Summary
Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.
Abstract
Cellule à l'unité co-détection d'un gène, le produit de l'ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l'expression génique. Il s'agit d'un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d'où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l'absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l'approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d'ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l'ADN à l'ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d'amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d'obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d'anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.
Introduction
Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte 1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l'établissement de la latence initiation de réactivation 3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l'ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN 4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l'ADN viral génomique, ARN LAT, et l'absence de protéines du cycle de replication détectables.
ontenu "> modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l'homme. L'un des principaux intérêts de ces modèles est qu'ils permettent d'étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu'à présent, l'ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu 8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l'ARN LAT par hybridation d'ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l'analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l'expression cellulaire et virale ou gène de l'hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire 9,10.Plus important encore, l'hétérogénéité de l'infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID 11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT 11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l'environnement cellulaire à l'intérieur de l'impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l'ADN génomique à l'intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l'accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l'interaction du génome viral avec les cellules de l'hôte composants intra-nucléaires 22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l'ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l'expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d'analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d'appliquer un traitement de récupération de l'antigène de faire l'ADN viral accessible à l'hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond'autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.
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Protocol
Cette méthode a été utilisée dans une étude publiée précédemment 22. Pour le fond général et la description de la manipulation classique sur ISH, IF et FISH, nous suggérons la littérature disponible après 23.
Une. Infection des animaux
Toutes les procédures impliquant des animaux expérimentaux conformes aux questions d'éthique de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration de l'utilisation des animaux en recherche, et ont été approuvés par le comité d'éthique local UPR-3296-CNRS, en conformité avec la Communauté européenne Directive 86/609/CEE du Conseil. Tous les animaux ont reçu un accès illimité à la nourriture et de l'eau.
Le procédé de l'infection de la souris par le HSV-1 décrit ci-dessous a été utilisée dans des études précédemment publiées 24-26.
- Préparer les solutions suivantes pour se préparer avant départ:
Solution HSV-1 stock de virus
Solution anesthésier - Kétaminee-100 mg / kg et xylazine-10 mg / kg - Prenez 1 pl de virus (10 6 pfu) dans une micro-5 de verre pi reliée à un dispositif de pompe à microseringue fournir 0,1 pi / sec. Remarque: Reprendre le stock de virus dans un milieu dépourvu de rouge phénol pour voir la limite entre l'huile rouge présenter dans le capillaire et la solution de virus et d'éviter l'injection d'air au niveau du site de l'inoculation du virus.
- Posez la souris anesthésiée (kétamine-100 mg / kg et de xylazine-10 mg / kg) sur sa face vers le haut.
- Positionner la tête de souris anesthésiée sous un stéréo-microscope binoculaire et insérer l'aiguille dans la couche sous-épithéliale de la lèvre supérieure gauche à la frontière cutanéo-muqueuse. Injecter la solution de virus en deux étapes (deux fois 0,5 ul) à une vitesse de 0,5 ul toutes les 5 sec. Remarque: respecter une pause de 10 secondes entre les deux injections de 0,5 ul, pour permettre à la suspension virale à absorber au niveau du site d'injection.
- Placez la souris dansun 37 ° C incubateur jusqu'à réveillant.
- Laissez la souris dans les animaleries pour récupérer le temps nécessaire. Remarque: Dans le modèle de la souris, le HSV-1 induit une primo-infection, appelée infection aiguë, qui dure moins de 10 jours sur le site de l'inoculation et dans plusieurs tissus neuronaux, y compris TG, supérieure ganglions cervicaux (SCG), et les ganglions rachidiens (DRG) en fonction du site d'inoculation. Des signes d'infection primaire disparaissent progressivement et la latence est considéré comme pleinement établie sur 28-30 jours post-infection (dpi) et suivants. Tissus neuronaux peuvent être récoltés habituellement de 4 dpi pour les études sur l'infection aiguë, et de 28 dpi pour les études de latence.
2. Souris Perfusion-fix
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer: 50ml de tampon de sérum physiologique
60 ml de PBS 1x
150 ml de paraformaldehyde fraîchement préparée de 4% dans du PBS 1x
60 ml de saccharose à 20% dans du PBS 1X. <br /> - Préparer la tubulure de perfusion: relier l'aiguille à un tube capillaire, qui est relié à une pompe péristaltique.
- Anesthésier la souris comme décrit ci-dessus (SREP 1.2) et le poser sur le dos sur un plateau de dissection, attachée par les quatre pattes avec des épingles.
- L'aide de ciseaux coupent la peau du ventre jusqu'à la gorge *. Arracher la couche de tissu mince recouvrant les organes. Ouvrir la cage thoracique en coupant les nervures sur un côté du sternum. Enlever la peau en arrachant. Eloignez-vous de l'autre le droit et les pièces à gauche de la cage thoracique pour révéler le cœur. Remarque: Faites attention à ne pas inciser les entrailles, les poumons et les grands vaisseaux (artères carotides et les veines jugulaires), ce qui rendra perfuse fixation impossible.
- Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche *. Inciser l'oreillette droite avec les ciseaux. Procéder à la saignée en injectant 20 ml de sérum physiologique dans les vaisseaux sanguins dans le coeur. Laissez le débit sanguin dans le bac. Aucunete: Au cours de cette procédure, faites attention à ne pas percer à travers l'autre côté du coeur.
- Perfuser avec 150 ml de PFA à 4% dans du PBS 1X pendant 15 min * (Attention: PFA est toxique, manipuler sous une hotte). Perfuser 60 ml de saccharose à 20% dans PBS 1x pendant 6 min. A ce stade, la souris est prête pour la récolte TG. Remarque: Régler la pompe de 10 ml / min. Une bonne perfusion est perceptible lorsque la queue de la souris se raidit, lève alors retomber.
3. TG récolte
- Préparer la solution suivante avant de commencer:
20% de saccharose dans du PBS 1x - Couper la tête au niveau du cou. Couper le bout du nez juste derrière les incisives afin de révéler la cavité nasale. Inciser la bouche en deux avec des ciseaux et de s'éloigner de chaque côté de la bouche. Remarque: Les GT apparaît juste sous la bouche, comme deux masses blanches et oblongues de 2-3 mm de longueur situé sur la droite etcôté gauche et reliée au nerf trijumeau.
- Couper les branches du nerf trijumeau de chaque côté de la TG pour libérer la TG du tronc cérébral. Retirez le TG avec des pinces chirurgicales et les conserver dans une solution stérile de saccharose à 20% pendant 24 heures. Remarque: Utilisez deux Les différents destinataires pour la gauche et la droite TG, pour éviter toute confusion entre le TG gauche (infectés) et le droit TG (pas ou faiblement infectés). Incuber la TG en saccharose à 20% dans PBS 1x pendant 24 heures avant de l'intégrer.
- Incorporer TG en un seul bloc dans cryosectioning milieu d'inclusion et le gel à -80 ° C.
- blocs de magasins à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe.
4. Cryosection Préparation
- Coupez les en longueur TGS comme sections de 10 pm sur un -20 ° C cryostat, et de les placer sur des lames (30 ° C) Superfrost légèrement chauffés. Laissez les tranches sécher pendant 5-10 minutes puis congeler et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Remarque: Jusqu'à 4-5 sections peuvent être placed sur une seule lame, si grand nombre de sections doivent être traitées en même temps. Nous procédons comme suit: des coupes en série sont déposés sur 3 séries de diapositives marqué A1, B1, C1 et, alors A2, B2, C2 et ainsi de suite. Ainsi, chaque série de coulissement (A, B, et C) peuvent être traitées pour une coloration différente (hybridation in situ, du poisson dans, la PCR in situ, LCM) et des données obtenues en utilisant les différentes techniques peut être comparé sachant que les lames portant le même numéro correspondent à la même région de la TG.
5. HSV-1 Sonde étiquetage
Le protocole décrit ci-après pour la détection de HSV-1 par de l'ADN génomique de poisson a été utilisé avec succès deux types de sondes. La première est une marqué au Cy3 sonde fluorescente fait maison qui est approprié pour l'analyse fine de l'organisation nucléaire dans des cellules individuelles, par microscopie fluorescente haut de grossissement. La seconde est une sonde biotinylé disponible dans le commerce, qui peuvent être combinerd à la peroxydase avec une amplification du signal pour fournir un signal lumineux. Celui-ci est approprié pour l'identification et la quantification des virus contenant des neurones à faible grossissement dans l'article entier, et pour l'analyse des modèles de génome de HSV-1. Les utilisateurs finals devraient évaluer quelle approche convient le mieux à l'objectif de leur étude. La sonde disponible dans le commerce est listé dans la section de réactif, et la préparation de la sonde de home-made est décrite ci-dessous.
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
HSV-1 du génome contenant des vecteurs (voir l'étape 1)
70% d'éthanol, qualité de biologie moléculaire. - . Préparer cosmides contenant des portions de 30 ko de HSV-1 génomes (cosmides numéro 14, 28 et 56 décrits dans la référence 20 en utilisant des colonnes de purification dédiés aux vecteurs Remarque: D'autres types de bibliothèques contenant HSV-1 génomes, comme les chromosomes bactériens artificiels devraient fonctionner aussi bien, aussi longtemps que la sonde couvre alpartie de arge du génome HSV-1 pour produire un signal suffisamment 27-29. En nos mains, les sondes réalisées à partir du squelette du vecteur cosmidique ne produisaient aucun signal, et ont été utilisés comme contrôle négatif. Ainsi vecteurs cosmides entiers contenant la séquence de HSV-1 ont été utilisés dans notre étude. Il est également possible de découper la séquence de HSV-1 et de l'utiliser pour préparer la sonde.
- . Étiquette 2 pg de chaque cosmide avec Cy3-dCTP en utilisant un kit pseudo-traduction selon les directives du fabricant Remarque: Effectuez l'étiquetage d'un mélange réactionnel contenant seulement Cy3-dCTP et pas dCTP non marqué.
- Arrêter la réaction en ajoutant 3 ul d'EDTA 0,5 M dans le mélange et le chauffage à 70 ° C pendant 10 min. Refroidir sur glace.
- Purifier la sonde sur une mini-colonne d'exclusion sur gel G50. Ajouter 150 ug d'ADN de sperme de saumon pour précipiter la sonde et la sonde par précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN doit être rose en raison de Cy3 incorporation. Laver le culot avec 70% d'éthanol et de supprimer plus d'éthanolque possible avec une pipette. Ne laissez pas le culot sec.
- Dissoudre le culot avec 100 pi de formamide désionisée (Attention: le formamide est toxique Manipuler sous une hotte.). La concentration de la sonde ne peut pas être évaluée de façon fiable à ce stade. Les quantités de sondes mentionnées dans le texte se réfèrent à la quantité de la matrice d'ADN utilisée pour effectuer la sonde. Le protocole est basé sur 2 pg de matrice d'ADN et 100 ul de formamide, il est considéré comme étant de 20 ng / ul. Conserver à -20 ° C. La sonde marquée peut être préparé en grande quantité et stockées congelées pendant plusieurs mois.
6. ADN-FISH
La figure 1 montre une vue d'ensemble des principales étapes du protocole ADN-FISH, et comment effectuer ADN-FISH dans le cadre d'une expérience de coloration multiple à codetect ARN et de protéines, comme décrit dans les protocoles 7-9.
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1x
2x SSC et le tampon de SSC 0,2 x
Mm 100 mm pH 6.0 tampon citrate (10x solution mère) et 10 pH 6,0 tampon citrate (solution de travail)
Tampon d'hybridation 2x (voir protocole n ° 4) - Au jour 1, placer les lames sur un support de diapositives à la température ambiante, et que les sections sécher pendant 10 min. Encerclez les sections avec un stylo hydrophobe. Réhydrater les sections 1x PBS pendant 10 min. Incuber les sections 20 min avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1x pour perméabiliser les tissus. Laver pendant 3x 10 min avec 2x SSC, et garder en 2x SSC jusqu'à ce que le tampon de démasquage est chauffé (voir ci-dessous).
- Pour démasquer, préparer une plaque à lame de verre (20 lames de la capacité) rempli de 200 ml de 10 mM de tampon de citrate de sodium (pH 6,0). Placer le plateau dans un grand récipient, rempli avec 500 ml d'eau distillée. Ce réglage permet une meilleure maîtrise des impulsions de chauffage. Avant de placer les lames dans le bac, préchauffer le tampon dans le four à micro-ondes jusqu'à ce que la buffre atteint ébullition (environ 8 min à 800 W).
- Placer les lames dans le bac contenant de tampon citrate préchauffé, et vérifier qu'ils sont complètement recouverts de tampon. Feu doux pendant environ 20 secondes jusqu'à ce que le tampon atteint ébullition. Attention, ne laissez pas le tampon sur ébullition, ce qui pourrait endommager les tissus. Refroidir à la température ambiante pendant 2 min. Répéter le cycle de 6x de chauffage (7 cycles de chauffage au total) *. Refroidir 2 min et transférer les lames dans du SSC 2x pendant 5 min.
* Remarque: Il s'agit d'une des étapes les plus critiques. Le nombre optimal et la durée des cycles de chauffage doivent être déterminées de manière empirique, et peut varier le type de tissu ou du type de sonde utilisée. Le four micro-ondes, un plateau, d'un conteneur et le volume de tampon dans le bac et de l'eau dans le conteneur doivent être conservées identiques pour la reproductibilité de démasquage. Ébullition excessive pourrait entraîner la perte de tissus et cellules endommagées. Pour chaque impulsion de chauffage, l'apparition d'ébullition est soigneusement surveillé, et de la chaleurtion devrait être arrêter aux premiers signes d'ébullition. Une fois mis en place, démasquage semble robuste et reproductible. Figure 2A montre que le HSV-1 génome peut être détectée par démasquer avec différents tampons, ce qui indique que les conditions de démasquage peuvent être explorées. Démasquage base de citrate a été trouvé à fournir régulièrement un bon signal FISH, et la préservation des tissus, avec des sections de différents modèles de laboratoire et les animaux. - Incuber les lames dans un mélange méthanol: acide acétique: PBS mélange (03:01:04) pendant 15 min, puis dans un mélange méthanol: mélange d'acide acétique (3:1) pendant 15 min (Attention: l'acide acétique est corrosif Manipuler sous fumées. capot et utiliser une protection adéquate. Préparer cette solution juste avant utilisation).
- Déshydrater la coupe successives de 10 minutes d'incubation à 70%, puis 2 fois 10 min dans 100% d'éthanol. Laissez sécher à température ambiante pendant 10 min. Garder au sec jusqu'à sonder.
- Préparer la solution de sondage comme suit: préparer à l'avance un bilan de 20 ml 2x co tampon d'hybridationntaining 20% de sulfate de dextran (PM 500 000), la solution de Denhardt 2x, 4x SSC *. Aliquoter la solution que 500 pi dans des microtubes, et conserver à -20 ° C. Pour une diapositive (lamelle de 22 mm x 50 mm), mélanger 90 ng de HSV-1 sonde marqué au Cy3 (30 ng de sonde pour chaque cosmide) et compléter le volume à 40 pi avec le formamide. Ajouter 40 ul de tampon d'hybridation 2x. Mélangez bien par aspiration et à plusieurs reprises.
* Remarque: Pour préparer le tampon 2x d'hybridation, mélanger 4 g de sulfate de 500.000 MW de dextran dans 10 ml d'eau distillée. Elle fait un mélange visqueux qui se dissolvent à 3-4 heures à 70 ° C. Mélanger régulièrement pour aider à dissoudre. Ajouter 4 ml de 20x SSC, 400 pi de solution de Denhardt 100x. Compléter à 20 ml et bien mélanger à l'aide d'un vortex. - Baisse de 80 pi de solution de sondage sur les sections sèches. Couvrir avec une lamelle de 22 mm x 50 mm de verre, et de vérifier que la solution de sondage s'étend surtoute la surface de la lamelle. Attention: il devrait y avoir aucune bulle. Présence de bulles diminue l'efficacité de l'hybridation. Sceller la lamelle avec du ciment de caoutchouc, et laisser sécher. Gardez les diapositives dans l'obscurité à la température ambiante pendant au moins 2 h pour le signal d'hybridation optimale tout au long de la glissière.
Remarque: ciment caoutchouc est pratique car il sèche rapidement, est imperméable à l'eau, et protège l'échantillon de séchage lors de l'hybridation. Il est aussi facile à enlever pour enlever la lamelle après hybridation. Vernis à ongles est un autre efficace, mais l'option la moins pratique. - Procéder à la dénaturation en plaçant les lames sur un coulisseau incubateur à 80 ° C pendant 5 min. Sinon, placez les lames sur un plateau de métal et placer le plateau dans un bain d'eau à 80 ° C (le bac doit flotter). Puis transférer rapidement les diapositives sur un plateau métallique placé sur la glace. Laisser poser 5 min. Transférer les lames à 37 ° C (chauffage de diapositive ou incubateur) pour hybridation pendant la nuit.
Note: Nous ne recommandons pas l'hybridation plus courte, ce qui se traduit par une faible ou pas de signal. - Au jour 2, retirer la colle de caoutchouc avec une pince, tout en maintenant la lame sur l'élément chauffant afin de maintenir la section à 37 ° C. Retirer la lamelle délicatement avec la pointe d'une lame de scalpel.
- Laver 3 fois avec 2x SSC à 37 ° C pendant 5 min, et trois fois avec 0,2 x SSC à 37 ° C pendant 5 min. Laver une fois avec 2x SSC à température ambiante pendant 5 min, et de procéder à la coloration de l'ADN et de montage (voir le protocole 10 ci-dessous).
Remarque: Cette méthode permet la détection de cibles génomiques cellulaires, à l'aide de sondes correspondant à la solution de palpage avec HSV-1 en tant que sondes spécifiques pour publiées et des séquences centromériques péricentromériques 22.
7. Double FISH ARN-ADN
Voir la figure 1, les cases vertes pour un aperçu.
Pour multiplecoloration procédures, y compris une étape ARN-FISH, il est généralement conseillé d'effectuer la première détection de l'ARN en tant que telle cible est sensible à la dégradation par la RNAse et de produits chimiques. De plus, la procédure de l'ADN-FISH comprend des traitements qui réduisent l'efficacité de coloration autre. Pour ARN-FISH, nous avons choisi une approche de détection enzymatique basé (tyramide amplification du signal (TSA) en utilisant des sondes biotinylés et la peroxydase (HRP) streptavidine couplée). TSA est basé sur un substrat de tyramide fluorescent (voir le tableau de réactif pour plus de détails), qui est lié de manière covalente au tissu par une réaction enzymatique de la peroxydase. Le signal ARN-FISH est ainsi préservée pendant ADN-FISH.
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
Vecteur pour la transcription in vitro de locus LAT (pSLAT-2)
1x PBS contenant 2 mM RVC
0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1X contenant 2 mM de RVC
3% de H 2 0 2 dans l'eau distillée.
70%, 80%, éthanol à 95%, qualité de biologie moléculaire.
Solution d'hybridation d'ARN 4x (voir protocole n ° 4) - Au moins un jour avant l'expérience ARN-FISH, préparer la sonde FISH ARN. Pour détecter le HSV-1 associé à la latence Transcription (LAT), préparer un ribo-sonde biotinylé du pSLAT-2 vecteur 30, ou un autre vecteur pour la transcription in vitro du locus LAT, comme décrit précédemment en référence 26. En bref: 10 ug de Linéariser pSLAT-2 avec HindIII et on purifie le vecteur digéré avec un kit de purification d'ADN. Synthétiser un brin unique ribo-sonde à partir de 2 ug d'digéré pSLAT-2 avec un kit T7 in vitro de la transcription en présence de la biotine-16-UTP *. Purifier la sonde avec une mini-colonne ARN et quantifier à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. Diluer la sonde à 50 ng / ul dans DNAse / RNAse eau libre et conserver à -80 ° C, en petites portions pour éviter les cycles de congélation-décongélation.
* Remarque: La biotine-16-UTP: rapport UTP doit être déterminée de manière empirique. Nous fplaies un rapport de 40:60 à fournir des sondes de détection efficace LAT par l'ARN-FISH. - Au jour 1, placer les lames sur un support de diapositives à la température ambiante, et que les sections sécher pendant 10 min. Encerclez les sections avec un stylo hydrophobe. Réhydrater les sections 1x PBS contenant 2 mM ribonucléoside Vanadyl complexe (RVC) * pendant 10 min. Incuber les sections pendant 20 minutes avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1X contenant 2 mM de RVC pour perméabiliser les tissus. Laver 3x 10 min avec du PBS 1x, 2 mM RVC. Pour étancher toute activité de peroxydase endogène, incuber la section 3% de H 2 O 2 pour 2x 10 min, puis laver une fois avec PBS 1x, 2 mM RVC.
* Remarque: Tout au long de la procédure ARN-FISH, ribonucléosidique vanadyle complexe (RVC) est ajouté aux tampons et des solutions pour prévenir la dégradation de l'ARN. - Incuber 2 x 10 min dans 70% d'éthanol. A ce stade, les articles peuvent être stockés dans 70% d'éthanol à -20 ° C pendant plusieurs semaines. Déshydrater les sections par incubation dans 80%, 95% et 100% ethanol, 5 min chacun. Laissez la section sec pendant au moins 10 min.
Remarque: Dans certains cas, le traitement à l'éthanol peut être néfaste pour la détection des autres cibles. Un autre protocole utilisant une étape de pré-hybridation dans 50% de formamide - 2x SSC peut être utilisé (voir ci-dessous dans le protocole 9 pour plus de détails sur triple coloration). Cependant, le traitement de l'éthanol est l'approche la plus souple pour l'ARN-FISH et fournit l'arrière-plan le plus bas. - Préparer la solution de sondage comme suit: préparer à l'avance un 10 ml actions d'une solution d'hybridation d'ARN contenant 4x 8x SSC, 20x solution de Denhardt, 4 mM EDTA, 40% de dextran *. Aliquoter la solution que 500 pi dans des microtubes, et conserver à -20 ° C. Pour une diapositive préparer 80 pi de solution (lamelle de 22 mm x 50 mm), en mélangeant 20 ng de ribosonde LAT biotinylé, 40 ng d'ARNt de levure, 2 mM RVC et complet à 20 pi avec de l'eau. Ajouter 20 pi de 4x solution d'hybridation d'ARN, et 40 plde formamide (50% concentration finale). Pour faciliter le pipetage et de mélange, il est recommandé de préchauffer la solution d'hybridation de l'ARN 4x à 75 ° C. Mélangez bien par aspiration et à plusieurs reprises.
* Remarque: Pour préparer la solution d'hybridation ARN 4x, mélanger 4 g de sulfate de dextran (MW 500.000) dans 3 ml d'eau distillée et 4 ml de 20x SSC. Elle fait un mélange visqueux qui se dissout lors de 3-4 heures à 70 ° C. Mélanger régulièrement pour aider à dissoudre. Ajouter 2 ml de solution de Denhardt 100x, et 80 ul d'une solution 0,5 M d'EDTA. Compléter à 10 ml avec de l'eau et bien mélanger à l'aide d'un vortex. Attention: utiliser uniquement RNase / DNase produits gratuits. - Dénaturer la sonde 10 min à 75 ° C. Pendant ce temps, placer les lames sur un incubateur de diaporama à 65 ° C. Baisse de 80 pi de solution de sonde sur les sections et rapidement placer une lamelle sur la goutte. Attention: il devrait y avoir aucune bulle. Présence de bulles diminue hybridation efficacité. L'incubation doit avoir lieu dans une chambre humide depuis la lamelle n'est pas étanche. Utilisez un incubateur de diapositives qui peuvent contenir de l'eau (voir le tableau des matériaux), ou préparer une chambre humidifiée dans une boîte scellée et le placer dans un 65 ° C four à hybridation.
- Incuber pendant une nuit à 65 ° C. Remarque: LAT ARN-FISH est réalisée à 65 ° C pour éviter la liaison non spécifique de la sonde, qui est observée à 37 ° C. Beaucoup d'autres sondes ARN FISH devraient aboutir à bon signal à 37 ° C.
- Le jour 2, avant de commencer à laver, préparer les réactifs de détection selon les instructions du fabricant du kit de détection TSA. La détection est effectuée avec un kit de détection TSA commercial comprenant une peroxydase de raifort (HRP) couplée streptavidine et un substrat à fluorescence verte ou bleue.
- Gardez les lames sur le chauffe-lame à 65 ° C. Retirez délicatement la lamelle et rapidement ajouter 1 ml de formamide à 50% en 2x SSC, préchauffé unt 65 ° C. Attention, ne laissez pas la partie sèche. Laver deux fois 10 min à 65 ° C dans 50% de formamide dans du SSC 2x et 2x 10 min en 2x SSC à 65 ° C. Laver une fois avec 2x SSC et placer la lame sur une lame de chauffage à 37 ° C.
- Procéder à l'étape de détection selon l'instruction kit de détection TSA du fabricant. La concentration de la HRP-streptavidine, la concentration de substrat fluorescent et le temps de réaction doit être déterminée empiriquement *. Pour la détection de l'ARN LAT, nous avons utilisé en routine à la condition suivante: HRP-streptavidine diluée à 1/500, le réactif fluorescent à 1/100 de la fluorescence bleue et 1/500 de la fluorescence verte, et le temps de réaction de 10 min. Le signal peut être rapidement vérifié avec un microscope à fluorescence inversé sans montage, avant de procéder à l'ADN-FISH.
* Remarque: Le protocole d'amplification sera la conception en fonction des principaux objectifs de l'expérience. Par exemple, pour localiser finement l'ARN cible, il est adVised d'utiliser peu de temps de réaction. En revanche, pour identifier et compter les cellules positives à faible grossissement rapidement, le temps de réaction peut être augmentée pour produire un signal lumineux. - Pour l'ADN-FISH, suivez la procédure indiquée ci-dessus, à partir de l'étape de démasquage (étape 6.2).
8. Immuno-ADN FISH
Voir la figure 1, les cases violettes pour un aperçu.
De même pour l'ARN-ADN-FISH, il est conseillé d'effectuer d'abord le immunofluorescence, car l'ADN-FISH est susceptible de dénaturer les protéines et éviter leur détection par des anticorps. La qualité du signal d'immunofluorescence est très dépendante des caractéristiques de l'anticorps, et plusieurs anticorps doit être testée lorsque cela est possible. Épitope démasquage est effectué une fois avant l'immunofluorescence pour améliorer à la fois la détection des protéines et de l'ADN-FISH. Pour conserver le signal d'immunofluorescence sur l'échantillon au cours de la procédure de l'ADN-FISH il est nécessaire de covalently lier au tissu. Nous présentons ici deux approches qui ont fourni de bons résultats dans nos mains, la détection basée post-fixation et tyramide anticorps (voir l'étape 8.5). Le choix devrait être guidé par des essais préliminaires pour chaque paire cible / anticorps.
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
1x PBS contenant 3% de sérum de chèvre normal (NGS).
PFA 2% en 1x PBS (dilution de la solution mère de 4%) - Au jour 1, les premières étapes sont identiques à l'ADN-FISH, à l'étape de démasquage (étapes 6.1 à 6.2).
- Après démasquer, incuber les sections avec 1x PBS contenant 3% NGS pendant 1 heure.
- Incuber avec l'anticorps primaire dilué dans 1 x PBS contenant 3% de NGS à 24 h. Temps d'incubation plus faible peut être utilisé pour raccourcir le protocole, mais nous avons constaté qu'une incubation pendant une nuit se traduit généralement par un signal plus fort. Jusqu'à 48-72 heures d'incubation peut être nécessaire pour les anticorps primaires faible affinité tels que IgM.
- Au jour2, se laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
- Protocole d'anticorps post-fixation: incuber 1 heure avec l'anticorps secondaire couplé à un colorant fluorescent vert, à 1/200 en 1x PBS contenant 3% de NGS. Laver trois fois 10 min avec du PBS 1X. Post-fixation est réalisée avec 2% de PFA en 1x PBS pendant 10 min *. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
Protocole de détection TSA: incuber 1 h avec l'anticorps secondaire couplé à la HRP au 1/250 dans 1 x PBS contenant 3% de NGS. Laver trois fois 10 min avec du PBS 1X. Procéder à la détection de tyramide selon les instructions du fabricant. Comme indiqué ci-dessus (étape 7.9), le réactif de dilution et le temps de réaction doit être déterminée empiriquement. Dans la plupart des cas, notre protocole a été basé sur un 1/500 dilution du substrat fluorescent et un temps de réaction de 10 min. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
* Remarque: post-fixation est une étape critique dans l'immuno-FISH, et nécessite une étude minutieuse set-up. Le plus fort de la post-fixation de lameilleur est le signal SI, et plus le rendement ADN-FISH. - Procéder à l'ADN-FISH de l'étape de l'acide acétique-méthanol (étape 6.3). Durée de l'immuno-ADN-FISH est typiquement de 3 jours, avec le premier anticorps incube pendant une nuit.
9. Double FISH ADN-ARN Couplé avec immunofluorescence
Voir la figure 1, les cases orange pour un aperçu.
ARN-FISH est réalisée en premier, suivi par immunofluorescence, et enfin ADN-FISH. Si immunofluorescence est détecté par réaction tyramide, il est essentiel d'éteindre complètement l'activité HRP de l'étape ARN-FISH avec H 2 O 2, et de vérifier que la trempe est efficace. Ceci est réalisé en utilisant une lame en tant que témoin «sans anticorps primaire".
Parce que la déshydratation à base d'éthanol est délétère pour certaines protéines de solvants sensibles, cette étape de l'ARN-FISH peut inhiber immunofluorescence. Si c'est le cas, l'ARN-FISH peut être effectuée avecvec un autre protocole, comme indiqué ci-dessous dans STPE 9.3.
- Préparer la solution suivante avant de commencer:
Formamide à 50% dans du PBS 1x contenant 2 mM RVC - Au jour 1, préparer la sonde ARN-FISH et procédez comme pour double ARN-FISH, à l'H 2 O 2 de l'étape de refroidissement (étape 7.2).
- Cas 1, la coloration par immunofluorescence fonctionne après déshydratation de l'éthanol: procéder à l'ARN-FISH, comme indiqué ci-dessus dans les étapes 7.3 à 7.9. Puis passez à l'étape 9.6 ci-dessous.
- Cas n ° 2, la coloration par immunofluorescence est empêché par traitement à l'éthanol: Placer les lames dans une chambre humide sur un dispositif de chauffage de glissière fixé à 65 ° C et incuber pendant 1,5 heure dans une solution de pré-hybridation contenant 50% de formamide, 1 x PBS, et 2 mM RVC. Videz la solution de pré-hybridation et déposer 80 ul de solution d'hybridation comme indiqué dans les étapes 7.4 et 7.5. Ensuite, passez à l'ARN-FISH hybridation et de détection Abov indiquée dans les étapes 07.06 à 07.09 (jours 2 et 3).
- Le jour 2, après ARN-FISH est terminé, procéder à l'immuno-ADN-FISH en commençant par l'étape de démasquage (voir l'étape 6.2). Ensuite, suivez le protocole d'immuno-ADN-FISH, comme indiqué ci-dessus dans les étapes 8.2 à 8.6.
10. Glisser de montage et d'imagerie
- Préparer la solution suivante avant de commencer:
Hoechst 33342 à 0,5 ug / ml dans du PBS 1x - noyaux de coloration pendant 10 min avec du DAPI ou Hoechst 33342 * à 0,5 ug / ml dans PBS 1x pour 10 min. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
Note *:. Attention Si l'un des systèmes de détection utilise un colorant bleu fluorescent, ne pas utiliser DAPI ou Hoechst. Au lieu de cela, utilisez un colorants fluorescents d'ADN avec un spectre d'émission dans la longueur d'onde rouge lointain comme Topro3. - Drainer autant de liquide que possible à partir de la diapositive. Déposer 80 ul de milieu de montage contenant un agent antidécoloration sur une extrémité du coulisseau. Couvrir les sections avec une haute qualité optiquelamelle (n ° 1.5 verre). Laissez la lamelle descendre lentement en le maintenant à une extrémité avec une pince, afin de laisser le milieu propagation de montage sur la section sans bulles.
- Sceller avec du vernis à ongles et conserver à 4 ° C dans une boîte de glissement sombre.
- L'observation directe du signal de l'ADN-FISH latentes HSV-1 génomes nécessite un grossissement de l'objectif 40X ou supérieur à immersion d'huile, avec une ouverture numérique élevée (par exemple 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) et une source de lumière d'excitation au moins équivalent à une lampe à mercure de 100 W. Nous conseillons l'aide d'un microscope à transmission à haute efficacité tels que ceux fournis par les fabricants dans les 5 dernières années (voir le tableau de l'équipement). La microscopie confocale fournit des outils pour recueillir des images avec le fond inférieur en raison de l'auto-fluorescence des tissus, tels que le sectionnement mince ou l'imagerie spectrale.
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Representative Results
Après plusieurs mois de tests, nous avons découvert que le démasquage chimique à base de chaleur latente fait HSV-1 génome disponible pour hybridation fluorescente in situ. Au cours du processus, nous avons essayé différentes procédures démasquer, et les traitements ne chaleur à base (c.-à-chauffer les sections à la température sous-ébullition dans un four à micro-ondes) comparu efficace. Nous avons ensuite testé plusieurs tampons de sel qui sont couramment utilisés en immunohistochimie (IHC) et la microscopie électronique à récupérer épitopes 31,32, y compris 0,01 M pH tampon 6.0 Citrate (que nous avons utilisé dans toutes nos études), 1x PBS, EDTA 1 mM, 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 et de l'eau distillée. Alors que les tampons EDTA ont tendance à endommager les tissus, tous les autres tampons étaient de nature à HSV-1 détection, qui apparaît comme des taches simples ou multiples dans le noyau des neurones (Figure 2A, notez que ces tissus sont très auto-fluorescent, qui apparaît dans certains images en un signal homogène à l'cytopLASM). Dans nos mains, tampon citrate semble toujours fournir un bon signal sans endommager les tissus et ainsi a été choisi pour notre protocole routine.
L'utilisation de sondes d'ADN-Cy3 directement marqués (fabriqués à partir de parties du génome de HSV-1 clone dans cosmides) fournit des résultats fiables et reproductibles. Toutefois, il exige d'avoir accès à HSV-1 bibliothèques génomiques. Nous avons donc vérifié que notre protocole serait travailler pour n'importe qui ayant accès uniquement aux sondes commerciales. Figure 2B montre HSV-1 latent détection du génome par l'ADN-FISH utilisant un pan-HSV-1 sonde biotinylé obtenu à partir d'Enzo Biochem. Dans cette optique, nous avons testé si le protocole de l'ADN-FISH pourrait être utilisée par les chercheurs en utilisant d'autres HSV-1 des modèles animaux. Figure 3A illustre la détection de HSV-1 génome sur des échantillons provenant de souris et de lapin, infectés avec trois souches couramment utilisées, SC16, 17syn + et McKrae, au stade aiguë ou latente de l'infection, dans les sections de g trijumeauAnglia. Dans tous les cas HSV-1 génomes montrent comme un signal tacheté, de la luminosité et l'intensité qui varie de cellule à cellule. Enfin, nous avons étendu l'applicabilité de notre protocole pour le cycle réplicatif du virus HSV-1, en effectuant ADN-FISH sur des tissus provenant de souris subissant une infection générale de l'herpès. Chez ces animaux, les agrégats et les grosses lumineuses de génomes de HSV-1 ont pu être détectés dans divers tissus y compris le cerveau, la moelle épinière, les yeux et les ganglions de la racine dorsale (Figure 3B).
De nombreux aspects de HSV-1 de latence sont encore mal connus, tels que la façon dont le HSV-1 expression des gènes est régulée grâce à ses interactions avec l'architecture nucléaire 33-35, si un sous-ensemble spécifique de neurones sont préférés de la cellule hôte pour l'établissement de latence et la réactivation 13 , 14,36,37, ou comment la surveillance immunitaire a lieu dans les ganglions de la fonction de la charge de virus ou de l'expression du gène de virus 9,10. Le protocole décrit ici permettra de s'attaquer à ces questions, parco-détection de HSV-1 et le génome d'ARN et de protéines virales ou cellulaires. figure 4 illustre la co-détection de HSV-1, en même temps que le génome de HSV-1 LAT ARN (figures 4A et 4C), avec des protéines cellulaires tels que la protéine centromérique CENP-A (figure 4B, si elle est suivie d'une post-fixation PFA), ou la chromatine et protéine associée PML-NB ATRX (figure 4C, si elle est suivie par une détection basée TSA). figure 4C illustre données d'une expérience de coloration triple montrant HSV-1 DNA ( rouge), sa table des adresses locales de produit d'ARN (en bleu) et une protéine de régulation de candidat, ATRX (vert). La combinaison de notre protocole ADN-FISH et la détection directe ou enzymatique à base d'ARN-FISH et le signal d'immunofluorescence, représentent un ensemble polyvalent et largement applicable des outils pour explorer in situ la relation virus-hôte, au niveau cellulaire et tissulaire.
Figure 1. Présentation du protocole ADN-FISH et l'intégration dans la coloration de cibles multiples. Les principales étapes du protocole ADN-FISH et la connexion avec les protocoles de co-détection d'ARN et de protéines sont représentés schématiquement. Les étapes critiques sont indiqués par des panneaux d'avertissement. Principales étapes ADN-FISH sont réhydratation, perméabilisation, traitement de démasquage de l'acide acétique et méthanol-hybridation. Dans la procédure, démasquage est une étape cruciale, qui doit être soigneusement mis en place et respecté. Les deux autres étapes critiques dépendent des procédures techniques sont compatibles avec les anticorps utilisés pour l'immunodétection. Ces auront un impact sur la procédure ARN-FISH pour la coloration triple, et sur la stratégie de détection des immunofluorescence. Clécher ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Détection de HSV-1 génome latent après démasquage antigénique. Sections A. TG de 28 souris infectées dpi ont été préparés comme indiqué dans la section de protocole. TG sections ont été traitées pour l'ADN-FISH, comme indiqué à la figure 1, et le démasquage basé chaleur était effectuer en utilisant le tampon indiqué sur le dessus de chaque image. Le contour du noyau est représentée comme une ligne en pointillés. Le signal observé dans le cytoplasme est due à l'auto-fluorescence des tissus. Sections B. TG préparées comme dans A. ont été traitées pour l'ADN-FISH utilisant un biotinylé HSV-1 sonde obtenu dans le commerce. La sonde hybridée a été détectée à l'aide d'un TSA et SUBSTRA marqué Alexa Fluorte (vert). Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu). Une image recadrée élargie est affichée dans la colonne de droite. Deux types de HSV-1 sont présentés génome schéma pour illustrer une caractéristique de HSV-1 localisation intranucléaire. Toutes les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. La détection de HSV-1 dans le génome de plusieurs modèles. A. Le protocole ADN-FISH norme a été appliquée à des sections TG d'origines diverses. SC16 souris infectées sections TG ont été préparés comme décrit dans la section de protocole. + Sections de souris infectées 17syn et sections de lapin infectées McKrae ont été fournis par colrateurs. Les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 5 um. souris infectées B. SC16 subissant une infection générale de l'herpès ont été sacrifiés à 6 dpi et plusieurs tissus ont été prélevés, congelés et sectionnés. Le protocole de l'ADN-FISH norme a été appliquée, comme indiqué à la figure 1. Les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Codétection de HSV-1 ADN et ARN et des protéines sur des sections simples génomique. SC16 sections infectés de souris TG ont été traitées pour FISH ARN-ADN, ADN immuno-FISH ou le triple staining comme indiqué à la figure 1. A. ARN-ADN FISH utilisant un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée (rouge) et un biotinylé ribo-sonde d'ARN-LAT (vert). Sonde d'ARN LAT a été détectée en utilisant TSA et un substrat marqué Alexa Fluor 488. Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu) B. Immuno-ADN FISH utilisant un anticorps anti-CENP-A anticorps (vert) et un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée (rouge). Les anticorps étaient 10min post-fixe avec 1% de PFA dans du PBS avant d'exécuter l'ADN-FISH. Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu). C. Immuno-ARN-ADN-FISH en utilisant un ARN-LAT biotinylé ribo-sonde (bleu), un anticorps anti-ATRX (vert) et un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée ( rouge). La sonde d'ARN LAT a été détectée en utilisant la détection de tyramide et un substrat marqué par fluorescence bleue, et l'anti-ATRX et des anticorps secondaires ont été détectés par la détection de tyramide et un substrat marqué par fluorescence verte. Toutes les images ont été recueillies sur un grand champ épifluorescence microscope. La barre d'échelle est de 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Le protocole décrit ici permet la détection de HSV-1 génome latent dans les neurones de coupes de tissus neuronaux de souris. Notre compréhension des voies de régulation de l'expression des gènes viraux a été limitée par l'absence de méthode pour détecter le HSV-1 de l'ADN génomique in situ dans les tissus neuronaux. Informations sur le génome nombre de copies et la proportion de neurones infectés provenaient principalement de l'analyse par PCR sur les neurones dissociés 11,12. À élucider le rôle de l'architecture nucléaire de la cellule hôte à HSV-1 de latence, nous avons mis à déterminer la localisation des latente HSV-1 par génome ADN-FISH, dans le noyau des neurones de souris infectées de façon latente. Nous avons testé une grande variété de protocoles ADN-FISH et de soins de tissus, et trouvé "démasquage de l'épitope" à base de chaleur comme une étape essentielle de la détection de l'ADN-FISH virus. Un tel traitement est couramment utilisée pour révéler l'épitope de la protéine à l'intérieur des sections de paraffine embarqués pour l'immunohistochimie. Bien qu'il soit presque universellement utiliséen pathologie, il n'est pas utilisé de façon classique dans l'ADN-FISH. Alors que de nombreuses études soutiennent que cette technique préserve la morphologie des tissus à l'échelle de la microscopie optique, l'utilisateur final doit inclure des contrôles appropriés afin de valider ce point dans son système biologique particulier 38. Dans nos mains, d'autres procédures démasquer tels que les traitements de la protéase ne permettent pas de HSV-1 détection de l'ADN, tout en démasquant basé chaleur utilisant différents tampons toujours fait HSV-1 ADN génomique latente à la disposition de sondes FISH (figure 2). Démasquage basé chaleur est pensé pour éliminer une partie des liaisons transversales entre les protéines, ce qui indique que HSV-1 est étroitement associée ADN aux protéines. Ceci est cohérent avec la démonstration récente que le génome de HSV-1 latent et lytique est associée à des histones cellulaires 2,39,40. Parce que les génomes d'autres herpèsvirus sont associés avec les histones: VZV 41; HCMV 42,43; EBV 44-46; KHSV 47-49, la protocol décrit ici peut être appliquée à la détection des génomes de ces virus de l'herpès, ainsi que beaucoup d'autres, mais probablement aussi de détecter d'autres virus nucléaires persistants tels que les papillomavirus, virus de l'hépatite B, et les rétrovirus. Fait intéressant, l'utilisation du protocole actuel sur différents paramètres expérimentaux (tissus des souris et des lapins infectés, sections préparées par des laboratoires différents, et l'utilisation de différentes souches de HSV-1) n'a pas besoin d'installation supplémentaire pour la détection de HSV-1 génome. Pour appliquer le protocole à d'autres systèmes biologiques, nous prévoyons que les techniques de récupération de la procédure de fixation et d'antigènes pourraient être des domaines de développement.
L'approche classique pour évaluer la latence de HSV-1 est de détecter la présence d'ARN LAT combinée à l'absence de détection de produits de gènes du cycle lytique dans les neurones. Cependant, des études basées sur la PCR in situ et qPCR sur les neurones isolés à partir de modèles de souris de latence indiquent que le nombre de neu infectéerons (c.-à-HSV-1 génome neurones positifs) est de deux à trois reprises plus élevé que la LAT neurones exprimant 12,18. En utilisant l'ARN-ADN-FISH, il a été confirmé que, dans notre modèle de souris de 20-30% de HSV-1 ADN neurones positifs sont également positives pour l'ARN LAT 22. L'utilisation de l'ADN-FISH et co-détection de l'ADN viral et cellulaire, ARN et protéines composants fournira un nouvel ensemble d'outils pour caractériser les voies de régulation HSV-1 l'expression des gènes de latence. De plus, la latence de HSV-1 est connu pour être un phénomène hétérogène car il a lieu dans une grande variété de sous-types de neurones, et il est caractérisé par une hétérogénéité dans le nombre de copies du génome et l'expression de l'ARN LAT 12,22. Un avantage majeur de l'ADN-FISH est de fournir un accès à l'analyse de cellules uniques à l'intérieur de la complexité du tissu, et donc de tenir compte de l'hétérogénéité du HSV-1 de latence. Par exemple, nous avons lié l'expression de l'ARN LAT avec l'abondance de génome de HSV-1 dans des neurones individuels 22. Dans annoncecondition, cette technique peut également être appliquée à l'évaluation de l'état de génomes viraux en utilisant des modèles de culture cellulaire in vitro ainsi que des modèles animaux en utilisant ganglion humain implantées dans des souris SCID 13 à 17. Une application future de notre protocole ADN-FISH sera la possibilité de caractériser HSV-1 de latence par le nombre de HSV-1 génome neurones positifs. Cela pourrait être réalisé en utilisant des sondes biotinylés et la détection basée sur tyramide, qui produit un signal suffisamment fort pour être détecté à faible grossissement. Une telle application est rendue possible par la très faible bruit de fond généré par le système de détection de tyramide. Le Cy3 marqué HSV-1 sondes décrites dans ce protocole peuvent être utilisés aussi bien mais nécessite l'observation à plus fort grossissement, ce qui serait très fastidieux à lire grand nombre de sections.
Peut-être les principales qualités du protocole ADN-FISH décrit ici sont la polyvalence et la robustesse, ce qui le rend compatible avec til co-détection de l'ARN et des protéines. En effet, nous avons constaté que tous les traitements nécessaires à la détection de l'ARN ou les protéines, ou les deux, ne modifient pas la qualité et la luminosité du signal ADN-FISH. ARN-FISH peut être effectuée avant l'ADN-FISH, en utilisant soit la déshydratation de l'éthanol ou pré-hybridation à base de formamide. Nous vous recommandons le protocole à base d'éthanol, ce qui entraîne moins de fond avec des réactifs de détection TSA. Le protocole sur la base du formamide doit être utilisé lorsque l'ARN-FISH est suivie par immunofluorescence avec des anticorps qui ne fonctionnent pas sur des échantillons d'éthanol traité. Lors de la réalisation d'immuno-ADN-FISH, la liaison covalente du signal d'immunofluorescence peut être effectuée par détection à base tyramide-(qui amplifie le signal), ou par post-fixation de préserver les détails de la structure des protéines de localisation. Pour optimiser post-fixation, le protocole d'immunofluorescence doit d'abord être mis en place pour obtenir un signal fort, et le plus fort procédure de post-fixation permettant un bon signal de l'ADN-FISH doit être déterminée. Cette will fournir une gamme de conditions dans lesquelles le meilleur compromis entre la préservation de l'immunofluorescence et le signal ADN-FISH peut être obtenue. Comme pour toute autre méthode de détection à base d'anticorps, la qualité du signal et le meilleur protocole est très dépendante de l'anticorps lui-même. Notre protocole ne fait pas exception et nous avons observé que certains anticorps fonctionnent très bien avec tout le protocole décrit ici (par exemple anti-PML mAb clone 36.1) et quelques autres ont besoin des essais importants. Dans l'ensemble, nous avons détecté avec succès plus de notre cible visée (une exception était protéine SP100), y compris cytoplasmiques et membranaires des protéines, et les protéines nucléaires associés à divers domaines nucléaires (chromatine HP1, centromères-CENP-A, CENP-B-, PML nucléaires corps-PML, Daxx, ATRX-). Sur la base de nos tests, nous prévoyons que notre protocole ADN-FISH être compatible avec le immuno-codétection de constructions rapporteurs (β-galactosidase, protéines fluorescentes ...) qui sont couramment utilisés pour analyser promoter l'activité à partir de génomes viraux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions N. Sawtell (Hospital Medical Center de Cincinnati Children, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (Université de Cambridge, Royaume-Uni) et James Hill (LSU Health Sciences Center, La Nouvelle-Orléans, États-Unis) pour fournir des échantillons de HSV-1 les souris et les lapins infectés, respectivement, et des réactifs; H. Masumoto (Kazusa Institut de recherche de l'ADN, Chiba, Japon) et S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, France) pour des discussions utiles.
Ce travail a été financé par des subventions du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programme ATIP, PL, http://www.cnrs.fr), l'Agence nationale française de recherche (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), la Fondation FINOVI ( http://www.finovi.org/:fr:start ), le Labex DEVweCAN (ANR-10-61-labx ) de l'Université de Lyon, dans le programme "Investissements d'Avenir »(ANR-11-IDEX-0007) exploité par l'ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le cancer (ARC-7979 et ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer le (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), et l'INCa (programme EpiPro, http://www.e -cancer.fr ). FC et PL sont des chercheurs du CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
References
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