Summary
Vi etablerade en fluorescent in situ hybridisering protokoll för detektion av en ihållande DNA-virusgenom i vävnadssnitt från djurmodeller. Detta protokoll möjliggör att studera infektionsprocessen genom codetection av det virala genomet, dess RNA-produkter, och virala eller cellulära proteiner i enstaka celler.
Abstract
Single cell codetection av en gen, är dess RNA-produkt och cellulära regulatoriska proteiner kritiska för att studera genuttryck reglering. Detta är en utmaning inom virologi, särskilt för kärnrepliker ihållande DNA-virus som involverar djurmodeller för deras studie. Herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) fastställs en livslång latent infektion i perifera nervceller. Latent virus fungerar som reservoar, från vilken den reaktiverar och framkallar en ny herpetic episod. Den cellbiologi av HSV-1 latens fortfarande dåligt kända, delvis på grund av att det saknas metoder för att påvisa HSV-1-genom in situ i djurmodeller. Vi beskriver en DNA-fluorescent in situ hybridisering (FISH) tillvägagångssätt effektivt upptäcka låg-kopierings virala genom inom delar av neuronala vävnader från infekterade djurmodeller. Metoden bygger på värmebaserad antigen avslöjande, och direkt märkta hemgjorda DNA-prober, eller kommersiellt tillgängliga sonder. Vi utvecklade en trippel staining metod som kombinerar DNA-FISH med RNA-FISH och immunofluorescens, med hjälp av peroxidas baserad signalförstärkning för att tillgodose varje färgningsbehov. En stor förbättring är möjligheten att få, inom 10 um vävnadssnitt, låg-bakgrundssignaler som kan avbildas med hög upplösning genom konfokalmikroskopi och brett fält konventionell epifluorescence. Dessutom fungerade trippelfärgning med ett brett spektrum av antikroppar riktade mot cellulära och virala proteiner. Det kompletta protokollet tar 2,5 dagar att rymma antikropp och sond penetration i vävnaden.
Introduction
Herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) är en ihållande mänsklig neurotrop virus, upprättande av en långsiktig latent infektion i nervceller i trigeminala ganglier (TG) i det perifera nervsystemet, från vilket det aktiverar jämna mellanrum för att replikera och spridning. HSV-1-genomet är en 150 kb dsDNA Lokalisera i kärnan av den mottagande neuron där det förblir så multikopie chromatinized plasmider, som inte integreras i värdcellsgenomet 1,2. Under latens är HSV-1 replikativa cykeln genetiska programmet starkt undertryckt, och genuttryck begränsas till den latens-associerad transkript (LAT)-lokuset, från latens anläggning till initiering av reaktive 3. LAT producerar en lång 8,5 kb icke-kodande RNA bearbetas till en stor 2 kb stabil lariat, och flera miRNA 4-7. HSV-1 latens är således kännetecknas av närvaron av det virala genom-DNA, LAT-RNA, och frånvaro av detekterbara replikativa cykelproteiner.
ontent "> Djurmodeller, främst mus och kanin, är experimentella modeller rekapitulera flera funktioner i latens i människa. En av de viktigaste intressena för dessa modeller är att de tillåter att studera fysiologiska aspekter av HSV-1 latens i immunkompetenta värdar. Under de senaste decennierna , många experimentella verktyg, såsom genetiskt modifierade virus och möss, har utvecklats för att studera fysiologi, genetik och cellbiologi av HSV-1 latens, från djurvävnader. Hittills har virala genom-DNA detekteras och kvantifieras genom Southern blöt och qPCR från dissocierade TGs. Det finns dock för närvarande ingen metod tillgänglig för att påvisa HSV-1-genomet med in situ hybridisering på vävnadssnitt 8. Följaktligen latens rutinmässigt bedömts histologiska sektioner genom detektering av LAT RNA av RNA in situ hybridisering snarare än virusgenom upptäckt. Eftersom det har varit omöjligt att karakterisera infekterade celler baserat på förekomst av virusgenom, this teknisk begränsning har varit en stor nackdel för analysen av många aspekter av värd-virusinteraktioner, såsom förhållandet mellan det virala genomet och cellulär och viral genuttryck eller värdcellförmedlade immunsvar 9,10.Viktigast cell-till-cell heterogenitet av latent infektion är relativt outforskat och har visat sig vara en viktig del av latens i möss och i mänskliga sensoriska ganglieneuroner implanteras i SCID-möss 11-17. Typiskt visades det genom qPCR att HSV-1-genomet kopietal per cell varierar från 5 till flera hundra. Även LAT visas som en viktig regulator av latens och reaktivering, qPCR uppgifter om isolerade nervceller och in situ-PCR visade att endast en delmängd av latent infekterade nervceller, så lite som 30%, uttrycker LAT locus 11,12,18-21. Hur värdcellen och den cellulära miljön inuti vävnaden påverkar viruset latens upprättande ochviral genuttryck är fortfarande oklart. Här beskriver vi ett robust fluorescent in situ hybridisering (FISH) metod för effektiv detektion av låg-kopia HSV-1 iskt DNA inom djur neuronala vävnadssnitt. Denna metod har utformats och används av oss för att få tillgång till hög upplösning mikroskopi avbildning som är nödvändig för att studera interaktionen av det virala genomet med värdcell inom nukleära komponenter 22. Dessutom beskriver vi ett flertal färgningsmetod för samtidig detektion av det virala DNA: t med RNA och proteiner, vilket är ett unikt verktyg för att beskriva virus-värd interaktioner som reglerar viral genexpression. Metoden kan också användas för ett brett spektrum av analyser som kräver detektion av HSV-1 latenta genomet, till exempel kvantifiera smittade nervceller i stort antal avsnitt. Ett viktigt steg är att applicera antigenåtervinning behandling för att göra den virala DNA tillgängliga för hybridisering. Således kan detta protokoll också vara effektivt för att upptäckaav andra dsDNA virus, som för närvarande inte upptäckas med konventionella DNA-FISH metoder inom djurvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna metod användes i en studie som tidigare 22 publicerats. Allmän bakgrund och beskrivning av konventionell manipulation på ISH, IF-och FISH, föreslår vi följande tillgänglig litteratur 23.
1. Animal Infektion
Alla förfaranden som involverar försöksdjur inordna sig till etiska frågor från Föreningen för forskning i Vision och Oftalmologi (ARVO) uttalande om att använda djur i forskningen, och har godkänts av den lokala etiska kommittén i UPR-3296-CNRS, i enlighet med EG- Rådets direktiv 86/609/EEG. Alla djur fick obegränsad tillgång till mat och vatten.
Förfarande enligt mus infektion med HSV-1 som beskrivs nedan har använts i studier som tidigare publicerats 24-26.
- Bered följande lösningar för att förbereda innan start:
HSV-1-virus-stamlösning
Anesthetizing lösning - Ketamine-100 mg / kg och Xylazine-10 mg / kg - Ta upp 1 l av virus (10 6 PFU) i en 5 l glasmikro kopplad till en mikropumpenhet som levererar 0,1 l / sek OBS:. Resuspendera viruset lager i en fenolrött-fritt medium för att se gränsen mellan den röda oljan presenterar i kapillären och viruslösningen och för att undvika luftinsprutning vid stället för virusinympning.
- Lay sövd mus (Ketamin-100 mg / kg och Xylazine-10 mg / kg) på sin baksida vänd uppåt.
- Placera sövda mus huvudet under ett binokulärt stereomikroskop och för in nålen i subepitelial lagret av vänstra överläppen på mukokutan gränsen. Injicera viruslösningen i två steg (två gånger 0,5 | il) med en hastighet av 0,5 pl per 5 sek Anm. Respekterar en 10 sekunders paus mellan de två 0,5 ^ il injektioner, för att möjliggöra den virala suspensionen att absorbera vid stället för injektion.
- Placera musen påen 37 ° C inkubator tills just har vaknat.
- Låt musen i djuranläggningar för att återhämta sig efter önskad tid. Anm: I den musmodell, HSV-1 inducerar en primär infektion, kallas akut infektion, som varar mindre än 10 dagar på platsen för ympning och inom flera neuronala vävnader inklusive TG, överlägsen livmoderhalscancer ganglierna (SCG), och dorsalrotsganglier (DRG) beroende på inokulationsstället. Tecken på primärinfektion gradvis försvinna och latens anses helt etablerad ca 28-30 dagar efter infektion (dpi) och framåt. Neuronala vävnader kan skördas vanligen från 4 dpi för studier av akut infektion, och från 28 dpi till latens studier.
2. Mus Perfusion-fix
- Förbered följande lösningar innan du börjar: 50 ml fysiologisk koksaltbuffert
60 ml 1x PBS
150 ml av nyberedd 4% paraformaldehyd i 1x PBS
60 ml av 20% sackaros i 1 x PBS. <br /> - Förbered perfusionsslangen: ansluta nålen till en kapillär, som är ansluten till en peristaltisk pump.
- Bedöva musen som beskrivs ovan (SREP 1.2) och lägg den på rygg på en dissektion bricka, fäst med de fyra benen med stift.
- Använda sax klippa huden från magen upp till halsen *. Riv bort det tunna vävnadsskikt som täcker organen. Öppna bröstkorgen genom att skära revbenen på ena sidan av bröstbenet. Ta bort huden genom att riva av. Flytta bort från varandra höger och vänster delar av bröstkorgen att avslöja hjärtat Anm. Var uppmärksam att inte incisionsfilm tarmar, lungor och stora fartyg (carotid artärer och jugularvenerna), som kommer att göra GJUTA-fixering omöjligt.
- Stick in nålen i vänster kammare *. Incise högra förmaket med en sax. Fortsätt med blodtappning genom att injicera 20 ml fysiologisk koksaltlösning i blodkärlen genom hjärtat. Låt blodflödet i facket. Nejte: Under denna procedur, uppmärksamma att inte punktera genom den andra sidan av hjärtat.
- BEGJUTA med 150 ml 4% PFA i 1x PBS under 15 min * (Varning: PFA är giftigt, manipulera i dragskåp). BEGJUTA 60 ml av 20% sackaros i 1 x PBS under 6 min. I det skedet musen är klar för TG skörd. Obs: Ställ in pumpen till 10 ml / min. En bra perfusion märks när musen svansen stelnar upp, lyft upp sedan sjunka igen.
3. TG Skörd
- Bered följande lösning före start:
20% sackaros i 1 x PBS - Skär huvudet på nivån för halsen. Skär spetsen på näsan precis bakom framtänderna för att avslöja näsan hålighet. Incisionsfilm gommen i två med sax och flytta bort varje sida av gommen Anm. TGS visas precis under gommen, som två vita och avlånga massor av 2-3 mm i längd som ligger till höger ochvänster sida och ansluten till trigeminusnerven.
- Skär trigeminalnerven grenar på varje sida av TGs att frigöra TGs från hjärnstammen. Ta av TG med kirurgiska tänger och förvara dem på en 20% sackaros steril lösning i 24 timmar. Notera: Använd två olika mottagare för vänster och höger TGs, för att undvika förväxling mellan vänster TG (infekterade) och rätten TG (ej eller svagt infekterade). Inkubera TGs i 20% sackaros i 1x PBS under 24 h före inbäddning.
- Bädda TG i ett enda block i kryosektionering inbäddningsmedium och frysa vid -80 ° C.
- Store blocken vid -80 ° C fram till snittning.
4. Kryosektion Framställning
- Skär TGS längden som 10 ìm sektioner på en -20 ° C kryostat, och placera dem på något uppvärmd (30 ° C) Superfrost diabilder. Låt skivorna torka under 5-10 min sedan frysa och lagra vid -80 ° C tills användning. Notera: Upp till 4-5 sektioner kan vara PLAcerad på en enda bild, om ett stort antal sektioner som ska behandlas samtidigt. Vi gör så här: seriesnitt avsätts på 3 serie diabilder märkta A1, B1 och C1, då A2, B2, C2 och så vidare. Därför kan varje bild serie (A, B, och C) behandlas för olika färgning (in situ hybridisering, FISH, in situ PCR, LCM) och data som erhållits med hjälp av de olika tekniker som kan jämföras veta att diabilder och lika många svarar till samma region av TG.
5. HSV-1 Probe Märkning
Protokollet som beskrivs nedan för detektion av HSV-1-genomet genom DNA FISH har framgångsrikt använts med två typer av prober. Den första är en hemmagjord Cy3-märkt fluorescerande sond som är lämplig för den fina analys av kärn organisation inom enskilda celler, med hög förstoring fluorescensmikroskopi. Den andra är en kommersiellt tillgänglig biotinylerad sond, som kan kombinerad med peroxidas-baserade signalförstärkning för att ge en ljus-signal. Den sistnämnda är lämplig för identifiering och kvantifiering av virus innehållande neuroner vid låg förstoring i hela sektionen, och för analys av HSV-1 genomet mönster. Slutanvändare bör utvärdera vilken metod som passar bäst målet med sina studier. Den kommersiellt tillgängliga sonden finns med i reagenssektionen, och utarbetandet av den hemlagade sond beskrivs nedan.
- Förbered följande lösningar innan du börjar:
HSV-1-genomet innehåller vektorer (se steg 1)
70% etanol, molekylärbiologi grad. - . Förbered kosmider innehållande 30 kb delar av HSV-1-genom (cosmider nummer 14, 28 och 56 som beskrivs i referens 20 med hjälp av reningskolonner tillägnad stora vektorer OBS: Annan typ av bibliotek som innehåller HSV-1-genom, exempelvis bakteriella artificiella kromosomer bör fungerar så bra, så länge sondskydd alarge del av HSV-1-genomet för att producera tillräcklig signal 27-29. I våra händer, gjorde prober tillverkade av kosmidvektorn ryggraden inte producera någon signal, och användes som negativ kontroll. Således hela kosmidvektorer innehållande HSV-1-sekvensen användes i vår studie. Det är också möjligt att skära ut den HSV-1-sekvensen och använda den för att framställa proben.
- . Etikett 2 mikrogram av varje kosmid med Cy3-dCTP med hjälp av en nick-translation kit enligt tillverkarens anvisningar OBS: Utför märkning med en reaktionsblandning innehållande endast Cy3-dCTP och ingen omärkt dCTP.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 3 | il av 0,5 M EDTA i blandningen och värmning vid 70 ° C under 10 min. Kyl på is.
- Rena sonden på en G50 gel utanförskap minikolonn. Addera 150 ^ g av DNA från laxsperma till proben och fälla ut sonden genom etanolutfällning. DNA-pelleten ska vara rosa på grund av Cy3 inkorporering. Tvätta pelleten med 70% etanol och ta bort så mycket etanolsom möjligt med en pipett. Låt inte pelleten torka.
- Upplös pelleten med 100 | il av avjoniserad formamid (Varning: formamid är giftigt manipulera i dragskåp.). Sonden koncentration kan inte på ett tillförlitligt sätt vid denna punkt. Sond kvantiteter som nämns i texten hänvisar till den mängd av mall-DNA används för att framställa proben. Protokollet är baserat på 2 pg av DNA-templat och 100 | il av formamid, anses det att vara 20 ng / | il. Förvara vid -20 ° C. Den märkta sonden kan framställas i stora mängder och lagrades fryst i flera månader.
6. DNA-FISH
Figur 1 visar en översikt över de viktigaste stegen i DNA-FISH-protokollet, och hur man utför DNA-FISH som en del av en multipel färgningsexperiment att codetect RNA och protein, som beskrivs i protokollen 7-9.
- Förbered följande lösningar innan du börjar:
0,5% Triton X-100 i 1 x PBS
2 x SSC och 0,2 x SSC-buffert
100 mM pH 6,0 citratbuffert (10x stamlösning) och 10 mM pH 6,0 citratbuffert (arbetslösning)
2x hybridisering buffert (se protokoll 4) - På dag 1, placera glasen på en glashållare vid rumstemperatur och låt sektionerna torka under 10 min. Ringa sektionerna med en hydrofob penna. Rehydrera sektionerna i 1x PBS under 10 min. Inkubera sektioner 20 min med 0,5% Triton X-100 i 1 x PBS för att permeabilisera vävnaden. Tvätta 3x 10 min med 2 x SSC, och hålla i 2x SSC tills demaskera bufferten upphettas (se nedan).
- För avslöjande bereds en glasskiva facket (20 slides kapacitet) fylld med 200 ml av 10 mM natriumcitrat-buffert (pH 6,0). Placera plattan i en större behållare fylld med 500 ml destillerat vatten. Denna inställning gör det möjligt för en bättre kontroll av värmepulser. Innan du placerar bilderna i facket, förvärma bufferten i mikrovågsugnen tills buffer når kokning (ca 8 min vid 800 W).
- Placera glasen i den förvärmda citratbuffert innehållande facket och kontrollera att de är helt täckta med buffert. Värm i ca 20 sek tills bufferten når kokpunkten. Varning, låt inte bufferten över koka, vilket kan skada vävnaden. Kyl ner vid rumstemperatur under 2 min. Upprepa uppvärmningscykeln 6x (7 uppvärmningscykler totalt) *. Kyl ner 2 min och överföra bilderna i 2x SSC under 5 min.
Anm *: Det här är en av de mest kritiska stegen. Det optimala antalet och varaktigheten av värmecykler bör bestämmas empiriskt, och kan variera på vilken typ av vävnad eller vilken typ av sond som används. Mikrovågsugnen, magasin, container och volym buffert i facket och vatten i behållaren bör hållas identisk för reproducerbarhet av avslöjande. Överdriven kokning kan leda till förlust vävnad och skadade celler. För varje värmepuls, är uppkomsten av kokande noga bevakade och värmening bör stanna vid första tecknen på kokning. När båten går, verkar avslöjande robust och reproducerbar. Figur 2A visar att HSV-1-genomet kan upptäckas genom att demaskera med olika buffertar, vilket tyder på att avslöja förhållanden kan undersökas ytterligare. Citrat-baserade avslöjande visade sig genomgående ge god fisk signal, och vävnads konservering, med delar från olika laboratorium och djurmodeller. - Inkubera objektglasen i en metanol: ättiksyra: PBS-blandning (03:01:04) i 15 minuter, sedan i en metanol: ättiksyra blandning (3:1) i 15 min (Varning: ättiksyra är frätande Manipulera i rök. huva och använda tillräckligt skydd. Bered denna lösning precis före användning).
- Dehydratisera sektion genom successiva 10 min inkubation i 70% och sedan 2x 10 minuter i 100% etanol. Låt torka i rumstemperatur i 10 minuter. Förvaras torrt tills sondering.
- Förbered sondering lösningen enligt följande: i förväg förbereda en 20 ml lager av 2x hybridisering buffert containing 20% dextransulfat (molekylvikt 500.000), 2 x Denhardts lösning, 4x SSC *. Alikvotera lösningen som 500 ^ i mikrorör och förvara vid -20 ° C. För 1 slide (täck av 22 mm x 50 mm), blanda 90 ng av HSV-1 Cy3-märkt sond (30 ng sond för varje kosmid), och komplettera volymen till 40 pl med formamid. Tillsätt 40 pl av 2x hybridiseringsbuffert. Blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger.
Anm *: För att förbereda 2x hybridisering buffert, blanda 4 g MW 500.000 dextransulfat i 10 ml destillerat vatten. Den gör en viskös blandning som löses upp vid 3-4 timmar vid 70 ° C. Blanda regelbundet för att lösa upp. Tillsätt 4 ml av 20x SSC, 400 | il av 100 x Denhardts lösning. Komplettera till 20 ml och blanda väl med hjälp av en virvel. - Drop 80 l av sondering lösningen på de torkade delarna. Täck med en 22 mm x 50 mm täckglas, och kontrollera att sondera lösningen sprids överhela ytan av täckglas. Varning: det bör finnas några bubblor. Närvaro av bubblorna minskar hybridiseringseffektivitet. Täta täckglas med hjälp av klister, och låt den torka. Förvara bilderna i mörker vid rumstemperatur under åtminstone 2 h för optimal hybridiseringssignal hela diabilden.
OBS: Gummi cement är praktiskt eftersom det torkar snabbt, är vattentät och skyddar provet från torkning under hybridisering. Det är också lätt att skala bort för avlägsnande av täckglas efter hybridisering. Nagellack är en alternativ effektiv, men mindre bekvämt alternativ. - Fortsätt med denaturering genom att placera objektglasen i en 80 ° C, slide-inkubator under 5 min. Alternativt, placera glasen på en metallbricka och placera brickan i ett 80 ° C vattenbad (facket ska flyta). Sedan snabbt överföra bilderna till en metallisk bricka placeras på is. Låt verka i 5 minuter. Överför bilderna vid 37 ° C (slide värmare eller inkubator) för natten hybridisering.
OBS: Vi rekommenderar inte kortare hybridisering, vilket resulterar i svag eller ingen signal. - På dag 2, ta bort gummicement med pincett, medan bild upprätthållande på värmaren för att hålla sektionen vid 37 ° C. Avlägsna täckglaset försiktigt med spetsen av ett skalpellblad.
- Tvätta 3x med 2x SSC vid 37 ° C under 5 min, och tre gånger med 0,2 x SSC vid 37 ° C under 5 min. Tvätta en gång med 2 x SSC vid rumstemperatur under 5 min och vidare med DNA-färgning och montering (se protokoll 10 nedan).
Notera: Denna metod gör det möjligt att upptäcka cellulära iska mål, genom att använda motsvarande sonder i sonderings lösning tillsammans med HSV-1 specifika prober som publicerats för centromerkohesion och pericentromera sekvenser 22.
7. Dual RNA-DNA-FISK
Se Figur 1, gröna rutor för en översikt.
För flerafärgning förfaranden inklusive en RNA-FISH steg, är det i allmänhet rekommenderas att först utföra RNA upptäckt som sådant mål är känsligt för nedbrytning av RNAse och kemikalier. Dessutom DNA-FISH förfarande omfattar behandlingar som minskar effektiviteten i andra färgning. För RNA-FISH, valde vi en enzymbaserad detektionsmetoden (tyramid Signal Amplification (TSA) med användning av biotinylerade prober och (HRP)-kopplat streptavidin). TSA är baserat på ett fluorescerande tyramid substrat (se reagens tabell för detaljer), som är kovalent bunden till vävnaden genom ett peroxidas enzymatiska reaktionen. RNA-FISH signalen alltså bevaras under DNA-FISH.
- Förbered följande lösningar innan du börjar:
Vektor för in vitro transkription av LAT locus (pSLAT-2)
1x PBS innehållande 2 mM RVC
0,5% Triton X-100 i 1 x PBS innehållande 2 mM RVC
3% H 2 0 2 i destillerat vatten.
70%, 80%, 95% etanol, molecular biology grade.
4x RNA hybridisering lösning (se protokoll 4) - Minst en dag före RNA-FISH experiment förbereda RNA FISH sonden. För att detektera HSV-1 Latency Associated Transcript (LAT), framställa ett biotinylerat ribo-proben från pSLAT-2 vektor 30, eller en annan vektor för in vitro-transkription av LAT-lokuset, såsom tidigare beskrivits i referens 26. I korthet: Linjärisera 10 pg av pSLAT-2 med Hindlll och rena den digererade vektorn med ett DNA-reningskit. Syntetisera en enkelsträngad ribo-sond från 2 | ig av digererat pSLAT-2 med en T7-transkription in vitro kit i närvaro av biotin-16-UTP *. Rena den sond med en RNA-mini-kolonn och kvantifiering vid 260 nm med användning av en spektrofotometer. Späd sond vid 50 ng / | il i DNas / RNas-fritt vatten och förvara vid -80 ° C i små alikvoter för att undvika frysning-upptiningscykler.
OBS *: Biotin-16-UTP: UTP-förhållande måste bestämmas empiriskt. Vi found ett 40:60-förhållande för att ge sonder effektivt upptäcka LAT av RNA-FISH. - På dag 1, placera glasen på en glashållare vid rumstemperatur och låt sektionerna torka under 10 min. Ringa sektionerna med en hydrofob penna. Rehydrera avsnitten i 1x PBS innehållande 2 mM ribonukleosid Vanadyl Complex (RVC) * 10 min. Inkubera sektioner för 20 min med 0,5% Triton X-100 i 1 x PBS innehållande 2 mM RVC att permeabilisera vävnaden. Tvätta 3x 10 min med 1 x PBS, 2 mM RVC. För att släcka en endogen peroxidasaktivitet, inkubera avsnitt i 3% H 2 O 2 för 2 x 10 min, och sedan tvätta en gång med 1x PBS, 2 mM RVC.
OBS *: Under hela RNA-FISH förfarande, ribonukleosiden vanadyl komplex (RVC) läggs till buffertar och lösningar för att förhindra RNA nedbrytning. - Inkubera 2x 10 min i 70% etanol. I detta skede kan sektionerna lagras i 70% etanol vid -20 ° C under flera veckor. Dehydrera sektionerna genom inkubation i 80%, 95% och 100% ethanol, 5 min vardera. Låt avsnittet torka i minst 10 min.
Anmärkning: I vissa fall kan etanolbehandling vara skadliga för detektion av andra mål. Ett alternativt protokoll med hjälp av en förhybridiserings steg i 50% formamid - 2x SSC kan användas (se nedan i protokoll nr 9 för information om triple färgning). Dock är etanol behandling den mest mångsidiga tillvägagångssätt för RNA-FISH och ger den lägsta bakgrunden. - Förbered sondering lösningen enligt följande: i förväg förbereda en 10 ml lager av en 4x RNA-hybridisering lösning innehållande 8x SSC, 20x Denhardts lösning, 4 mM EDTA, 40% dextran *. Alikvotera lösningen som 500 ^ i mikrorör och förvara vid -20 ° C. För en diabild förbereda 80 pl av lösning (täckglas av 22 mm x 50 mm), genom att blanda 20 ng av biotinylerad LAT riboprob, 40 ng jäst-tRNA, 2 mM RVC och komplett till 20 | il med vatten. Tillsätt 20 ^ il 4x RNA-hybridisering lösning och 40 | ilformamid (50% slutlig koncentration). För att underlätta pipettering och blandning, rekommenderas att Prewarm 4x RNA-hybridisering lösning vid 75 ° C. Blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger.
Anm *: För att förbereda 4x RNA hybridisering lösning, blanda 4 g dextransulfat (MW 500.000) i 3 ml destillerat vatten och 4 ml av 20x SSC. Det är en trögflytande blandning som upplöses på 3-4 timmar vid 70 ° C. Blanda regelbundet för att hjälpa till att lösa upp. Tillsätt 2 ml 100x Denhardts lösning och 80 | il av en 0,5 M EDTA-lösning. Slutför till 10 ml med vatten och blanda väl med hjälp av en virvel. Varning: Använd endast RNas / DNas fria produkter. - Denaturera sonden 10 min vid 75 ° C. Samtidigt placera glasen i en bild inkubator inställd på 65 ° C. Drop 80 l av sondlösningen på avsnitten och snabbt placera ett täckglas på nedgången. Varning: det bör finnas någon bubbla. Förekomst av bubblor minskar hybridisering efficiency. Inkubation måste äga rum i en fuktig kammare, eftersom täckglas inte är förseglad. Använd antingen en bild inkubator som kan hålla vatten (se materialtabellen), eller förbereda en fuktkammare i en sluten låda och placera den i ett 65 ° C hybridisering ugn.
- Inkubera över natten vid 65 ° C. Anmärkning: LAT RNA-FISH genomförs vid 65 ° C för att förhindra icke-specifik bindning av sonden, som observeras vid 37 ° C. Många andra RNA-FISK sonder bör resultera i bra signal vid 37 ° C.
- På dag 2, innan du börjar tvätta, förbereda detektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar TSA detektionssatsen. Detektion utförs med ett kommersiellt TSA-detektionskit innefattande en pepparrotsperoxidas (HRP)-kopplat streptavidin och en grön eller blå fluorescerande substrat.
- Håll glasen på bilden värmaren vid 65 ° C. Ta försiktigt bort täckglas och snabbt tillsätt 1 ml 50% formamid i 2x SSC, förvärmd ent 65 ° C. Varning, låt inte avsnittet torka. Tvätta två gånger i 10 min vid 65 ° C i 50% formamid i 2 x SSC och 2 x 10 min i 2 x SSC vid 65 ° C. Tvätta en gång med 2 x SSC och placera bilden på en 37 ° C slide värmare.
- Fortsätt med detekteringssteget enligt TSA detektionskit tillverkarens instruktion. Koncentrationen av HRP-streptavidin, måste koncentrationen av fluorescerande substrat och reaktionstiden bestämmas empiriskt *. För LAT RNA-detektion, rutinmässigt använde vi följande villkor: HRP-streptavidin utspätt till 1/500, fluorescerande reagens vid 1/100 för blå fluorescens och 1/500 för grön fluorescens, och reaktionstid på 10 min. Signalen kan snabbt kontrolleras med ett inverterat fluorescensmikroskop utan montering, innan du fortsätter med DNA-FISH.
OBS *: Förstärkningsprotokollet kommer att vara design enligt de viktigaste målen i experimentet. Till exempel, för fint lokalisera mål-RNA, är det adbetade för att använda kort reaktionstid. I motsats härtill för att snabbt identifiera och räkna positiva celler vid låg förstoring, kan ökas reaktionstiden för att generera en ljus signal. - För DNA-FISH, följ proceduren som anges ovan, med början från den avslöjande steg (steg 6,2).
8. Immuno-DNA FISH
Se Figur 1, lila rutor för en översikt.
I likhet med RNA-DNA-FISH, är det tillrådligt att utföra först med immunofluorescens, eftersom DNA-FISH kommer sannolikt att denaturera proteiner och förhindra deras upptäckt av antikroppar. Kvaliteten på immunofluorescens-signalen är i hög grad beroende på de egenskaper antikropps och flera antikroppar bör testas när det är möjligt. Epitope avslöjande utförs en gång innan immunofluorescens för att förbättra både protein detektion och DNA-FISH. För att bevara den immunofluorescens signalen på provet under DNA-FISH förfarande är det nödvändigt att covalently länka den till vävnaden. Vi presenterar här två tillvägagångssätt som gav bra resultat i våra händer, antikropps efter fixering och tyramide baserad detektion (se steg 8.5). Valet bör styras av preliminära tester för varje mål / antikroppsparet.
- Förbered följande lösningar innan du börjar:
1x PBS innehållande 3% normalt getserum (NGS).
2% PFA i 1x PBS (spädning från 4% stamlösning) - På dag 1, de första stegen är identiska med DNA-FISH, upp till den avslöjande steget (steg från 6,1 till 6,2).
- Efter demaskera, inkubera de sektioner med 1 x PBS innehållande 3% NGS under 1 timme.
- Inkubera med primär antikropp utspädd i 1 x PBS innehållande 3% NGS under 24 timmar. Lägre inkubationstid kan användas för att förkorta protokollet, även om vi fann att en inkubation över natten resulterar vanligen i en starkare signal. Upp till 48-72 h av inkubationen kan krävas för låg affinitet primära antikroppar, såsom IgM.
- På dag2 tvätta 3x 10 min med 1 x PBS.
- Protokoll med antikroppar efter fixering: inkubera 1 tim med den sekundära antikroppen i kombination med ett grönt fluorescerande färg, på 1/200 i 1x PBS innehållande 3% NGS. Tvätta tre gånger i 10 min med 1 x PBS. Post-fixering utfördes med 2% PFA i 1 x PBS under 10 min *. Tvätta 3x 10 min med 1 x PBS.
Protokoll med TSA upptäckt: inkubera 1 tim med HRP-kopplad sekundär antikropp vid 1/250 i 1x PBS innehållande 3% NGS. Tvätta tre gånger i 10 min med 1 x PBS. Fortsätt med tyramide detektering enligt tillverkarens anvisningar. Såsom angivits ovan (steg 7,9), reagensspädning och reaktionstiden måste bestämmas empiriskt. I de flesta fall har våra protokoll varit baserade på en 1/500 utspädning av fluorescerande substrat och en 10 min reaktionstid. Tvätta 3x 10 min med 1 x PBS.
OBS *: Post-fixering är ett kritiskt steg i immuno-FISH, och kräver noggrann installation. Ju starkare efter fixering avbättre IF-signalen, och ju lägre DNA-FISH effektivitet. - Fortsätt med DNA-FISH från metanol-ättiksyra steg (steg 6,3). Varaktighet av immuno-DNA-FISH är normalt 3 dagar, med den första antikroppen inkuberas över natten.
9. Dubbla DNA-RNA-FISH Tillsammans med immunofluorescens
Se Figur 1, apelsinlådor för en översikt.
RNA-FISH utföres först, följt av immunofluorescens och slutligen DNA-FISH. Om immunofluorescens detekteras av tyramid reaktionen är det nyckeln till att släcka helt den HRP-aktivitet från RNA-FISH steg med H 2 O 2, och för att verifiera att härdning är effektiv. Detta görs med hjälp av en bild som ett "ingen primär antikropp" kontroll.
Eftersom etanolbaserad uttorkning är skadlig för vissa lösningsmedelskänsliga proteiner, kan detta steg av RNA-FISH hämmar immunofluorescens. Om så är fallet, kan utföras RNA-FISH wed en alternativ protokoll, som beskrivs nedan i STPE 9.3.
- Bered följande lösning före start:
50% formamid i 1 x PBS innehållande 2 mM RVC - Dag 1, förbereda RNA-FISH sond och fortsätt som för dubbla RNA-FISH, upp till H 2 O 2 släckning steg (steg 7,2).
- Fall 1, fungerar immunofluorescensfärgning efter etanol uttorkning: fortsätt med RNA-FISH enligt ovan i steg från 7,3 till 7,9. Fortsätt sedan till steg 9,6 nedan.
- Fall 2 är immunofluorescensfärgning förhindras genom etanolbehandling: Placera glasen i en fuktig kammare på en bild värmare inställd på 65 ° C och inkubera i 1,5 timmar i en förhybridiseringslösning innehållande 50% formamid, 1x PBS, och 2 mM RVC. Töm förhybridiseringslösningen och släppa 80 l av hybridisering lösning som anges i steg 7.4 och 7.5. Fortsätt sedan med RNA-FISH hybridisering och detektion som anges above i steg från 7,6 till 7,9 (dag 2 och 3).
- På dag 2, efter att RNA-FISH är klar, fortsätter med immuno-DNA-FISH börjar med demaskera steg (se steg 6.2). Följ sedan den immuno-DNA-FISH protokoll enligt ovan i steg från 8,2 till 8,6.
10. Skjut Montering och bildbehandling
- Bered följande lösning före start:
Hoechst 33342 vid 0,5 | ig / ml i 1 x PBS - Fläck kärnor för 10 min med DAPI eller Hoechst 33342 * vid 0,5 pg / ml i 1 x PBS under 10 min. Tvätta 3x 10 min med 1 x PBS.
Anm *:. Varning Om en av detekteringssystem använder ett fluorescerande blått färgämne, inte använder DAPI eller Hoechst. Använd i stället en fluorescerande DNA-färgämnen med ett emissionsspektra inom det långt röda våglängder såsom Topro3. - Töm så mycket vätska som möjligt från bilden. Drop 80 pl av monteringsmedium innehållande en antifading medel på den ena änden av objektglaset. Täck sektioner med en hög optisk kvalitettäckglas (nr 1,5 glas). Låt täck gå ned långsamt genom att hålla den vid en ände med pincett, för att låta monteringsmedium sprids över sektionen utan bubblor.
- Täta med nagellack och förvara vid 4 ° C i en mörk glidlåda.
- Direkt observation av DNA-FISH signal av latent HSV-1-genom kräver en 40X eller högre förstoring oljeimmersionsobjektiv, med hög numerisk apertur (t.ex. 40X NA 1,1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) och en excitation ljuskälla av åtminstone likvärdig med en 100 W kvicksilverlampa. Vi uppmanar till en högeffektiv överföring mikroskop som de som tillhandahålls av tillverkarna under de senaste fem åren (se tabell av utrustning). Konfokalmikroskopi tillhandahåller verktyg för att samla in bilder med lägre bakgrund på grund av auto-fluorescens av vävnaden, exempelvis tunna sektionering eller spektral avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter flera månader av omfattande tester, upptäckte vi att värmebaserad kemisk avslöjande gjorde latent HSV-1-genomet tillgänglig för fluorescent in situ hybridisering. Under processen, försökte vi olika avslöjande förfaranden, och endast värmebaserade behandlingar (dvs. uppvärmning av avsnitten fram till under kokpunkten i en mikrovågsugn) verkade effektivt. Vi testade därefter ett antal saltbuffertar som rutinmässigt används i immunohistokemi (IHC) och elektronmikroskopi för att hämta epitoper 31,32, inklusive 0,01 M pH 6,0 citratbuffert (som vi använde i våra studier), 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 och destillerat vatten. Även EDTA-buffertarna tenderar att skada vävnaden, alla andra buffertar var lämpliga för HSV-1 upptäckt, som visas som en eller flera platser inom kärnan av nervceller (Figur 2A, notera att dessa vävnader är mycket auto-fluorescerande, vilket förekommer i vissa bilder som en homogen signal i cytoplasm). I våra händer, verkade citratbuffert att ständigt åstadkomma en bra signal utan att skada vävnad och således valdes för vår rutinprotokoll.
Användning av direkt märkta Cy3-DNA-prober (tillverkade av delar av HSV-1-genomet klonat i cosmider) ger robusta och reproducerbara resultat. Det kräver dock att ha tillgång till HSV-1 genomet bibliotek. Vi kontrollerade därför att våra protokoll skulle fungera för alla som har tillgång endast till kommersiella sonder. Figur 2B visar HSV-1 latent genom detektion av DNA-FISH med hjälp av en pan-HSV-1 biotinylerad sond som erhållits från Enzo Biochem. I linje med detta testade vi om DNA-FISH protokoll potentiellt skulle kunna användas av forskare som använder andra HSV-1 djurmodeller. Figur 3A visar detektion av HSV-1-genomet på prover från mus och kanin, infekterade med tre vanliga stammar, SC16, 17syn + och McKrae, antingen akut eller latent skede av infektionen, inom delar av trigeminala ganglia. I samtliga fall HSV-1-genom visar som en prickig signal av ljushet och intensitet som varierar från cell till cell. Slutligen, förlängde vi att tillämpa våra protokoll till replika cykel av HSV-1, genom att utföra DNA-FISH på vävnader från möss som genomgår en allmän herpesinfektion. I dessa djur stora ljusa aggregat av HSV-1-genom kunde detekteras i olika vävnader inklusive hjärna, ryggmärg, ögon och dorsala rotganglier (figur 3B).
Många aspekter av HSV-1 latens är fortfarande dåligt kända, till exempel hur HSV-1 genuttryck regleras genom dess interaktioner med kärnkrafts arkitektur 33-35, om en specifik delmängd av nervceller är att föredra värdcell för latens etablering och reaktive 13 , 14,36,37, eller hur immun övervakning sker inom ganglierna enligt virusbelastning eller virus genuttryck 9,10. Protokollet som beskrivs här kommer att bidra till att hantera dessa frågor genomcodetection av HSV-1-genomet och virala eller cellulära RNA och proteiner. Figur 4 illustrerar codetection av HSV-1-genomet tillsammans med HSV-1 LAT-RNA (fig. 4A och 4C), med cellulära proteiner, såsom den centromera protein CENP-A (Figur 4B, OM, följt av PFC efter fixering), eller kromatinet och PML-NB associerat protein ATRX (Figur 4C, om de följs av TSA baserad detektion). Figur 4C illustrerar data från en trippelfärgning experiment visar HSV-1-DNA ( röd), dess RNA produkt LAT (blå) och en kandidat reglerande protein, ATRX (grön). Kombinationen av vår DNA-FISH protokoll och direkt eller enzymbaserad upptäckt av RNA-FISH och immunfluorescenssignal, representerar ett mångsidigt och brett tillämpbar uppsättning verktyg för att utforska på plats virus-värd relation på cell-och vävnadsnivå.
Figur 1. Översikt av DNA-FISH protokoll och integration i flera mål färgning. De viktigaste stegen i DNA-FISH protokoll och sambandet med protokoll för codetection av RNA och proteiner schematiskt. Kritiska steg indikeras med varningsskyltar. DNA-FISH viktigaste stegen är rehydrering, permeabilization, avslöjande, metanol-ättiksyra behandling och hybridisering. Inom förfarandet, är avslöjande ett kritiskt steg, som måste vara noggrant ställa upp och respekterad. De två andra viktiga steg beror på vilka tekniska förfaranden är förenliga med de antikroppar som används för immundetektion. Dessa kommer att påverka RNA-FISH förfarande för triple färgning, och om strategin för immunofluorescens. Upptäckt Cslicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Detektion av HSV-1 latenta genomet efter antigen avslöjande. A. TG avsnitt från 28 dpi infekterade möss framställdes såsom anges i protokollet avsnittet. TG sektioner bearbetades för DNA-FISH såsom anges i fig. 1, och värmen baserade avslöjande var utföra med användning av bufferten som anges på toppen av varje bild. Konturen av kärnan visas som en streckad linje. Den signal som observerades i cytoplasman är på grund av auto-fluorescens av vävnaden. B. TG sektioner framställda som i A. bearbetades för DNA-FISH använda ett kommersiellt erhållits biotinylerad HSV-1 prob. Den hybridiserade proben detekterades med användning av TSA och en Alexa Fluor märkta substrate (grönt). Kärnorna motfärgades med Hoechst 33352 (blå). En utvidgad beskurna bilden visas i den högra kolumnen. Två typer av HSV-1-genomet mönster visas för att illustrera ett typiskt HSV-1 intranukleär lokalisering. Alla bilder togs på ett brett fält epifluorescensmikroskop. Skala bar är 5 um. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Detektering av HSV-1-genomet i flera modeller. A. Standard DNA-FISH protokoll tillämpades på TG avsnitt från olika ursprung. SC16 infekterad mus TG sektioner framställdes som beskrivs i protokollet avsnittet. 17syn + infekterade mus sektioner och McKrae infekterade kanin sektioner lämnades av collaborators. Bilder samlades på ett brett fält epifluorescensmikroskop. Skala bar är 5 um. B. SC16 infekterade möss som genomgår en allmän herpesinfektion offrades vid 6 dpi och flera vävnader samlades in, frusen och snittades. Den standard-DNA-FISH-protokollet applicerades såsom anges i figur 1. Bilder samlades på ett brett fält epifluorescensmikroskop. Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Codetection av HSV-1 iskt DNA och RNA och proteiner på enskilda avsnitt. SC16 infekterade mus TG sektioner bearbetades för RNA-DNA FISH, immuno-DNA FISH eller trippel staining som visas i figur 1. A. RNA-DNA FISH med hjälp av en HSV-1-genomet Cy3 märkt sond (röd) och en RNA-LAT biotinylerad ribo-sond (grön). LAT RNA sond detekterades med hjälp av TSA och en Alexa Fluor 488 märkta substrat. Kärnor motfärgades med Hoechst 33352 (blå) B. Immuno-DNA FISH med hjälp av en anti-CENP-A antikropp (grön) och en HSV-1-genomet Cy3 märkt sond (röd). Antikropparna var post-fast 10 min med 1% PFA i PBS innan du kör DNA-FISH. Kärnor motfärgades med Hoechst 33352 (blå). C. Immuno-RNA-DNA-FISH med hjälp av en RNA-LAT biotinylerad ribo-sond (blå), en anti-ATRX antikropp (grön) och en HSV-1-genomet Cy3 märkt sond ( röd). LAT RNA-prob detekterades med användning tyramid detektering och en blå fluorescent märkt substrat och anti ATRX och sekundära antikroppar detekterades genom tyramid detektering och ett grönt fluorescensmärkt substrat. Alla bilder togs på ett brett fält epifluorescence microscope. Skala bar är 5 um. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här medger detektion av HSV-1 latent genomet inom neuroner i mus neuronala vävnadssektioner. Vår förståelse av de signalvägar som reglerar viral genuttryck har begränsats av bristen på metod för att påvisa HSV-1 iskt DNA på plats inom neuronala vävnader. Information om genomet kopior antal och andel infekterade nervceller kom främst från PCR-analys på dissocierade nervceller 11,12. Vid belysa rollen värd-cellkärnor arkitektur på HSV-1 latens, vi satt att bestämma lokaliseringen av latent HSV-1 genomet genom DNA-FISH, inuti kärnan av nervceller i latent infekterade möss. Vi har testat ett stort antal DNA-FISH protokoll och vävnadsbehandlingar, och fann värme-baserade "epitop avslöjande" som ett viktigt steg i virus-DNA-FISH upptäckt. Sådan behandling används rutinmässigt för att avslöja protein epitop inom paraffin inbäddade sektioner för immunohistokemi. Även om det är nästan allmänt användsi patologi, är det inte konventionellt används i DNA-FISH. Medan många studier stöder att denna teknik bevarar morfologin hos vävnaden vid skala av Ijusmikroskopi, bör slutanvändaren inkluderar lämpliga kontroller för att validera denna punkt i sin särskilt biologiskt system 38. I våra händer, gjorde andra avslöjande förfaranden såsom proteas behandlingar inte att HSV-1 DNA-detektion, medan värmebaserad avslöjande med olika buffertar gjort konsekvent HSV-1 latent iskt DNA tillgänglig för FISK sonder (Figur 2). Värme-baserade avslöjande är tänkt att eliminera en del av de tvärbindningar mellan proteiner, vilket tyder på att HSV-1 DNA är tätt förknippad med proteiner. Detta överensstämmer med den senaste demonstrationen att HSV-1 latent och lytisk genomet är associerad med cellulära histoner 2,39,40. Därför att genom av andra herpesvirus är förknippade med histoner: VZV 41, HCMV 42,43, EBV 44-46, KHSV 47-49, den protocol beskrivs här kan användas för att upptäcka genom av dessa herpesvirus, liksom många andra, men förmodligen också för att upptäcka andra långlivade kärn virus såsom papillomvirus, hepatit B-virus och retrovirus. Intressant, hade användningen av det nuvarande protokollet om olika experimentella inställningar (vävnader från infekterade möss och kaniner, sektioner som utarbetats av olika laboratorier och användning av olika HSV-1-stammar) inte kräva ytterligare set-up för detektion av HSV-1-genomet. Om du vill använda protokollet till andra biologiska system, räknar vi med att fixering förfarande och antigenåtervinning tekniker kan vara områden för vidare utveckling.
Den klassiska metoden att utvärdera HSV-1 latens är att påvisa förekomsten av LAT RNA kombination med avsaknaden av detektion av lytisk cykel genprodukter i nervceller. Men studier som bygger på in situ PCR och qPCR på isolerade nervceller från musmodeller av latens visade att antalet smittade neurons (dvs. HSV-1 genomet positiva neuroner) var 2-3 gånger högre än den LAT uttrycka nervceller 12,18. Med hjälp av RNA-DNA-FISH, bekräftades det att i vår musmodell 20-30% av HSV-1 DNA-positiva nervceller är också positivt för LAT RNA 22. Användningen av DNA-FISH och codetection av viral och cellulär DNA, kommer RNA-och proteinkomponenter ger en ny uppsättning verktyg för att karakterisera de signalvägar som reglerar HSV-1 latent genuttryck. Dessutom är HSV-1 latens känt för att vara en heterogen företeelse eftersom den äger rum i ett stort antal olika neuronundertyper, och den kännetecknas av heterogenitet i genomet kopietal och i LAT-RNA-expression 12,22. En stor fördel med DNA-FISH är att ge tillgång till enkelcellanalys inom komplexiteten i vävnaden, och därmed ta hänsyn till heterogenitet av HSV-1 latens. Till exempel har vi kopplat ett uttryck för LAT RNA med det överflöd av HSV-1-genomet i enskilda nervceller 22. In adsättning, kan denna teknik även gälla för att utvärdera statusen för virala genom användning av in vitro cellkulturmodeller samt djurmodeller som använder mänskliga ganglion implanteras i SCID-möss 13-17. En framtida tillämpningen av vår DNA-FISH-protokollet kommer att finnas möjlighet att karakterisera HSV-1 latens genom antalet HSV-1 genomet positiva nervceller. Detta kan utföras med användning av biotinylerade prober och tyramid baserad detektering, vilket ger en tillräckligt stark signal skall detekteras vid låg förstoring. En sådan ansökan görs möjlig genom mycket låg bakgrund som genereras av tyramide detektionssystem. Den Cy3 märkt HSV-1 prober som beskrivs i detta protokoll kan också användas men kräver observation vid större förstoring, vilket skulle vara mycket tidskrävande att läsa ett stort antal sektioner.
Kanske den viktigaste kvaliteterna av DNA-FISH protokoll som beskrivs här är mångsidighet och robusthet, vilket gör den kompatibel med than codetection av både RNA och protein. I själva verket fann vi att alla behandlingar som krävs för att detektera RNA eller protein, eller båda, inte förändrar kvaliteten och ljusstyrkan på DNA-FISH-signal. RNA-FISH kan utföras innan DNA-FISH, med antingen etanol uttorkning eller formamid-baserade prehybridisering. Vi rekommenderar den etanolbaserade protokoll, vilket resulterar i mindre bakgrund med TSA detektionsreagens. Den formamid-baserat protokoll ska användas när RNA-FISH följs av immunofluorescens med antikroppar som inte fungerar på etanolbehandlade prover. Vid utförande av immuno-DNA-fisk, kan kovalent bindning av immunfluorescenssignalen utföras av tyramid baserad detektion (som förstärker signalen), eller genom efter fixering att bevara detaljerna i proteinlokalisering mönster. För att optimera efter fixering bör immunofluorescens protokollet först sättas upp för att få en stark signal, och den starkaste efter fixering förfarande som medger god DNA-FISH-signalen bör fastställas. Detta till ger en rad villkor inom vilka kan erhållas den bästa kompromissen mellan immunofluorescens bevarande och DNA-FISH-signal. Som för andra antikroppsbaserad detektionsmetod, är kvaliteten av signalen och det optimala protokollet mycket beroende på antikroppen i sig. Vår protokoll är inget undantag och vi har observerat att vissa antikroppar fungerar mycket bra med någon av de protokoll som beskrivs här (t ex anti-PML mAb klon 36.1) och några andra behöver betydande testning. Sammantaget vi framgångsrikt upptäckt de flesta av våra avsedda mål (ett undantag var SP100 protein), inklusive cytoplasmatiska och membranproteiner, och nukleära proteiner associerade med olika nukleära domäner (kromatin-HP1-, centromerer-CENP-A, CENP-B-, PML nukleära organ-PML, Daxx, ATRX-). På grundval av våra tester förutser vi att vårt DNA-FISH protokoll vara förenligt med den immuno-codetection av reporterkonstruktioner (β-galaktosidas, fluorescerande proteiner ...) och som vanligen används för att analysera promoter aktivitet från virala genom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar N. Sawtell (Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Storbritannien) och James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) för att tillhandahålla prover från HSV-1 -infekterade möss och kaniner, respektive, och för reagens, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) och S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankrike) för bra diskussioner.
Detta arbete har finansierats genom anslag från Centrum National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ASPETS program, till PL, http://www.cnrs.fr), det franska nationella forskningsinstitut (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), varvid FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), varvid Labex DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) av Université de Lyon, inom programmet "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) som drivs av ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 och ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ) och Inca (EPIPRO programmet http://www.e -cancer.fr ). FC och PL är CNRS forskare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
References
- Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
- Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
- Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
- Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
- Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
- Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
- Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
- Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
- Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
- Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
- Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
- Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
- Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
- Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
- Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
- Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
- Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
- Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
- Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
- Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
- Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
- Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
- Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
- Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
- Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
- Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
- Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
- Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
- Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
- Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
- Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
- Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
- Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
- Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
- Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
- Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
- Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
- Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
- Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
- Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
- Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
- Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).
