Summary
Vi har etablert et fluorescerende in situ hybridisering protokoll for påvisning av en vedvarende DNA-virus-genomet i vevssnitt fra dyremodeller. Denne protokollen muliggjør å studere infeksjonsprosessen etter codetection av det virale genomet, dets RNA-produkter, og virale eller cellulære proteiner i enkeltceller.
Abstract
Enkel celle codetection av et gen, er dens RNA produkt og cellulære regulatoriske proteiner avgjørende å studere genekspresjon regulering. Dette er en utfordring innen virologi, spesielt for atomreproduserende vedvarende DNA virus som involverer dyremodeller for sin studie. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) etablerer en livslang latent infeksjon i perifere nerveceller. Latent virus fungerer som reservoar, hvorfra det reaktiverer og induserer en ny postherpetisk episode. Den cellebiologi av HSV-1 latens fremdeles dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på fremgangsmåter for å påvise HSV-1 genomet in situ i dyremodeller. Vi beskriver en DNA-fluorescerende in situ hybridisering (FISH) tilnærming effektivt oppdage lav-kopi virale genomer innenfor deler av nevrale vev fra infiserte dyremodeller. Metoden baserer seg på varmebaserte antigen avslørt, og direkte merket hjemmelagde DNA-prober, eller kommersielt tilgjengelige sonder. Vi utviklet en trippel Staining tilnærming som kombinerer DNA-FISH med RNA-FISH og immunfluorescens, ved hjelp av peroksidase basert signalamplifikasjon å imøtekomme hver farging kravet. En stor forbedring er muligheten til å få tak i, i løpet av 10 mikrometer vevssnitt, lav-bakgrunnssignaler som kan avbildes med høy oppløsning ved konfokalmikroskopi og bredt felt konvensjonell epifluorescence. I tillegg er trippel farging arbeidet med et bredt spekter av antistoffer rettet mot cellulære og virale proteiner. Den fullstendige protokollen tar 2,5 dager for å få plass til antistoff og sonden gjennomtrengning i vevet.
Introduction
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) er en vedvarende human neurotropisk virus, å etablere en langtids latent infeksjon i neuroner fra trigeminal ganglia (TG) på det perifere nervesystemet, hvorfra det reaktiverer periodisk for å replikere og spres. HSV-1 genom er en 150 kb dsDNA lokalisering i kjernen av verten nervecellen hvor det fortsatt som multikopiplasmider chromatinized plasmider, som ikke integreres i vertscellen genom 1,2. Under ventetid blir HSV-1 replikasjonssyklus genetisk program sterkt undertrykt, og genekspresjon er begrenset til latens-assosiert transkripsjon (LAT) locus, fra latens etablering til initiering av reaktive 3.. LAT produserer en lang 8,5 kb kodende RNA behandlet i en stor 2 kb stabil lariat, og flere miRNA 4-7. HSV-1 latens er således kjennetegnet ved tilstedeværelse av det virale genom-DNA, LAT RNA og fravær av påvisbare replicative syklusproteiner.
ontent "> Dyremodeller, hovedsakelig mus og kanin, er eksperimentelle modeller rekapitulere flere funksjoner i ventetid i menneskelig. Et av de viktigste interessene til disse modellene er at de tillater å studere fysiologiske aspekter av HSV-1 ventetid hos immunkompetente verter. løpet av de siste tiårene , mange eksperimentelle verktøy, for eksempel genmodifiserte virus og mus, har blitt utviklet for å studere fysiologi, genetikk, og cellebiologi av HSV-1 ventetid, fra animalsk vev. Inntil nå, ble viral genomisk DNA påvist og kvantifisert ved Southern blot og qPCR fra dissosiert TGS. Imidlertid er det for tiden ingen metode tilgjengelig for å detektere HSV-1-genomet ved in situ hybridisering på vevssnitt 8. Følgelig latens rutinemessig vurdert på histologiske snitt gjennom påvisning av LAT RNA av RNA in situ hybridisering fremfor virale genom deteksjon. Fordi det har vært umulig å karakterisere infiserte celler basert på tilstedeværelsen av virale genomer, this teknisk begrensning har vært en stor ulempe for analyse av mange aspekter av den vert-virus vekselvirkninger, slik som forholdet mellom det virale genom og cellulær og viral genekspresjon, eller vertscelle-medierte immunrespons 9,10.Viktigst, celle-til-celle heterogenitet av latent infeksjon er fortsatt relativt uutforsket og har vist seg å være en viktig funksjon i ventetid hos mus og i menneskelige sensoriske ganglion nevroner implantert i SCID mus 11-17. Vanligvis ble det vist ved qPCR at HSV-1-genomet kopitall pr celle varierer fra 5 til flere hundre. Selv LAT vises som en viktig regulator av ventetid og reaktivering, qPCR data på isolerte nerveceller og i situ PCR viste at bare en undergruppe av latent infiserte nevroner, så lavt som 30%, uttrykker LAT locus 11,12,18-21. Slik vertscellen og den cellulære miljø i vevet virkning på viruset latens anleggetviral genuttrykk er fortsatt uklart. Her beskriver vi en robust fluorescerende in situ hybridisering (FISH) metode for effektiv påvisning av lav-kopi HSV-1 genomisk DNA innen dyre nevrale vev seksjoner. Denne metoden har vært utviklet og brukt av oss til å få tilgang til høy oppløsning mikros bildebehandling som er nødvendig for å studere samspillet av viral genom med vertscellen intra-kjernefysiske komponenter 22. I tillegg beskrives en flerfargemetoden for den samtidige påvisning av virus-DNA med RNA og proteiner, som er et unikt verktøy for å beskrive de virus-verts interaksjoner som regulerer viral genekspresjon. Fremgangsmåten kan også anvendes for en lang rekke analyser som krever påvisning av HSV-1-genomet latent, slik som kvantifisere infiserte nevroner i stort antall seksjoner. Et viktig trinn er å anvende antigen gjenfinning behandling for å gjøre det virale DNA tilgjengelig for hybridisering. Dermed kan denne protokollen også være effektivt å påvisningav andre dsDNA virus, som for øyeblikket ikke oppdages ved konvensjonelle DNA-FISH tilnærminger innenfor animalsk vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne metoden ble anvendt i en studie som tidligere 22 publisert. For generell bakgrunn og beskrivelse av konvensjonell manipulasjon på ISH, IF og FISH, foreslår vi følgende tilgjengelig litteratur 23.
En. Animal Infeksjon
Alle prosedyrer som involverer forsøksdyr dannet etiske problemstillinger fra Association for Research in Visjon og Ophthalmology (Arvo) Erklæring for bruk av dyr i forskning, og ble godkjent av den lokale Etisk komité UPR-3296-CNRS, i samsvar med europeiske fellesskap Rådsdirektiv 86/609/EØF. Alle dyr fikk ubegrenset tilgang til mat og vann.
Metoden for mus infeksjon med HSV-1 som er beskrevet nedenfor er blitt brukt i tidligere publiserte studier 24-26.
- Forbered følgende løsninger for å forberede før start:
HSV-1-virus stamløsning
Bedøvelse løsning - Ketamine-100 mg / kg og xylazin-10 mg / kg - Ta opp 1 pl av virus (10 6. pfu) i en 5 pl glassmikrosprøyte forbundet med en mikrosprøyte pumpeinnretning som leverer 0,1 mL / sek. Merk: Resuspender virus lager i en fenolrødt-fritt medium til å vise grensen mellom den røde oljen stede i kapillarrøret og viruset løsningen og for å unngå luftinjeksjon på stedet av virus inokulering.
- Lå bedøvet mus (Ketamin-100 mg / kg og xylazin-10 mg / kg) på ryggen vendt opp.
- Plasser bedøvet mus hode under en kikkert stereo-mikroskop og sett nålen i subepithelial laget av venstre overleppe på mucocutaneous grensen. Injiser virus-løsning i to trinn (to ganger i 0,5 mL) med en hastighet på 0,5 mL per 5 sek Obs. Henseende en 10 sek pausen mellom de to 0,5 pl injeksjoner, for å muliggjøre virussuspensjonen til å absorbere ved injeksjonsstedet.
- Plasser musen ien 37 ° C inkubator inntil oppvåkning.
- La musen i dyre fasiliteter for å gjenopprette for den nødvendige tid. Merk: I mus modell, HSV-1 induserer en primær infeksjon, kalles akutt infeksjon, som varer mindre enn 10 dager på stedet av inokulasjon og innen flere nevrale vev inkludert TGS, overlegen cervical ganglia (SCG), og dorsal root ganglia (DRG), avhengig av vaksinasjonen nettstedet. Tegn på primær infeksjon gradvis forsvinne og ventetid anses fullt etablert ca 28-30 dager etter smitte (dpi) og utover. Nevrale vev kan høstes vanligvis fra fire dpi for studier på akutt infeksjon, og fra 28 dpi for ventetid studier.
2. Mus Perfusjons-fix
- Forbered følgende løsninger før start: 50 ml fysiologisk saltvann buffer
60 ml 1x PBS
150 ml nylaget 4% paraformaldehyde i 1x PBS
60 ml 20% sukrose i 1 x PBS. <br /> - Klargjør perfusjonsslanger: koble nålen til en kapillar, som er forbundet med en peristaltisk pumpe.
- Anesthetize mus som beskrevet ovenfor (SREP 1.2) og legge den på ryggen på en disseksjon skuffen, festet med de fire bena med pins.
- Bruke saks kutte huden fra magen opp til halsen *. Riv bort det tynne vevet lag som dekker organene. Åpne brystkassen ved å kutte ribbeina på den ene siden av brystbenet. Fjern huden ved å rive av. Bevege seg bort fra hverandre på høyre og venstre deler av brystkassen for å avsløre hjertet. Merk: Vær nøye på å incise guts, lunger og store skip (carotis og vena vener), som vil gjøre perfuse-fiksering umulig.
- Sett nålen i venstre ventrikkel *. Incise høyre atrium med saksen. Fortsett med blodtapping ved å injisere 20 ml fysiologisk saltvann i blodkar i hjertet. La blodgjennomstrømningen i skuffen. Neite: Under denne prosedyren, ta hensyn til ikke å punktere gjennom den andre side av hjertet.
- Perfuse med 150 ml 4% PFA i 1x PBS under 15 min * (Advarsel: PFA er giftig, manipulere henhold avtrekkshette). Perfuse 60 ml 20% sukrose i 1 x PBS i 6 min. På dette stadiet musen er klar for TG høsting. Merk: Sett pumpen til 10 ml / min. En god perfusjon er merkbar når musehale stiver opp, løfte opp så falle igjen.
Tre. TG Høsting
- Forbered følgende løsning før start:
20% sukrose i 1x PBS - Kutt hodet på nivået av halsen. Skjær tuppen av nesen rett bak fortennene for å avdekke nesen hulrom. Incise ganen i to med saks og flytte hver side av ganen bort Obs. TGS vises like under ganen, som to hvite og avlange masser av 2-3 mm i lengde ligger på høyre ogvenstre side, og som er koblet til trigeminal nerve.
- Skjær trigeminusnerven grener på hver side av TGS å frigjøre TGS fra hjernestammen. Fjern TGS med kirurgiske tang og holde dem i en 20% sukrose steril løsning for 24 hr. Merk: Bruk to forskjellige mottakere for venstre og høyre TGS, for å unngå forvirring mellom venstre TG (infisert) og retten TG (ikke eller svakt infisert). Inkuber TGS i 20% sukrose i 1x PBS i 24 timer før innebygging.
- Embed TGS i en enkelt blokk i frysesnitt embedding medium og fryse ved -80 ° C.
- Lagre blokker ved -80 ° C til seksjonering.
4. Cryosection Forberedelse
- Skjær TGS lengthways som 10 mikrometer seksjoner på en -20 ° C kryostat, og plassere dem på litt oppvarmet (30 ° C) Superfrost lysbilder. La skivene tørke i 5-10 min så fryse og oppbevar ved -80 ° C inntil bruk. Merknad: Opp til 4-5 seksjoner kan være plasert på en enkelt slide, om stort antall deler som skal behandles på samme tid. Vi fortsetter som følger: serielle seksjoner er avsatt på tre serier av lysbilder merket A1, B1 og C1, og A2, B2, C2 og så videre. Derfor kan hvert bilde-serien (A, B og C) behandles for forskjellig farging (in situ hybridisering, FISH, in situ PCR, LCM), og dataene som oppnås ved hjelp av forskjellige teknikker som kan sammenlignes vite at slides bærer samme antall tilsvarer til den samme region av TG.
5. HSV-1 Probe Labeling
Protokollen beskrevet i det følgende for påvisning av HSV-1-genomet ved DNA FISH har blitt brukt med to typer sonder. Den første er en hjemmelaget Cy3-merket fluorescerende probe som er hensiktsmessig for den fine analyse av kjernefysiske organisasjon innenfor individuelle celler, ved høy forstørrelse fluorescerende mikroskopi. Den andre er en kommersielt tilgjengelig biotinylert probe, noe som kan kombinered med peroksydase-baserte signalforsterkning for å gi en lys-signal. Det sistnevnte er egnet for identifisering og kvantifisering av virus inneholdende neuroner ved lav forstørrelse i hel seksjon, og for analyse av HSV-1 genomet mønstre. Sluttbrukere bør vurdere hvilken tilnærming passer best målet for studiet. Den kommersielt tilgjengelige probe er oppført i reagens-delen, og ved fremstilling av hjemmelaget probe er beskrevet nedenfor.
- Forbered følgende løsninger før du starter:
HSV-1-genomet inneholdende vektorer (se trinn 1)
70% etanol, molekylærbiologi grade. - . Forbered cosmids inneholdende 30 kb deler av HSV-1 genomet (cosmids nummer 14, 28 og 56 som er beskrevet i referanse 20 ved hjelp av rensekolonner dedikert til store vektorer Merk: Annen type bibliotek som inneholder HSV-1 genomet, for eksempel bakterielle kunstige kromosomer bør fungerer like godt så lenge sonden omfatter alarge-delen av HSV-1-genomet for å produsere tilstrekkelig signal 27-29. I våre hender, gjorde sonder laget fra cosmid vektor ryggraden ikke noe signal, og ble brukt som negativ kontroll. Således hele cosmid vektorer som inneholder HSV-1-sekvens ble anvendt i vårt studium. Det er også mulig å skjære ut det HSV-1-sekvens, og bruke den til å fremstille proben.
- . Etikett 2 mikrogram av hver cosmid med Cy3-dCTP bruker en nicktranslasjon kit i henhold til produsentens retningslinjer Merk: Utfør merking med en reaksjonsblanding inneholder kun Cy3-dCTP og ingen umerkede dCTP.
- Stopp reaksjonen ved tilsetning av 3 ul av 0,5 M EDTA i blandingen og oppvarming ved 70 ° C i 10 min. Kule på is.
- Rense sonden på en G50 gel eksklusjon minikolonne. Tilsett 150 ug laksesperm-DNA til sonden og utfelle sonden ved etanolutfelling. DNA-pellet bør være rosa grunn Cy3 inkorporering. Vask pelleten med 70% etanol og fjerne så mye etanolsom mulig med en pipette. Ikke la pellet tørr.
- Løs opp pellet med 100 mL avionisert formamidet (Advarsel: formamide er giftig Manipulere henhold avtrekkshette.). Sonden konsentrasjon kan ikke på en pålitelig måte på dette punktet. De probe mengder som er nevnt i teksten refererer til mengden av templat DNA brukt til å gjøre sonden. Protokollen blir basert på to mikrogram av DNA mal og 100 mL av formamide, er det anses å være 20 ng / mL. Oppbevares ved -20 ° C. Den merkede probe kan fremstilles i store mengder og lagret i frossen tilstand i flere måneder.
6. DNA-FISH
Figur 1 viser en oversikt over de viktigste trinnene i DNA-FISH-protokollen, og hvordan du utfører DNA-FISH som en del av en flere flekker eksperiment for å codetect RNA og protein, som er beskrevet i protokoll 7-9.
- Forbered følgende løsninger før du starter:
0,5% Triton X-100 i 1 x PBS
2x SSC og 0,2 x SSC buffer
100 mM pH 6,0 sitratbuffer (10 x stamløsning) og 10 mM pH 6,0 sitratbuffer (arbeidsløsning)
2x hybridisering buffer (se protokoll 4) - På dag 1, plassere objektglassene på en glassholder ved værelsestemperatur, og lar seksjonene tørke i 10 min. Sirkel seksjoner med en hydrofob penn. Rehydrere seksjonene i 1x PBS i 10 min. Inkuber seksjonene 20 min med 0,5% Triton X-100 i 1 x PBS til permeabilize vev. Vask 3 x 10 min med 2 x SSC, og holde i 2 x SSC til avsløring buffer oppvarmes (se nedenfor).
- For avsløring, forberede en glass-slide skuff (20 glir kapasitet) fylt med 200 ml 10 mM natrium-citratbuffer (pH 6,0). Plasser magasinet i en større beholder fylt med 500 ml destillert vann. Denne innstilling gjør det mulig for en bedre styring av varme pulser. Før du plasserer lysbildene i skuffen, forvarme buffer i mikrobølgeovnen før buffer når koke (rundt 8 minutter ved 800 W).
- Plasser lysbildene i forvarmet citratbufferen holdig skuffen, og kontroller at de er helt dekket med buffer. Varme i ca 20 sek til bufferen når koke. Forsiktig, ikke la bufferen løpet koke, noe som kan skade vev. Kjøl ned ved romtemperatur i 2 min. Gjenta oppvarmingssyklusen 6x (7 varmesykluser totalt) *. Kjøle ned 2 min og overføre lysbilder i 2x SSC for 5min.
Merk *: Dette er en av de mest kritiske trinn. Det optimale antall og varighet av varmesykluser må bestemmes empirisk, og kan variere etter typen av vev eller sondetypen som brukes. Den mikrobølgeovn, skuffen, beholder og volumet av buffer i skuffen, og vannet i beholderen må holdes lik for reproduserbarheten av avslørt. Overdreven koke kunne resultere i vev tap og ødelagte celler. For hver varmepuls, er fremkomsten av koke nøye overvåket, og varmeing bør stoppe på første tegn til koking. Når det er satt opp, vises avsløring robust og reproduserbar. Figur 2A viser at HSV-1-genomet kan bli detektert ved å avsløre med forskjellige buffere, noe som indikerer at avsløre betingelser kan videre utforsket. Citrate-baserte avsløring ble funnet å konsekvent gi god FISH signal, og vev bevaring, med deler fra ulike laboratorie-og dyremodeller. - Inkuber objektglassene i en metanol: eddiksyre: PBS blanding (03:01:04) i 15 min, og deretter i et metanol: eddiksyre blanding (3:1) i 15 minutter (forsiktighet: eddiksyre er etsende manipulere henhold til damp. hette og bruke tilstrekkelig beskyttelse. Forbered denne løsningen rett før bruk).
- Dehydrere snitt gjennom suksessive 10 min inkubering på 70%, deretter 2 x 10 min i 100% etanol. La tørke ved romtemperatur i 10 min. Oppbevares tørt før sondering.
- Klargjør sondering løsning som følger: forberede seg på forhånd en 20 ml lager av 2x hybridiseringsbuffer containing 20% dekstransulfat (MW 500.000), 2 x Denhardts løsning, 4x SSC *. Delmengde løsningen som 500 mL i mikrorør, og oppbevar ved -20 ° C. For en glider (dekkglass på 22 mm x 50 mm), bland 90 ng av HSV-1-Cy3-merkede probe (30 ng probe for hver cosmid), og fylle volumet til 40 ul med formamid. Legg 40 mL av 2x hybridisering buffer. Bland godt med pipettering opp og ned flere ganger.
Note *: For å fremstille 2x hybridiseringsbuffer, blande 4 g MW 500,000 dekstransulfat i 10 ml destillert vann. Det gjør en viskøs blanding som løses opp ved 3-4 timer ved 70 ° C. Bland regelmessig for å bidra til å oppløse. Tilsett 4 ml 20x SSC, 400 mL av 100x Denhardfs løsning. Komplett til 20 ml og bland godt med en vortex. - Drop 80 mL av sondering løsning på de tørkede seksjoner. Dekk med et 22 mm x 50 mm glass dekkglass, og verifisere at sondering løsning sprer seg overhele overflaten av dekkglass. Forsiktig: Det bør ikke være noen bobler. Tilstedeværelse av bobler minsker hybridisering effektivitet. Tett dekkglass ved hjelp av gummi sement, og la det tørke. Oppbevar lysbilder i mørke ved romtemperatur i minst 2 timer for optimal hybridisering signal gjennom objektglasset.
Merk: Gummi sement er praktisk som den tørker raskt, er vanntett, og beskytter prøven fra tørking under hybridisering. Det er også lett å skrelle av for å fjerne dekkglass etter hybridisering. Neglelakk er en alternativ effektiv, men mindre praktisk alternativ. - Fortsett med denaturering ved å plassere objektglassene i en 80 ° C inkubator glide i 5 min. Alternativt kan man legge lysbildene på en metall skuffen og plasser brettet i en 80 ° C vannbad (skuffen bør flyte). Så raskt overføre lysbildene på en metallisk magasin plassert på is. Permisjon for 5 min. Overfør lysbilder ved 37 ° C (lysbilde varmeapparat eller inkubator) for overnatting hybridisering.
Merk: Vi anbefaler ikke kortere hybridisering, noe som resulterer i svak eller ingen signal. - På dag 2 fjernes gummisement med tang, og samtidig opprettholde glide på varmeren for å holde delen ved 37 ° C. Fjern dekkglass forsiktig med tuppen av en skalpell blad.
- Vask 3 ganger med 2 x SSC ved 37 ° C i 5 min, og tre ganger med 0,2 x SSC ved 37 ° C i 5 min. Vask en gang med 2 x SSC ved romtemperatur i 5 min og fortsett med DNA-farging og monterings (se Protocol 10 nedenfor).
Merk: Denne metoden gjør det mulig for påvisning av celle genomisk mål, ved å bruke tilsvarende sonder inn i sondering løsning sammen med HSV-1 spesifikke prober som publiseres for centromeric og pericentromeric sekvenser 22.
7. Dual RNA-DNA FISH
Se figur 1, grønne bokser for en oversikt.
For flerefarging prosedyrer inkludert en RNA-FISH trinn, er det generelt anbefalt å først utføre RNA deteksjon som sådan mål er følsomme for degradering etter RNAse og kjemikalier. I tillegg har DNA-FISH fremgangsmåte omfatter behandling som reduserer effektiviteten av andre farging. For RNA-FISH, vi valgte et enzym basert gjenkjenning tilnærming (tyramide Signal Amplification (TSA) bruker biotinylerte prober og (HRP) kombinert streptavidin). TSA er basert på en fluoriserende tyramide substrat (se reagens tabellen for detaljer), som er kovalent bundet til vevet av en peroksidase enzymatisk reaksjon. Den RNA-FISH signal dermed bevart under DNA-FISH.
- Forbered følgende løsninger før du starter:
Vektor for in vitro transkripsjon av LAT locus (pSLAT-2)
1x PBS som inneholder 2 mM RVC
0,5% Triton X-100 i 1 x PBS inneholdende 2 mM RVC
3% H 2 0 2 i destillert vann.
70%, 80%, 95% ethanol, molekylærbiologi karakter.
4x RNA hybridiserings-oppløsning (se protokoll 4) - Minst en dag før RNA-FISH eksperiment, forberede RNA FISH probe. For å detektere HSV-1 Latency Associated transkripsjon (LAT), forberede et biotinylert ribo-probe fra pSLAT-2 vektor 30, eller en annen vektor for in vitro transkripsjon av LAT locus, som tidligere beskrevet i referanse 26.. Kort: Linear 10 ug pSLAT-2 med Hindlll og rense fordøyd vektor med en DNA-rensing kit. Syntetisere et enkeltstrenget ribo-probe fra 2 pg av fordøyd pSLAT-2 med en T7 in vitro transkripsjon ettet i nærvær av biotin-16-UTP *. Rens sonden med en RNA mini-kolonne og kvantifisere ved 260 nm ved å bruke et spektrofotometer. Fortynn sonden ved 50 ng / mL i DNAse / RNAse fritt vann og oppbevares ved -80 ° C, i små porsjoner for å unngå frost-tine-sykluser.
Merk *: Den biotin-16-UTP: UTP Forholdet må bestemmes empirisk. Vi found et 40:60-forhold til å gi sonder effektivt oppdage LAT av RNA-FISH. - På dag 1, plassere objektglassene på en glassholder ved værelsestemperatur, og lar seksjonene tørke i 10 min. Sirkel seksjoner med en hydrofob penn. Rehydrere seksjonene i 1x PBS som inneholder 2 mM ribonukleosid Vanadyl Complex (RVC) * 10 min. Inkuber seksjoner for 20 min med 0,5% Triton X-100 i 1 x PBS inneholdende 2 mM RVC å permeabilize vev. Vask 3x 10 min med 1x PBS, 2 mM RVC. For å slukke enhver endogen peroksidase-aktivitet, inkuber-delen i 3% H 2 O 2 i 2 x 10 min, og deretter vaske en gang med 1 x PBS, 2 mM RVC.
Merknad *: Gjennom RNA-FISH prosedyre, ribonukleosid vanadyl kompleks (RVC) er lagt til buffere og løsninger for å hindre RNA degradering. - Inkuber 2 x 10 min i 70% etanol. På dette stadium, kan seksjonene være lagret i 70% etanol ved -20 ° C i flere uker. Dehydrere seksjoner ved inkubering i 80%, 95% og 100% ethanol, 5 min hver. La seksjonen tørke i minst 10 min.
NB: I noen tilfeller kan etanol behandlingen være skadelig for deteksjon av andre mål. En alternativ protokollen ved hjelp av en prehybridization skritt i 50% formamide - 2x SSC kan brukes (se nedenfor i protokoll 9 for detaljer om trippel flekker). Imidlertid er etanol behandling den mest allsidige tilnærming for RNA-FISH og gir den laveste bakgrunnen. - Klargjør sondering løsningen som følger: forberede seg på forhånd en 10 ml lager av en 4x RNA hybridiserings-oppløsning inneholdende 8 x SSC, 20 x Denhardfs løsning, 4 mM EDTA, 40% dekstran-*. Delmengde løsningen som 500 mL i mikrorør, og oppbevar ved -20 ° C. For en glideklar 80 ul oppløsning (dekkglass på 22 mm x 50 mm), ved å blande 20 ng biotinylert LAT riboprobe, 40 ng av gjær tRNA, 2 mM RVC, og fullstendig til 20 mL med vann. Tilsett 20 pl av 4x RNA hybridiserings-oppløsningen og 40 ulformamid (50% endelig konsentrasjon). For lettere pipettering og blanding, er det anbefalt å prewarm 4x RNA hybridisering løsning ved 75 ° C. Bland godt med pipettering opp og ned flere ganger.
Note *: For å fremstille 4x RNA hybridisering løsning, bland 4 g av dekstransulfat (MW 500,000) i 3 ml destillert vann, og 4 ml av 20x SSC. Det gjør en viskøs blanding som oppløser ved 3-4 timer ved 70 ° C. Bland regelmessig for å bidra til å løse seg opp. Tilsett 2 ml 100 x Denhardfs løsning, og 80 pl av en 0,5 M EDTA-oppløsning. Fylles til 10 ml med vann, og bland godt ved hjelp av en vortex. FORSIKTIG: Bruk bare RNAse / DNase gratis produkter. - Denaturere sonden 10 min ved 75 ° C. I mellomtiden, plasserer lysbilder på et lysbilde inkubator satt til 65 ° C. Drop 80 mL av probe løsning på seksjonene og raskt plassere en dekk til dråpe. Forsiktig: Det bør ikke være noen boble. Tilstedeværelse av bobler reduserer hybridisering efficiency. Inkubasjon må finne sted i et fuktet kammer ettersom dekk ikke er forseglet. Bruk enten et lysbilde inkubator som kan holde vann (se materialet tabellen), eller forberede en fuktet kammer i en forseglet boks og legg den i en 65 ° C hybridisering ovnen.
- Inkuber over natten ved 65 ° C. Bemerk: LAT RNA-FISH blir utført ved 65 ° C for å forhindre ikke-spesifikk binding av proben, som er observert ved 37 ° C. Mange andre RNA-FISH prober bør resultere i god-signal ved 37 ° C.
- På dag to, før du begynner vasking, forberede påvisningsreagenser i henhold til produsentens instruksjoner av TSA deteksjon kit. Deteksjon er utført med en kommersiell TSA deteksjonssett med et pepperrot-peroxydase (HRP) koblet streptavidin og en grønn eller blå fluorescerende substrat.
- Hold lysbildene på lysbildet varmeapparat på 65 ° C. Fjern forsiktig dekkglass og raskt legge en ml av 50% formamide i 2x SSC, forvarmet ent 65 ° C. Forsiktig, ikke la den delen tørr. Vask to ganger i 10 min ved 65 ° C i 50% formamid i 2 x SSC, og 2 x 10 minutter i 2 x SSC ved 65 ° C. Vask igjen med 2x SSC og plassere lysbildet på en 37 ° C lysbilde varmeapparat.
- Fortsett med deteksjonstrinnet ifølge TSA deteksjonssett produsentens instruksjon. Konsentrasjonen av HRP-streptavidin, må konsentrasjonen av fluorescerende substrat og tiden for reaksjonen bestemmes empirisk *. For LAT RNA deteksjon, vi rutinemessig brukt følgende betingelse: HRP-streptavidin fortynnet til 1/500, fluorescerende reagens på 1/100 for blå fluorescens og 1/500 for grønn fluorescens, og reaksjonstid på 10 min. Signalet kan raskt sjekket med en invertert fluorescerende mikroskop uten montering, før fortsetter med DNA-FISK.
Merknad *: Den amplifikasjonsprotokoll vil være design i henhold til de viktigste målene for forsøket. For eksempel, for å fint lokalisere target RNA, er det advisert for å bruke korte reaksjonstid. I motsetning, for raskt å identifisere og telle-positive celler ved lav forstørrelse, reaksjonstiden kan økes for å generere et lysende signal. - For DNA-FISH, følg prosedyren angitt ovenfor, med start fra avsløre trinn (trinn 6.2).
8. Immuno-DNA FISH
Se figur 1, lilla bokser for en oversikt.
Tilsvar til RNA-DNA-FISH, er det anbefalt å utføre først immunfluorescens, siden DNA-FISH er sannsynlig å denaturere proteiner og hindre deres oppdagelse av antistoffer. Kvaliteten av immunfluorescens-signalet er svært avhengig av de antistoff-egenskaper, og flere antistoff bør testes når det er mulig. Epitop avsløring utføres en gang før immunfluorescens å forbedre både protein deteksjon og DNA-FISH. For å bevare immunfluorescens signal på prøven i løpet av DNA-FISH fremgangsmåten er det nødvendig å covalently koble den til vevet. Vi presenterer her to tilnærminger som leverte gode resultater i våre hender, antistoff post-fiksering og tyramide basert gjenkjenning (se trinn 8.5). Valget bør være drevet av foreløpige tester for hver target / antistoff-par.
- Forbered følgende løsninger før du starter:
1x PBS som inneholder 3% normal geit serum (NGS).
2% PFA i 1x PBS (fortynning fra 4% stamløsning) - På dag 1, de første trinnene er identisk med DNA-FISH, opp til avsløring trinn (trinn 06.01 til 06.02).
- Etter å avsløre, ruge seksjoner med 1x PBS som inneholder 3% NGS for en hr.
- Inkuber med primært antistoff fortynnet i 1 x PBS inneholdende 3% NGS i 24 timer. Lavere inkubasjonstid kan brukes for å forkorte protokollen, selv om vi har funnet at en inkubasjon over natten vanligvis resulterer i et sterkere signal. Opp til 48 til 72 timers inkubasjon kan være nødvendig for lav affinitet primære antistoffer slik som IgM.
- På dag2, vaske 3x 10 min med 1x PBS.
- Protokoll med antistoff etterfiksering: inkuber 1 time med det sekundære antistoff koblet med en grønn fluorescerende fargestoff, ved 1/200 i 1 x PBS inneholdende 3% NGS. Vask tre ganger 10 min med 1x PBS. Post-fiksering er utført med 2% PFA i 1x PBS i 10 min *. Vask 3x 10 min med 1x PBS.
Protokoll med TSA deteksjon: inkuber 1 time med HRP-koblet sekundært antistoff ved 1/250 i 1 x PBS inneholdende 3% NGS. Vask tre ganger 10 min med 1x PBS. Fortsett med tyramide påvisning i henhold til produsentens instruksjoner. Som angitt ovenfor (trinn 7.9), reagens fortynning og reaksjonstiden må bestemmes empirisk. I de fleste tilfeller, har vår protokollen er basert på et 1/500 fortynning av det fluorescerende substrat og 10 min reaksjonstid. Vask 3x 10 min med 1x PBS.
Merknad *: Post-fiksering er et kritisk punkt i immuno-FISH, og krever nøye set-up. Jo sterkere post-fiksering påbedre er IF-signalet, og jo lavere DNA-FISH effektivitet. - Fortsett med DNA-FISH fra metanol-eddiksyre trinn (trinn 6.3). Varigheten av immuno-DNA-FISH er typisk 3 dager, med det første antistoff inkubert over natten.
9. Dual DNA-RNA FISH Sammen med Immunfluorescens
Se figur 1, oransje bokser for en oversikt.
RNA-FISH utføres først, etterfulgt av immunfluorescens, og til slutt DNA-FISH. Hvis immunfluorescens detekteres av tyramide reaksjon, er det tasten for å slukke fullstendig HRP-aktivitet fra det RNA-FISH trinn med H2O 2, og for å verifisere at bråkjøling er effektiv. Dette gjøres ved hjelp av en sklie som en "no primære antistoff" kontroll.
Fordi etanolbasert dehydrering er skadelig for noen løsningsmiddelsensitive proteiner, kan dette trinn av RNA-FISH inhibere immunfluorescens. Hvis så, kan RNA-FISH utføres with en alternativ protokoll, som beskrevet nedenfor i stpe 9.3.
- Forbered følgende løsning før start:
50% formamide i 1x PBS som inneholder 2 mM RVC - På dag 1, forberede RNA-FISH probe og fortsett som for dual RNA-FISH, opp til H 2 O 2 bråkjølingstrinn (trinn 7.2).
- Sak 1, den immunfluorescens farging fungerer etter etanol dehydrering: fortsett med RNA-FISH som angitt ovenfor i trinn 07.03 til 07.09. Deretter videre til trinn 9.6 nedenfor.
- Tilfelle 2 er immunfluorescens farging forhindret av etanol behandling: Plasser de glir i et fuktet kammer på et lysbilde varmer satt til 65 ° C og inkuberes i 1,5 timer i en prehybridiseringsløsningen inneholdende 50% formamid, 1 x PBS, og 2 mM RVC. Drain prehybridiseringsløsningen og slippe 80 pl av hybridiserings-oppløsningen som beskrevet i trinn 7.4 og 7.5. Fortsett deretter med RNA-FISH hybridisering og påvisning som angitt above i trinn 07.06 til 07.09 (dag 2 og 3).
- På dag to, etter RNA-FISH er ferdig, fortsett med immuno-DNA-FISH starter med avsløring trinn (se trinn 6.2). Følg så immun-DNA-FISH protokoll som angitt ovenfor i trinn 08.02 til 08.06.
10. Bilde Montering og bildebehandling
- Forbered følgende løsning før start:
Hoechst 33342 på 0,5 mikrogram / ml i 1x PBS - Stain atomkjerner for 10 min med DAPI eller Hoechst 33342 * 0.5 mikrogram / ml i 1x PBS for 10 min. Vask 3x 10 min med 1x PBS.
Note *:. Forsiktig Hvis én av deteksjonssystemer bruker en fluorescerende blått fargestoff, ikke bruk DAPI eller Hoechst. I stedet bruker en fluorescerende DNA fargestoffer med en emisjonsspektra i langt-rød bølgelengde som Topro3. - Renne så mye væske som mulig fra raset. Drop 80 mL av montering medium som inneholder en antifading agent på den ene enden av raset. Dekk seksjoner med høy optisk kvalitetdekkglass (n ° 1,5 glass). La dekkglass går langsomt ned ved å opprettholde det ved en ende med tang, for å gi feste medium fordelt over seksjonen uten bobler.
- Forsegle med neglelakk og oppbevar ved 4 ° C i en mørk lysbilde boks.
- Direkte observasjon av DNA-FISH signal av latent HSV-1 genomet krever en 40X eller høyere forstørrelse oljeneddyppingsobjektivet, med høy numerisk apertur (for eksempel 40X NA 1,1, 60X-63X NA 1,4, 100X NA 1,3) og et eksiteringslys kilde i det minste ekvivalent med en 100 W kvikksølvlampe. Vi anbefaler å bruke en høy effektivitet overføring mikroskop slik som de som tilbys av produsentene i de siste 5 årene (se tabell av utstyr). Konfokalmikroskopi gir verktøy for å samle inn bilder med lavere bakgrunn på grunn av auto-fluorescens av vevet, for eksempel tynn seksjonering eller spektral avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter flere måneder med omfattende testing, oppdaget vi at varmebaserte kjemiske avsløring gjort latent HSV-1 genom tilgjengelig for fluorescerende in situ hybridisering. I løpet av prosessen, prøvde vi ulike avsløre prosedyrer, og bare varme-baserte behandlinger (dvs. varme delene opp til sub-koketemperatur i en mikrobølgeovn) dukket effektiv. Vi testet flere saltbuffere som rutinemessig brukes i immunhistokjemi (IHC) og elektronmikroskopi for å hente epitoper 31,32, inkludert 0,01 M pH 6,0 citratbuffer (som vi brukt i alle våre studier), 1 x PBS, 1 mM EDTA, 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 og destillert vann. Mens EDTA buffere tendens til å skade vev, alle andre buffere var egnet til HSV-1 deteksjon, som vises som én eller flere flekker i kjernen av nerveceller (Figur 2A, merk at disse vev er svært auto-fluorescerende, som vises i noen bilder som et homogent signal i cytopLASM). I våre hender, sitratbuffer syntes å stadig gi et godt signal uten å skade vev og dermed ble valgt for vår rutine protokollen.
Bruk av direkte merket Cy3-DNA-prober (fremstilt av deler av HSV-1-genomet klonet i cosmids) gir robuste og reproduserbare resultater. Men, det krever å ha tilgang til HSV-1 genom biblioteker. Dermed har vi verifisert at vår protokoll ville fungere for alle som har tilgang kun til kommersielle prober. Figur 2B viser HSV-1 latent genom påvisning av DNA-FISH ved hjelp av en pan-HSV-1 biotinvlerte sonde hentet fra Enzo Biochem. Langs disse linjene, vi testet om DNA-FISH-protokollen kan potensielt brukes av forskere ved hjelp av andre HSV-1 dyremodeller. Figur 3A illustrerer påvisning av HSV-1 genom på prøver fra mus og kanin, infisert med tre brukte stammer, SC16, 17syn + og McKrae, enten akutt eller latent stadium av infeksjon, innenfor deler av trigeminal ganglia. I alle tilfeller HSV-1 genomet viser som en ustabil signal, lysstyrke og intensitet som varierer fra celle til celle. Endelig vi utvidet anvendelse av vårt protokoll til replikative syklus av HSV-1, ved å utføre DNA-FISH på vev fra mus som gjennomgår en generell herpes infeksjon. I disse dyrene store og lyse aggregater av HSV-1-genomet kan bli detektert i forskjellige vev, inkludert hjerne, ryggmarg, øyne og dorsal root ganglia (figur 3B).
Mange aspekter av HSV-1 latency er fremdeles dårlig forstått, for eksempel hvordan HSV-1 genuttrykk reguleres gjennom interaksjon med atom arkitektur 33-35, om en bestemt undergruppe av nevroner er foretrukket vertscelle for ventetid etablering og reaktive 13 , 14,36,37, eller hvordan immun overvåking foregår innenfor gangliene etter virus belastning eller virus genuttrykk 9,10. Protokollen er beskrevet her vil bidra til å takle disse spørsmålene, ettercodetection av HSV-1-genomet og virale eller cellulære RNA og proteiner. Figur 4 illustrerer codetection av HSV-1-genomet sammen med HSV-1 LAT RNA (figurene 4A og 4C), med cellulære proteiner som centromeric protein CENP-A (figur 4B, IF fulgt av PFA etterfiksering), eller kromatin og PML-NB assosiert protein ATRX (figur 4C, IF fulgt av TSA basert deteksjon). Figur 4C viser data fra en trippel farging eksperiment viser HSV-1 DNA ( red), dets RNA produkt LAT (blå) og en kandidat regulatorisk protein, ATRX (grønn). En kombinasjon av et DNA-FISH-protokollen og direkte eller enzym basert deteksjon av RNA-FISH og immunfluorescens-signal representerer en allsidig og vidt anvendbar sett av verktøy for å utforske in situ virus-verts forhold til celle-og vev-nivå.
Figur 1. Oversikt over DNA-FISH-protokollen og integrering i flere mål farging. De viktigste trinn i DNA-FISH-protokollen, og forbindelsen med protokollene for codetection av RNA og proteiner er skjematisk representert. Kritiske trinnene er angitt med faresignaler. DNA-FISH hovedtrinn er rehydrering, permeabilization, avsløring, metanol-eddiksyre behandling og hybridisering. Innenfor prosedyren, er avslørt et kritisk punkt, som må være nøye satt opp og respektert. De to andre kritiske trinn er avhengig av hvilke tekniske framgangsmåter er kompatible med de antistoffer som brukes for immuno-deteksjons. Disse vil påvirke RNA-FISH prosedyre for trippel flekker, og på påvisning strategi immunfluorescens. Cslikke her for å se større bilde.
Figur 2. Påvisning av HSV-1-genomet latent etter antigen avslørt. A. TG seksjoner fra 28 ppt infiserte mus ble fremstilt som angitt i protokollinformasjonen. TG snitt ble bearbeidet for DNA-FISH som indikert i Figur 1, og den varme-baserte avsløring ble utføre ved hjelp av buffer er angitt på toppen av hvert bilde. Omrisset av kjernen er avbildet som en stiplet linje. Signalet observert i cytoplasma skyldes auto-fluorescens av vevet. B. TG seksjoner fremstilt som i A. ble behandlet for DNA-FISH ved hjelp av en kommersielt innhentet biotinylated HSV-1 sonde. Den hybridiserte sonde ble oppdaget ved hjelp av TSA og en Alexa Fluor merket substrate (grønn). Atomkjerner ble kontra med Hoechst 33352 (blå). En forstørret beskårede bildet vises i høyre kolonne. To typer av HSV-1 genom mønster er vist for å illustrere en typisk HSV-1 intranuclear lokalisering. Alle bildene ble samlet på et bredt felt epifluorescence mikroskop. Scale bar er 5 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Påvisning av HSV-1-genomet i flere modeller. A. Standarden DNA-FISH protokollen ble brukt på TG seksjoner fra forskjellig opprinnelse. SC16 infiserte mus TG seksjoner ble fremstilt som beskrevet i protokollen delen. 17syn + infiserte mus seksjoner og McKrae infiserte kanin delene ble levert av collaborators. Bildene ble samlet på et bredt felt epifluorescence mikroskop. Scale bar er 5 mikrometer. B. SC16 infiserte mus som gjennomgår en generell herpes infeksjon ble ofret på seks dpi og flere vev ble samlet inn, frosset og delt. Standard DNA-FISH protokoll ble anvendt som vist i figur 1. Bildene ble samlet på et bredt felt epifluorescence mikroskop. Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Codetection av HSV-1 genomisk DNA og RNA og proteiner på enkeltseksjoner. SC16 infiserte mus TG seksjoner ble behandlet for RNA-DNA FISH, immun-DNA FISH eller trippel staining som vist i figur 1.. A. RNA-DNA FISH ved hjelp av en HSV-1-genomet Cy3 merket probe (rød) og en RNA-LAT biotinylert ribo-probe (grønn). LAT RNA probe ble oppdaget ved hjelp av TSA og en Alexa Fluor 488 merket substrat. Atomkjerner ble kontra med Hoechst 33352 (blå) B. Immuno-DNA FISH ved hjelp av en anti-CENP-A antistoff (grønn) og en HSV-1 genom Cy3 merket probe (rød). Antistoffene var etter fast 10min med 1% PFA i PBS før du kjører DNA-FISH. Nuclei ble kontra med Hoechst 33352 (blå). C. Immuno-RNA-DNA-fisk ved hjelp av en RNA-LAT biotinylert ribo-probe (blå), et anti-ATRX antistoff (grønn) og en HSV-1-genomet Cy3 merket probe ( red). LAT RNA probe ble oppdaget ved hjelp av tyramide deteksjon og en blå fluorescensmerkede underlaget, og den anti-ATRX og sekundære antistoffer ble oppdaget av tyramide deteksjon og en grønn fluorescensmerkede underlaget. Alle bildene ble samlet på et bredt felt epifluorescence microscope. Scale bar er 5 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokoll som er beskrevet her gjør det mulig for påvisning av HSV-1-genomet latent i nevroner i mus neuronal vevssnitt. Forståelsen av banene som regulerer viral genekspresjon har vært begrenset av den manglende metode for å detektere HSV-1 genomisk DNA in situ i neuronale vev. Informasjon om genomet kopi antall og andel av infiserte nevroner kom hovedsakelig fra PCR-analyse på dissosiert nevroner 11,12. I belyse rollen vertscellekjernearkitektur på HSV-1 latency, satt vi til å bestemme lokalisering av latent HSV-1 genom ved DNA-FISH, i kjernen av nevroner av latent infiserte mus. Vi har testet en rekke forskjellige DNA-FISH protokoller og vevs-behandlinger, og fant varme-baserte "epitop avsløring" som et vesentlig trinn i virus-DNA-FISH deteksjon. Slik behandling er rutinemessig brukt til å avsløre protein epitope innen parafininnebygde seksjoner for immunhistokjemi. Selv om det er nesten universelt brukti patologi, er det ikke vanligvis anvendes i DNA-FISK. Mens mange studier støtter at denne teknikken bevarer morfologi av vevet på omfanget av lysmikroskopi, bør sluttbrukeren inkluderer nødvendige kontroller for å validere dette punktet i sin spesielle biologiske system 38. I våre hender, gjorde andre avsløring prosedyrer som protease behandlinger ikke tillate HSV-1 DNA deteksjon, mens varme-baserte avslørt ved hjelp av ulike buffere konsekvent gjort HSV-1 latent genomisk DNA tilgjengelig for FISH-prober (figur 2). Varme basert avsløring er tenkt å eliminere en del av de kryssbindinger mellom proteiner, noe som indikerer at HSV-1 DNA er tett knyttet til proteiner. Dette er i samsvar med den siste demonstrasjonen som HSV-1 latent og lytisk genom er assosiert med mobilnettet histoner 2,39,40. Fordi genomene til andre herpesviruses er assosiert med histoner: VZV 41; HCMV 42,43, EBV 44-46; KHSV 47-49, protocol beskrevet her kan bli anvendt for å detektere genomene til disse herpesvirus, så vel som mange andre, men sannsynligvis også til å detektere andre vedvarende atom virus som papillomaviruser, hepatitt B virus, samt retrovirus. Interessant, gjorde bruk av den aktuelle protokoll på forskjellige eksperimentelle innstillinger (vev fra infiserte mus og kaniner, seksjoner som er laget av forskjellige laboratorier, og bruk av forskjellige HSV-1 stammene) ikke kreve ytterligere oppsett for påvisning av HSV-1-genomet. Hvis du vil bruke protokollen til andre biologiske systemer, forventer vi at fiksering prosedyre og antigen henteteknikker kan være områder for videre utvikling.
Den klassiske metode i å evaluere HSV-1 latens er å oppdage tilstedeværelsen av LAT RNA kombinert med fravær av deteksjon av lytiske syklus genprodukter i nerveceller. Men studier basert på in situ PCR og qPCR på isolerte nerveceller fra musemodeller av latens indikerte at antallet infiserte neurons (dvs. HSV-1 genom positive nevroner) var 2:58 gang høyere enn LAT uttrykke nevroner 12,18. Ved hjelp av RNA-DNA-FISH, ble det bekreftet at i vår mus modell 20-30% av HSV-1 DNA positive nevroner er også positivt for LAT RNA 22. Bruk av DNA-FISH og codetection av viral og cellulær DNA, vil RNA og protein komponentene gir et nytt sett med verktøy for å karakterisere trasé som regulerer HSV-1 latent genuttrykk. I tillegg er HSV-1 latens kjent for å være en heterogen fenomen slik det foregår i et bredt utvalg av neuron undertyper, og det er karakterisert ved heterogenitet i genomkopitall, og i LAT RNA ekspresjon 12,22. En stor fordel med DNA-FISH er å tilveiebringe tilgang til enkeltcelle-analyse innenfor den kompleksitet av vevet, og således ta hensyn til heterogeniteten av HSV-1 latens. For eksempel har vi knyttet uttrykk for LAT RNA med overflod av HSV-1 genom i enkelte nerveceller 22. I annonsendition, kan denne teknikken også være aktuelt å vurdere status av virale genomer bruker in vitro cellekultur modeller samt dyremodeller utnytte menneskelig ganglion implantert i SCID mus 13-17. En fremtidig anvendelse av vårt DNA-FISH-protokoll vil være mulighet for å karakterisere HSV-1 latens gjennom antallet HSV-1 genomet positive neuroner. Dette kan utføres ved bruk av biotinylerte prober og tyramide basert registrering, som frembringer et signal som er sterkt nok til å bli detektert ved lav forstørrelse. En slik anvendelse er muliggjort ved den meget lave bakgrunn generert av tyramide deteksjonssystemet. Den Cy3 merket HSV-1-prober som er beskrevet i denne protokollen kan brukes i tillegg imidlertid krever observasjon ved høyere forstørrelse, noe som ville være meget tidkrevende å lese stort antall seksjoner.
Kanskje de store kvaliteter av DNA-FISH protokollen beskrevet her er allsidighet og robusthet, noe som gjør den kompatibel med tHan codetection av både RNA-og protein. Faktisk har vi funnet at alle behandlinger som kreves for å påvise RNA eller protein, eller begge deler, ikke endrer kvaliteten og lysstyrken til DNA-FISH signal. RNA-FISH kan utføres før DNA-FISH, enten ved hjelp av etanol dehydrering eller formamide basert prehybridization. Det anbefales etanol-basert protokoll, noe som resulterer i mindre bakgrunn med TSA påvisningsreagenser. Den formamide-basert protokoll bør brukes når RNA-FISH følges av immunfluorescens med antistoffer som ikke fungerer på etanol behandlet prøvene. Ved utføring av immuno-DNA-fisk, kan kovalent binding av immunfluorescens-signalet utføres av tyramide basert registrering (som forsterker signalet), eller ved etterfiksering for å bevare detaljene i protein lokaliseringsmønster. For å optimalisere post-fiksering, bør det immunfluorescens protokollen først bli satt opp for å få et sterkt signal, og den sterkeste post-fiksering prosedyre som tillater god DNA-FISH signal bør bestemmes. Dette will gi en rekke forhold innenfor som kan fås det beste kompromisset mellom immunfluorescens bevaring og DNA-FISH signal. Som for alle andre antistoff-baserte påvisningsmetoden, kvaliteten på signalet, og de beste protokollen svært avhengig av antistoffet i seg selv. Vår protokoll er intet unntak, og vi har observert at enkelte antistoffer fungerer veldig bra med noen av protokollen beskrevet her (for eksempel anti-PML MAB klone 36,1) og noen andre trenger betydelig testing. Samlet, vi hell oppdaget de fleste av våre tiltenkte målet (et unntak var SP100 protein), inkludert cytoplasmatiske og membran proteiner, og kjernefysiske proteiner assosiert med ulike kjernefysiske domener (kromatin-HP1-, sentromerer-CENP-A, CENP-B-, PML kjernefysiske kropper-PML, Daxx, ATRX-). På grunnlag av vår testing forventer vi at vårt DNA-FISH protokollen være kompatibel med immuno-codetection av reporter konstruerer (β-galaktosidase, fluorescerende proteiner ...) som ofte brukes til å analysere promoter aktivitet fra virale genomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker N. Sawtell (Cincinnati Children Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, UK) og James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) for å gi eksempler fra HSV-1 -infiserte mus og kaniner, henholdsvis, og for reagenser, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) og S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankrike) for nyttige diskusjoner.
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ATIP program, til PL, http://www.cnrs.fr), den franske National Research Agency (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), den FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), den LABEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) av Université de Lyon, i programmet "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) drives av ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 og ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), og Inca (EPIPRO program, http://www.e -cancer.fr ). FC og PL er CNRS forskere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
References
- Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
- Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
- Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
- Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
- Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
- Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
- Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
- Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
- Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
- Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
- Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
- Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
- Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
- Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
- Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
- Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
- Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
- Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
- Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
- Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
- Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
- Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
- Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
- Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
- Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
- Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
- Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
- Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
- Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
- Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
- Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
- Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
- Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
- Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
- Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
- Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
- Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
- Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
- Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
- Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
- Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
- Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).
