. Forbered følgende løsninger, før du begynder:

    Vektor til in vitro transkription af LAT locus (pSLAT-2)
    1x PBS indeholdende 2 mM RVC
    0,5% Triton X-100 i 1x PBS indeholdende 2 mM RVC
    3% H 2 0 2 i destilleret vand.
    70%, 80%, 95% ethanol, molekylærbiologisk kvalitet.
    4x RNA hybridisering opløsning (se protokol nr. 4)
  2. Mindst én dag før RNA-FISH eksperiment, forberede RNA FISH probe. For at påvise HSV-1-latens-associerede Transcript (LAT), udarbejde et biotinyleret ribo-probe fra pSLAT-2-vektor 30, eller en anden vektor til in vitro transkription af LAT-locuset, som tidligere beskrevet i reference 26. Kort fortalt: Linearisere 10 ug pSLAT-2 med HindIII og oprense det fordøjede vektor med en DNA-oprensningskit. Syntetisere en enkelt streng ribo-probe fra 2 ug fordøjet pSLAT-2 med en T7-in vitro transcription kit i nærværelse af biotin-16-UTP *. Renses sonden med et RNA-mini-søjle og kvantificering ved 260 nm med et spektrofotometer. Fortynd sonden ved 50 ng / ul i DNAse / RNAse frit vand og opbevares ved -80 ° C, i små portioner for at undgå frysning-optøning cyklusser.
    Bemærk *: Den biotin-16-UTP: UTP-forholdet skal være empirisk bestemmes. Vi found en 40:60-forholdet for at give prober effektivt afsløre LAT ved RNA-fisk.
  3. På dag 1 placere dias på et dias holder ved stuetemperatur, og lad afsnittene tørre i 10 min. Cirkel sektionerne med en hydrofob pen. Rehydrere afsnittene i 1x PBS indeholdende 2 mM ribonukleosid vanadyl Complex (RVC) * i 10 min. Inkuber sektionerne i 20 minutter med 0,5% Triton X-100 i 1x PBS indeholdende 2 mM RVC at permeabilisere væv. Vask 3x 10 min med 1x PBS, 2 mM RVC. Til at slukke enhver endogen peroxidase aktivitet, inkuberes afsnittet i 3% H 2 O 2 for 2x 10 min, og derefter vaske en gang med 1x PBS, 2 mM RVC.
    Bemærk *: Gennem RNA-FISH procedure, ribonukleosid vanadyl kompleks (RVC) tilsættes buffere og løsninger for at forhindre RNA-nedbrydning.
  4. Inkuber 2x 10 minutter i 70% ethanol. På dette stadium kan sektioner blive opbevaret i 70% ethanol ved -20 ° C i flere uger. Dehydrere sektioner ved inkubation i 80%, 95% og 100% ethanol, 5 min hver. Lad afsnittet tørre i mindst 10 min.
    Bemærk: I nogle tilfælde kan ethanol behandling være skadelige for detektion af andre mål. Kan bruges 2x SSC (se nedenfor i protokol 9 for oplysninger om tredobbelt farvning) - En alternativ protokol ved hjælp af en præhybridiserings skridt i 50% formamid. Men ethanol behandling er den mest alsidige tilgang til RNA-FISH og giver den laveste baggrunden.
  5. Forbered sondering løsning som følger: forberede sig på forhånd en 10 ml bestand af en 4x RNA hybridisering opløsning indeholdende 8x SSC, 20x Denhardts opløsning, 4 mM EDTA, 40% dextran *. Afmål løsning som 500 pi i mikrorør og opbevares ved -20 ° C. For 1 slide forberede 80 ml af opløsningen (dækglas på 22 mm x 50 mm), ved at blande 20 ng biotinyleret LAT riboprobe, 40 ng gær tRNA, 2 mM RVC, og komplet til 20 ul med vand. Tilsæt 20 ul 4x RNA-hybridisering opløsning og 40 ulformamid (50% slutkoncentration). For at lette pipettering og blanding, anbefales det at opvarmning af 4x RNA-hybridisering opløsning ved 75 ° C. Bland godt ved pipettering op og ned adskillige gange.
    Bemærk *: Til fremstilling af 4x RNA-hybridisering opløsning blandes 4 g dextransulfat (MW 500.000) i 3 ml destilleret vand, og 4 ml 20x SSC. Det gør en viskos blanding, der opløses på 3-4 timer ved 70 ° C. Bland regelmæssigt for at hjælpe til at opløse. Tilsæt 2 ml 100x Denhardts opløsning, og 80 pi af en 0,5 M EDTA-opløsning. Komplet til 10 ml med vand og blandes godt bruge en vortex. Advarsel: Brug kun RNAse / DNase gratis produkter.
  6. Denaturere sonden 10 min ved 75 ° C. I mellemtiden placere dias på et dias inkubator indstillet til 65 ° C. Drop 80 pi sonde opløsning på afsnittene og hurtigt placere et dækglas på dråbe. Advarsel: Der bør ikke være nogen boble. Tilstedeværelse af bobler falder hybridisering efficiency. Inkubation skal finde sted i et fugtigt kammer, da dækglasset ikke er forseglet. Brug enten et dias inkubator, der kan holde vand (se materiale tabel), eller forberede et fugtigt kammer i en forseglet kasse og placere den i et 65 ° C hybridisering ovn.
  7. Inkuber natten over ved 65 ° C. Bemærk: LAT RNA-FISH udføres ved 65 ° C for at forhindre ikke-specifik binding af sonden, der er observeret ved 37 ° C. Mange andre RNA-FISH-prober bør resultere i godt signal ved 37 ° C.
  8. På dag 2, før de påbegynder vask, forberede reagenserne afsløring i henhold til instrukser fra TSA afsløring kit producenten. Detektion udføres med et kommercielt TSA detektionskit herunder peberrodsperoxidase (HRP) koblet streptavidin og en grøn eller blå fluorescerende substrat.
  9. Hold dias på diaset varmelegeme ved 65 ° C. Fjern forsigtigt dækglasset og hurtigt at tilføje 1 ml 50% formamid i 2 x SSC, forvarmet ent 65 ° C. Forsigtig, lad ikke afsnittet tørre. Vaskes to gange i 10 minutter ved 65 ° C i 50% formamid i 2 x SSC og 2x 10 min i 2 x SSC ved 65 ° C. Vask en gang mere med 2 x SSC og placere slide på en 37 ° C slide varmelegeme.
  10. Fortsæt med trin detektion ifølge TSA afsløring kit producent instruktion. Koncentrationen af ​​HRP-streptavidin, må koncentrationen af ​​fluorescerende substrat og reaktionstiden bestemmes empirisk *. For LAT RNA afsløring, vi rutinemæssigt anvendes følgende betingelse: HRP-streptavidin fortyndet ved 1/500, fluorescerende reagens ved 1/100 for blå fluorescens og 1/500 for grøn fluorescens, og reaktionstid på 10 minutter. Signalet kan kontrolleres hurtigt med en omvendt fluorescerende mikroskop uden montering, før du fortsætter med DNA-fisk.
    Bemærk *: Den amplifikationsprotokol vil være konstruktion i henhold til de vigtigste mål for forsøget. For eksempel, fint lokalisere mål-RNA, er adsom overvåger at anvende kort reaktionstid. I modsætning til hurtigt at identificere og tælle positive celler ved lav forstørrelse, reaktionstid kan øges til at generere et lyst signal.
  11. For DNA-FISH følge proceduren angivet ovenfor, startende fra afsløringen trin (trin 6.2).

8.. Immuno-DNA FISH

Se figur 1, lilla kasser til et overblik.

Ligeledes til RNA-DNA-FISH, anbefales det at udføre først immunfluorescens, da DNA-FISH er sandsynligt, at denaturere proteiner og forhindre deres påvisning af antistoffer. Kvaliteten af ​​immunfluorescens signal er stærkt afhængig af antistof-egenskaber, og flere antistoffer bør testes muligt. Epitop demaskering udføres én gang før den immunfluorescens at forbedre både protein opdagelse og DNA-fisk. For at bevare immunfluorescens signal på prøven under DNA-FISH procedure er det nødvendigt at covalently knytte det til vævet. Vi præsenterer her to tilgange, der gav gode resultater i vores hænder, antistof post-fiksering og tyramid baseret detektion (se trin 8.5). Valget bør være drevet af indledende test for hvert mål / antistof par.

  1. Forbered følgende løsninger, før du begynder:

    1x PBS indeholdende 3% normalt gedeserum (NGS).
    2% PFA i 1x PBS (fortynding fra 4% stamopløsning)
  2. På dag 1, de første skridt er identiske med DNA-FISH, op til afsløringen trin (trin 6.1-6.2).
  3. Efter demaskering, inkuberes de sektioner med 1x PBS indeholdende 3% NGS i 1 time.
  4. Inkuberes med det primære antistof, fortyndet i 1 x PBS indeholdende 3% NGS i 24 timer. Lavere inkubationstid kan anvendes til at forkorte den protokol, selvom vi fundet, at inkubation natten normalt resulterer i et stærkere signal. Op til 48-72 timers inkubation kan være påkrævet for lav affinitet primære antistoffer, såsom IgM.
  5. På dag2, vaskes 3x 10 min med 1x PBS.
  6. Protokol med antistof efter fiksering: inkuber i 1 time med det sekundære antistof koblet med et grønt fluorescerende farvestof, ved 1/200 i 1x PBS indeholdende 3% NGS. Der vaskes tre gange 10 min med 1x PBS. Post-fiksering udføres med 2% PFA i 1x PBS i 10 min *. Vask 3 x 10 min med 1x PBS.
    Protokol med TSA opdagelse: inkuberes 1 time med HRP-koblede sekundære antistof ved 1/250 i 1x PBS indeholdende 3% NGS. Der vaskes tre gange 10 min med 1x PBS. Fortsæt med tyramid detektering i henhold til producentens anvisninger. Som anført ovenfor (trin 7,9), reagens fortynding og reaktionstiden skal bestemmes empirisk. I de fleste tilfælde er vores protokol er baseret på en 1/500 fortynding af fluorescerende substrat og en 10 min reaktionstid. Vask 3 x 10 min med 1x PBS.
    Bemærk *: Post-fiksering er et afgørende skridt i immuno-FISH, og kræver omhyggelig opsætning. Jo stærkere den post-fiksering påbedre IF signalet og lavere DNA-FISH effektivitet.
  7. Fortsæt med DNA-fisk fra methanol-eddikesyre (trin 6.3). Varigheden af ​​immuno-DNA-FISH er typisk 3 dage, med det første antistof inkuberes natten over.

9.. Dual DNA-RNA FISH Kombineret med Immunofluorescence

Se figur 1, orangefarvede kasser for et overblik.

RNA-FISH udføres først, efterfulgt af immunfluorescens og endelig DNA-fisk. Hvis immunfluorescens er opdaget af tyramid reaktion, det er nøglen til at slukke helt HRP aktivitet fra RNA-FISH trin med H 2 O 2, og at kontrollere, at quenching er effektiv. Dette gøres ved hjælp af en slide som et "nej primært antistof" kontrol.

Fordi ethanol-baserede dehydrering er skadelig for visse opløsningsmidler følsomme proteiner, kan dette trin af RNA-FISH inhibere immunofluorescens. Hvis ja, kan RNA-FISH udføres wed en alternativ protokol, som nærmere beskrevet nedenfor i stpe 9.3.

  1. Forbered følgende løsning, før du begynder:

    50% formamid i 1x PBS indeholdende 2 mM RVC
  2. På dag 1, forberede RNA-FISH-probe og fortsæt som til dual RNA-FISH, op til H 2 O 2 quenching trin (trin 7.2).
  3. Case 1, den immunofluorescensfarvning fungerer efter ethanol dehydrering: fortsætte med RNA-FISH som angivet ovenfor i trin 7,3-7,9. Fortsæt derefter til trin 9.6 nedenfor.
  4. Case 2 er immunfluorescensfarvning forhindres ved ethanol behandling: Objektglassene anbringes i et fugtigt kammer på et objektglas varmelegeme indstillet til 65 ° C og inkuberes i 1,5 timer i en præhybridiserings-opløsning indeholdende 50% formamid, 1x PBS og 2 mM RVC. Dræn præhybridiseringsopløsningen og slippe 80 ul hybridiseringsopløsning som angivet i trin 7.4 og 7.5. Fortsæt derefter med RNA-FISH hybridisering og påvisning som angivet above i trin 7,6-7,9 (dag 2 og 3).
  5. , Efter RNA-FISH er færdig, fortsæt med immuno-DNA-FISH startende med afsløringen trin (se trin 6.2) på dag 2.. Følg derefter den immuno-DNA-FISH protokol som angivet ovenfor i trin 8,2-8,6.

10.. Slide Montering og Imaging

  1. Forbered følgende løsning, før du begynder:

    Hoechst 33342 på 0,5 ug / ml i 1x PBS
  2. Stain kerner i 10 min med DAPI eller Hoechst 33342 * 0.5 ug / ml i 1 x PBS i 10 min. Vask 3 x 10 min med 1x PBS.
    Note *:. Forsigtig Hvis en af detektionssystemer anvender en fluorescerende blå farvestof, skal du ikke bruge DAPI eller Hoechst. Brug i stedet et fluorescerende DNA-farvestoffer med en emission spektre i langt røde bølgelængde såsom Topro3.
  3. Tøm så meget væske som muligt fra diaset. Drop 80 pi montering medium, der indeholder et antifading agent i den ene ende af diaset. Dæk sektioner med en høj optisk kvalitetdækglas (nr. 1.5 glas). Lad dækglasset gå langsomt ved at holde det i den ene ende med en pincet for at lade monteringsmedium spredt over sektion uden bobler.
  4. Seal med neglelak og opbevares ved 4 ° C i en mørk slide kassen.
  5. Direkte observation af DNA-FISH signal latente HSV-1-genomer kræver en 40X eller højere forstørrelse olieimmersion mål med høj numerisk blænde (f.eks 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) og en excitationslyskilde til mindst svarer til en 100 W kviksølv lampe. Vi anbefaler at bruge en højeffektiv transmission mikroskop, såsom dem, som producenterne i de sidste 5 år (se tabellen af ​​udstyr). Konfokal mikroskopi giver værktøjer til at indsamle billeder med lavere baggrund på grund af auto-fluorescens af vævet, såsom tynde sektionering eller spektral billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter flere måneders omfattende testning, opdagede vi, at varme-baserede kemiske demaskering gjort latent HSV-1-genomet rådighed til fluorescerende in situ-hybridisering. Under processen, vi forsøgte forskellige afsløring procedurer, og kun varme-baserede behandlinger (dvs. opvarmning afsnittene op til sub-kogepunktet i en mikrobølgeovn) syntes effektiv. Vi derefter testet flere saltbuffere, der rutinemæssigt anvendes i immunhistokemi (IHC) og elektronmikroskopi til at hente epitoper 31,32, herunder 0,01 M, pH 6,0 citratbuffer (som vi anvendte i alle vores undersøgelser), 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1 M Tris-HCI pH 7,4, og destilleret vand. Mens EDTA buffere tendens til at beskadige vævet, alle andre buffere var egnet til HSV-1 afsløring, der vises som en enkelt eller flere pletter inden kernen af neuroner (figur 2a, bemærke, at disse væv er meget auto-fluorescerende, som vises i nogle billeder som en homogen signal i cytoplasm). I vores hænder, citratbuffer syntes at konstant at give et godt signal uden at beskadige vævet, og dermed blev valgt til vores rutine protokol.

Anvendelsen af ​​direkte mærkede Cy3-DNA-prober (fremstillet af dele af HSV-1-genomet klonet i cosmider) giver robuste og reproducerbare resultater. Men det kræver at have adgang til HSV-1-genom-biblioteker. Vi således bekræftet, at vores protokol ville arbejde for alle, der kun har adgang til kommercielle sonder. Figur 2B viser HSV-1 latent genom påvisning af DNA-FISH ved hjælp af en pan-HSV-1 biotinyleret sonde fås fra Enzo Biochem. Langs disse linjer, vi har testet, om DNA-FISH protokol potentielt kunne bruges af forskere, der bruger andre HSV-1-dyremodeller. 3A illustrerer påvisning af HSV-1-genomet på prøver fra mus og kaniner inficeret med tre almindeligt anvendte stammer, SC16, 17syn + og McKrae, enten akut eller latent stadium af infektion, inden dele af trigeminus ganglia. I alle tilfælde HSV-1-genomer viser som en plettet signal, lysstyrke og intensitet, der varierer fra celle til celle. Endelig har vi udvidet anvendeligheden af ​​vores protokol til den replikative cyklus af HSV-1, ved at udføre DNA-FISH på væv fra mus, der gennemgår en generel herpes-infektion. Hos disse dyr kunne påvises store og lyse aggregater af HSV-1-genomer i forskellige væv, herunder hjerne, rygmarv, øjne og dorsalrodsganglier (figur 3B).

Mange aspekter af HSV-1 latency er stadig dårligt forstået, såsom hvordan HSV-1 genekspression reguleres gennem sine interaktioner med nukleare arkitektur 33-35, om en bestemt delmængde af neuroner foretrækkes vært-celle for ventetid etablering og reaktivering 13 , 14,36,37, eller hvordan immun overvågning finder sted inden for ganglierne ifølge virus belastning eller virus genekspression 9,10. Den her beskrevne protokol vil bidrage til at løse disse spørgsmål, vedcodetection af HSV-1-genomet og virale eller cellulære RNA'er og proteiner Figur 4 illustrerer codetection af HSV-1-genomet sammen med HSV-1-LAT-RNA (fig. 4A og 4C), med cellulære proteiner, såsom centromerregionen protein CENP-A. (figur 4B, hvis den efterfølges af PFA post-fiksering) eller kromatin og PML-NB associeret protein ATRX (figur 4C, hvis den efterfølges af TSA baseret detektion). Figur 4C illustrerer data fra en tredobbelt farvning eksperiment viser HSV-1 DNA ( rød), dens RNA-produkt LAT (blå) og en kandidat regulerende protein, ATRX (grøn). Kombinationen af vores DNA-FISH protokol og direkte eller enzym baseret detektion af RNA-FISH og immunfluorescens signal, udgør et alsidigt og bredt anvendelig sæt af værktøjer til at udforske in situ virus-vært forholdet på celler og væv niveau.

Figur 1 Figur 1. Oversigt over DNA-FISH-protokol og integration i flere mål farvning. De vigtigste trin i DNA-FISH-protokol og forbindelsen med protokoller for codetection af RNA og proteiner er skematisk repræsenteret. Kritiske trin er angivet med advarselsskilte. DNA-fisk vigtigste trin er rehydrering, permeabilisering, demaskering, methanol-eddikesyre behandling og hybridisering. Inden proceduren demaskering er et afgørende skridt, som skal være omhyggeligt opsætning og respekteret. De to andre kritiske trin afhænger hvilke tekniske procedurer er forenelige med de anvendte antistoffer til immundetektion. Disse vil få indflydelse på proceduren for den tredobbelte farvning RNA-FISH, og på påvisning strategi immunfluorescens. Cslikke her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Påvisning af HSV-1-latent genom efter antigen demaskering. A. TG sektioner fra 28 dpi inficerede mus blev fremstillet som angivet i protokollen sektion. TG sektioner blev behandlet for DNA-fisk som angivet i figur 1, og varmen-baserede demaskering var udføre ved hjælp af buffer angives øverst på hvert billede. Omridset af kernen er afbildet som en punkteret linie. Signalet observeret i cytoplasmaet skyldes autofluorescens af vævet. B. TG sektioner fremstillet som i A. blev behandlet for DNA-FISH ved hjælp af et kommercielt opnået biotinyleret HSV-1 sonde. Den hybridiserede probe blev påvist under anvendelse TSA og en Alexa Fluor mærket substrate (grøn). Kerner blev modfarvet med Hoechst 33352 (blå). Et udvidet beskårne billede vises i højre kolonne. To typer af HSV-1-genomet mønster er vist for at illustrere et typisk HSV-1 intranukleær lokalisering. Alle billeder blev indsamlet på et bredt felt epifluorescensmikroskop. Målestokken er 5 um. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. Påvisning af HSV-1-genomet i flere modeller. A. standard DNA-FISH protokol blev anvendt på TG sektioner fra forskellige oprindelser. SC16 inficerede mus TG sektioner blev fremstillet som beskrevet i protokollen sektion. 17syn + inficerede mus sektioner og McKrae inficerede kanin sektioner blev leveret af collaborators. Billeder blev opsamlet på en bred felt epifluorescensmikroskop. Målestokken er 5 um. B. SC16 inficerede mus, der gennemgår en generel herpes-infektion blev aflivet efter 6 dpi og adskillige væv blev opsamlet, frosset og snit. Standard DNA-FISH protokol blev anvendt som angivet i figur 1. Billeder blev opsamlet på en bred felt epifluorescensmikroskop. Målestokken er 10 mM. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 4.. Codetection af HSV-1-genomisk DNA og RNA og proteiner på enkelte sektioner. SC16 inficerede mus TG sektioner blev forarbejdet til RNA-DNA-FISH, immuno-DNA fisk eller den tredobbelte staining som angivet i figur 1. A. RNA-DNA-FISH under anvendelse af en HSV-1-genomet Cy3 mærket probe (rød) og en RNA-LAT biotinyleret ribo-probe (grøn). LAT RNA-probe blev påvist under anvendelse TSA og en Alexa Fluor 488 mærket substrat. Kerner blev modfarvet med Hoechst 33352 (blå) B. Immuno-DNA FISH anvendelse af et anti-CENP-A-antistof (grøn) og en HSV-1-genomet Cy3 mærket probe (rød). Antistofferne var post-fast 10min med 1% PFA i PBS, før du kører DNA-fisk. Kerner blev modfarvet med Hoechst 33352 (blå). C. Immuno-RNA-DNA-FISH under anvendelse af en RNA-LAT biotinyleret ribo-probe (blå), et anti-ATRX antistof (grøn) og en HSV-1-genomet Cy3 mærket probe ( rød). LAT-RNA-probe blev påvist under anvendelse tyramid detektion og en blå fluorescensmærket substrat, og anti-ATRX og sekundære antistoffer blev påvist ved tyramid detektion og en grøn fluorescensmærket substrat. Alle billeder blev indsamlet på et bredt felt epifluorescence microscope. Målestokken er 5 um. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne protokol tillader påvisning af HSV-1-latent genom i neuroner i mus neuronale vævssnit. Vores forståelse af de veje, der regulerer viral genekspression er blevet begrænset af manglen på metode til at påvise HSV-1-genomisk DNA in situ i neuronale væv. Oplysninger om genomkopi antallet og andelen af inficerede neuroner kom hovedsageligt fra PCR-analyse på dissocierede neuroner 11,12. At belyse den rolle, vært-cellekerner arkitektur på HSV-1-latens, satte vi at bestemme lokalisering af latent HSV-1-genomet ved hjælp af DNA-FISH i kernen af ​​neuroner i latent inficerede mus. Vi har testet en lang række DNA-FISH protokoller og væv behandlinger og fandt varme-baserede "epitop demaskering" som et vigtigt skridt for virus-DNA-FISH detektion. En sådan behandling er rutinemæssigt anvendes til at afsløre protein epitop i paraffinindstøbte sektioner for immunhistokemi. Selv om det er næsten universelt anvendtei patologi, er det ikke konventionelt anvendes i DNA-FISH. Mens mange undersøgelser støtter, at denne teknik bevarer morfologi vævet ved omfanget af lysmikroskopi, bør slutbrugeren omfatte passende kontrol for at validere dette punkt i sin særlige biologisk system 38.. I vores hænder, var andre demaskering procedurer såsom protease behandlinger ikke tillade HSV-1 DNA-detektion, mens varme-baserede demaskering ved hjælp af forskellige buffere konsekvent gjort HSV-1 latent genomisk DNA til rådighed for FISH-prober (figur 2). Heat-baserede demaskering menes at fjerne en del af de tværbindinger mellem proteiner, hvilket indikerer, at HSV-1-DNA er stramt forbundet til proteiner. Dette er i overensstemmelse med den seneste demonstration af, at HSV-1 latent og lytisk genom er forbundet med cellulære histoner 2,39,40. Fordi genomer fra andre herpesvira er forbundet med histoner: VZV 41. HCMV 42,43; EBV 44-46; KHSV 47-49, protocol beskrevet her kan anvendes til påvisning af genomer af disse herpesvira samt mange andre, men sandsynligvis også til påvisning af andre vedvarende nukleare vira, såsom papillomavirus, hepatitis B-virus og retrovira. Interessant, gjorde brug af den nuværende protokol om forskellige eksperimentelle indstillinger (væv fra inficerede mus og kaniner, sektioner udarbejdet af forskellige laboratorier, samt brugen af ​​forskellige HSV-1-stammer) ikke kræver ekstra set-up til påvisning af HSV-1 genomet. At anvende denne protokol for andre biologiske systemer, forventer vi, at fiksering procedure og antigen hentningsteknikker kunne være områder af den videre udvikling.

Den klassiske fremgangsmåde i evalueringen HSV-1-latens er at påvise tilstedeværelsen af ​​LAT-RNA kombineret med fraværet af detektion af lytisk cyklus genprodukter i neuroner. , Studier baseret på in situ PCR og qPCR på isolerede neuroner fra musemodeller af latens viste imidlertid, at antallet af smittede neuRons (dvs. HSV-1-genomet positive neuroner) var 2:58 gang højere end LAT udtrykke neuroner 12,18. Anvendelse af RNA-DNA-FISH, blev det bekræftet, at 20-30% af HSV-1-DNA-positive neuroner i vores musemodel er også positive for LAT RNA 22. Brugen af ​​DNA-FISH og codetection af viral og cellulær DNA, vil RNA og protein komponenter giver et nyt sæt af værktøjer til at karakterisere de veje, der regulerer HSV-1 latent genekspression. Desuden er HSV-1 latency kendt for at være en heterogen fænomen, som det finder sted i en bred vifte af neuron-undertyper, og det er kendetegnet ved heterogenitet genom kopital og LAT RNA-ekspression 12,22. En stor fordel ved DNA-FISH er at give adgang til enkelt celle analyse inden kompleksiteten af ​​vævet, og dermed at tage hensyn til uensartethed af HSV-1 latency. For eksempel har vi knyttet udtryk for LAT-RNA med den overflod af HSV-1-genomet i individuelle neuroner 22. I annoncebetingelse, kan denne teknik også være gældende for at vurdere status af virale genomer ved hjælp af in vitro cellekultur modeller samt dyremodeller med humane ganglion implanteret i SCID mus 13-17. En fremtidig anvendelse af vores DNA-FISH protokol vil være muligheden for at karakterisere HSV-1 latency gennem antallet af HSV-1-genomet positive neuroner. Dette kan udføres ved anvendelse af biotinylerede prober og tyramid-baseret detektion, som frembringer et signal stærk nok til at blive detekteret ved lav forstørrelse. En sådan ansøgning er muliggjort af den meget lave baggrund genereres af tyramid afsløring system. Cy3 mærket HSV-1-prober, der er beskrevet i denne protokol kan anvendes såvel kræver imidlertid observation ved højere forstørrelse, hvilket ville være meget tidskrævende at læse store antal sektioner.

Måske de vigtigste egenskaber af DNA-FISH protokollen beskrevet her er alsidighed og robusthed, der gør den forenelig med than codetection af både RNA og protein. Faktisk fandt vi, at alle behandlinger, der kræves til at detektere RNA eller protein, eller begge, ikke ændrer kvaliteten og lysstyrken af ​​DNA-FISH signal. RNA-FISH kan udføres før DNA-FISH, enten ved hjælp af ethanol dehydrering eller formamid-baserede præhybridiserings. Vi anbefaler, at ethanol-baseret protokol, hvilket resulterer i mindre baggrund med TSA detektionsreagenser. Formamidet-baseret protokol bør anvendes, når RNA-FISH er efterfulgt af immunfluorescens med antistoffer, der ikke arbejder på ethanol behandlede prøver. Ved udførelse af immuno-DNA-FISH kan kovalent binding af immunofluorescens signal udføres ved tyramid-baseret detektion (som forstærker signalet) eller efter fiksering for at bevare detaljerne i proteinets lokalisering mønster. For at optimere post-fiksering, bør immunfluorescens-protokollen først sættes op for at få et stærkt signal, og den stærkeste post-fiksering procedure sikrer en god DNA-FISH signal bør fastlægges. Denne will giver en række betingelser for, at der kan opnås det bedste kompromis mellem immunfluorescens konservering og DNA-FISH signal. Som for enhver anden antistof-baserede påvisningsmetode, kvaliteten af ​​signalet og de bedste protokol er meget afhængig af selve antistoffet. Vores protokol er ingen undtagelse, og vi har observeret, at nogle antistoffer arbejde meget godt med nogen af ​​protokollen beskrevet her (for eksempel anti-PML mAb klon 36.1) og nogle andre har brug for en betydelig test. Samlet set lykkedes opdaget vi de fleste af vores tilsigtede mål (en undtagelse var SP100 protein), herunder cytoplasmatiske og membranproteiner, og nukleare proteiner forbundet med forskellige nukleare domæner (kromatin-HP1-, centromerer-CENP-A, CENP-B-, PML nukleare organer-PML, Daxx, ATRX-). På baggrund af vores test forventer vi, at vores DNA-FISH-protokol være foreneligt med immuno-codetection reporter konstruktioner (β-galactosidase, fluorescerende proteiner ...), som er almindeligt anvendt til at analysere promoter aktivitet fra virale genomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker N. Sawtell (Cincinnati Children Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, UK) og James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) for at give prøver fra HSV-1 -inficerede mus og kaniner, henholdsvis og reagenser H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) og S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankrig) for nyttige diskussioner.

Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ATIP program til PL, http://www.cnrs.fr), den franske National Research Agency (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), den FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), den LABEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) af Université de Lyon, inden programmet "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007), der drives af ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 og ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), og Inka (EPIPRO programmet http://www.e -cancer.fr ). FC og PL er CNRS forskere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015  
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound SAKURA 4583  
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001  
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5 M EDTA Sigma E6758  
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01  
Salmon sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe  Enzo Life Sciences ENZ-40838  
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000  
20x Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099  
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415  
Dextran sulfate - MW 500,000 Euromedex EU0606-A  
Denhardt's solution (100x) Euromedex 1020-A  
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000  
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104  
T7 in vitro transcription kit Ambion Life Technologies AM1314  
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910  
RNA purification minicolumn Qiagen 73404  
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S  
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000  
Primary antibodies any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen Life Technologies H3570 Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass Electron Microscopy Sciences 72204-04  
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15  
Equipment/Material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310  
Cryostat Leica France CM 1510-1  
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven  
Dry block heater Eppendorf 022670204  
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000  
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512  
Staining glass container Dominique Dutscher 68506  
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Tags

Neuroscience Life Sciences (General) Virology herpes simplex virus (HSV) Latency, Nuklear organisation Gen-ekspression Microscopy
Påvisning af genom og Udskrifter af en Vedvarende DNA-virus i neuronvæv af Fluorescent<i> In situ</i> Hybridization Kombineret med Immunfarvning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, … More

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter