Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

फ्लोरिसेंट द्वारा neuronal ऊतकों में एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम और देखिए की जांच सीटू संकरण Immunostaining के साथ संयुक्त

Published: January 23, 2014 doi: 10.3791/51091
Automatic Translation
1,2,5, 4, 4, 1,2,3
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

Summary

हम पशु मॉडल के ऊतक वर्गों के भीतर एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम का पता लगाने के लिए सीटू संकरण प्रोटोकॉल में एक फ्लोरोसेंट की स्थापना की. इस प्रोटोकॉल वायरल जीनोम की codetection अपने आरएनए उत्पादों, और एकल कक्षों के भीतर वायरल या सेलुलर प्रोटीन से संक्रमण की प्रक्रिया का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है.

Abstract

एक जीन की एकल कोशिका codetection अपने उत्पाद शाही सेना और सेलुलर नियामक प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति विनियमन अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में एक चुनौती है, विशेष रूप से परमाणु नकल लगातार डीएनए वायरस के लिए अपने अध्ययन के लिए पशु मॉडल शामिल है. दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) परिधीय न्यूरॉन्स में एक जीवन भर अव्यक्त संक्रमण स्थापित करता है. अव्यक्त वायरस यह reactivates और एक नया ददहा प्रकरण लाती है जहाँ से जलाशय के रूप में कार्य करता है. एचएसवी -1 विलंबता की कोशिका जीव विज्ञान के कारण पशु मॉडल में बगल में एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के तरीकों की कमी के कारण भाग में, खराब समझ बनी हुई है. हम दृष्टिकोण कुशलता से संक्रमित पशु मॉडल से neuronal ऊतकों के वर्गों के भीतर कम प्रतिलिपि वायरल जीनोम का पता लगाने स्वस्थानी संकरण (मछली) में एक डीएनए फ्लोरोसेंट वर्णन. विधि गर्मी आधारित प्रतिजन unmasking पर निर्भर करता है, और सीधे लेबल घर का बना डीएनए जांच, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच. हम एक ट्रिपल stai विकसितनिंग दृष्टिकोण, प्रत्येक धुंधला आवश्यकता को समायोजित करने के लिए peroxidase आधारित संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर, आरएनए मछली और immunofluorescence के साथ डीएनए मछली के संयोजन. एक बड़ा सुधार confocal माइक्रोस्कोपी और व्यापक क्षेत्र पारंपरिक epifluorescence द्वारा उच्च संकल्प पर imaged किया जा सकता है कि 10 माइक्रोन ऊतक वर्गों, कम पृष्ठभूमि संकेतों के भीतर प्राप्त करने की क्षमता है. इसके अतिरिक्त, ट्रिपल धुंधला सेलुलर और वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ काम किया. पूरा प्रोटोकॉल ऊतक के भीतर एंटीबॉडी और जांच पैठ को समायोजित करने के लिए 2.5 दिन लेता है.

Introduction

दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) इसे दोहराने और प्रसार करने के लिए समय - समय reactivates जिसमें से परिधीय तंत्रिका तंत्र, के त्रिपृष्ठी ganglia (टीजी) के न्यूरॉन्स में एक लंबी अवधि के अव्यक्त संक्रमण की स्थापना, एक लगातार मानव neurotropic वायरस है. एचएसवी -1 जीनोम यह मेजबान सेल जीनोम 1,2 में एकीकृत नहीं है जो के रूप में MULTICOPY chromatinized plasmids बनी हुई है, जहां मेजबान न्यूरॉन के नाभिक में एक 150 केबी dsDNA स्थानीयकृत है. विलंबता के दौरान एचएसवी -1 replicative चक्र आनुवंशिक कार्यक्रम जोरदार दमित है, और जीन अभिव्यक्ति विलंबता स्थापना से पुनर्सक्रियन 3 की दीक्षा के लिए विलंबता जुड़े प्रतिलेख (LAT) लोकस, तक ही सीमित है. अक्षां एक एक प्रमुख 2 केबी स्थिर कमंद में संसाधित लंबे 8.5 केबी noncoding शाही सेना, और कई miRNA 4-7 पैदा करता है. एचएसवी -1 विलंबता इस प्रकार वायरल जीनोमिक डीएनए, अक्षां शाही सेना, और detectable replicative चक्र प्रोटीन के अभाव की उपस्थिति की विशेषता है.

"ontent> पशु मॉडल, मुख्य रूप से माउस और खरगोश, मानव में विलंब के कई सुविधाओं recapitulating प्रयोगात्मक मॉडल हैं. उन मॉडलों के मुख्य हितों की है कि वे असुरक्षित मेजबानों में एचएसवी -1 विलंबता की शारीरिक पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति है. पिछले दशकों में , जैसे आनुवंशिक रूप से संशोधित वायरस और चूहों के रूप में कई प्रयोगात्मक उपकरण, शरीर क्रिया विज्ञान, जेनेटिक्स, और जानवरों के ऊतकों से एचएसवी -1 विलंबता, सेलुलर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. अब तक, वायरल जीनोमिक डीएनए का पता चला और मात्रा निर्धारित दक्षिणी धब्बा द्वारा किया गया था और अलग TGS से qPCR. हालांकि, वर्तमान में ऊतक वर्गों 8. नतीजतन, विलंबता नियमित स्वस्थानी संकरण में शाही सेना द्वारा LAT आरएनए का पता लगाने के बजाय के माध्यम से ऊतकीय वर्गों पर मूल्यांकन किया है पर स्वस्थानी संकरण में से एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के लिए उपलब्ध कोई विधि नहीं है वायरल जीनोम का पता लगाने. यह वायरल जीनोम की उपस्थिति, थी पर आधारित संक्रमित कोशिकाओं को चिह्नित करना असंभव हो गया है क्योंकितकनीकी सीमा इस तरह के वायरल जीनोम और सेलुलर और वायरल जीन अभिव्यक्ति या मेजबान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 9,10 के बीच रिश्ते के रूप में मेजबान वायरस बातचीत के कई पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए एक बड़ी खामी रही है.

सबसे महत्वपूर्ण बात है, अव्यक्त संक्रमण की सेल करने वाली सेल विविधता अपेक्षाकृत बेरोज़गार बना रहता है और चूहों में और SCID चूहों 11-17 में प्रत्यारोपित मानव संवेदी नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में विलंबता की एक प्रमुख विशेषता होना दिखाया गया है. आमतौर पर, यह सेल प्रति एचएसवी -1 जीनोम प्रतिलिपि संख्या 5 से कई सैकड़ों तक की हो सकती है कि qPCR द्वारा दिखाया गया था. अक्षां विलंबता और पुनर्सक्रियन का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में प्रकट होता है, पृथक न्यूरॉन्स पर और सीटू पीसीआर में qPCR डेटा गुप्त रूप से संक्रमित न्यूरॉन्स का केवल एक उप, के रूप में कम के रूप में 30%, अक्षां ठिकाना 11,12,18-21 व्यक्त करता है कि संकेत दिया. कैसे मेजबान सेल और वायरस विलंबता स्थापना पर ऊतक प्रभाव के भीतर सेलुलर पर्यावरण औरवायरल जीन अभिव्यक्ति अस्पष्ट बनी हुई है. यहाँ हम जानवर neuronal ऊतक वर्गों के भीतर कम प्रतिलिपि एचएसवी -1 जीनोमिक डीएनए के कुशल पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण (मछली) विधि में एक मजबूत फ्लोरोसेंट वर्णन. इस विधि से डिजाइन और मेजबान सेल के अंदर परमाणु के घटकों 22 के साथ वायरल जीनोम की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है कि उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए पहुँच पाने के लिए हमारे द्वारा इस्तेमाल किया गया है. इसके अतिरिक्त, हम वायरल जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कि वायरस मेजबान बातचीत का वर्णन करने के लिए एक अनूठा उपकरण है जो आरएनए और प्रोटीन के साथ वायरल डीएनए के साथ पता लगाने के लिए एक से अधिक धुंधला विधि का वर्णन. विधि को भी इस तरह के वर्गों की एक बड़ी संख्या में संक्रमित न्यूरॉन्स बढ़ाता रूप एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम का पता लगाने की आवश्यकता विश्लेषण की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण कदम के संकरण के लिए वायरल डीएनए सुलभ बनाने के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति उपचार लागू करने के लिए है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल भी पता लगाने के लिए कुशल हो सकता हैजानवरों के ऊतकों के भीतर पारंपरिक डीएनए मछली दृष्टिकोण से वर्तमान में पता लगाने योग्य नहीं हैं जो अन्य dsDNA वायरस, के.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस विधि में पहले 22 प्रकाशित एक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. Ish, यदि और मछली पर सामान्य पृष्ठभूमि और पारंपरिक हेरफेर के वर्णन के लिए, हम निम्नलिखित उपलब्ध साहित्य 23 सुझाव है.

1. पशु संक्रमण

प्रयोगात्मक जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं विजन फॉर रिसर्च एसोसिएशन और नेत्र विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में पशुओं के उपयोग के लिए (ARVO) बयान से नैतिक मुद्दों को पुष्टि, और यूरोपीय समुदाय के अनुसार UPR-3296-CNRS की स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया परिषद निर्देशक 86/609/EEC. सभी जानवरों को भोजन और पानी के लिए असीमित उपयोग प्राप्त किया.

एचएसवी -1 नीचे वर्णित के साथ माउस संक्रमण की विधि पहले 24-26 प्रकाशित अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है.

  1. शुरू करने से पहले तैयार करने के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार:

    एचएसवी -1 वायरस शेयर समाधान
    समाधान anesthetizing - Ketaminई 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine-10 मिलीग्राम / किग्रा
  2. 0.1 μl / सेक पहुंचाने एक microsyringe पंप ​​डिवाइस से जुड़ा एक 5 μl गिलास microsyringe में वायरस की 1 μl (10 6 pfu) को ले लो ध्यान दें:. लाल तेल के बीच सीमा को देखने के लिए एक फिनोल लाल मुक्त माध्यम में वायरस स्टॉक Resuspend केशिका और वायरस के समाधान में मौजूद है और वायरस टीका के स्थल पर हवा इंजेक्शन से बचने के लिए.
  3. इसके पीछे चेहरे पर anesthetized माउस (Ketamine-100 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine-10 मिलीग्राम / किग्रा) निर्धारित करना.
  4. एक दूरबीन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत anesthetized माउस सिर की स्थिति और mucocutaneous सीमा पर छोड़ दिया ऊपरी होंठ के subepithelial परत में सुई डालने. 5 सेकंड प्रति 0.5 μl की रफ्तार से दो कदम (दो बार 0.5 μl) में वायरस समाधान इंजेक्षन नोट:. इंजेक्शन के स्थल पर अवशोषित करने के लिए वायरल निलंबन सक्षम करने के लिए, दो 0.5 μl इंजेक्शन के बीच एक 10 सेकंड ठहराव का सम्मान करें.
  5. में माउस रखेंजागरण तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर.
  6. आवश्यक समय के लिए ठीक करने के लिए पशु सुविधाओं में माउस छोड़ दो नोट:. माउस मॉडल में, एचएसवी -1 टीका के स्थल पर और सहित कई neuronal ऊतकों के भीतर कम से कम 10 दिनों तक रहता है जो तीव्र संक्रमण कहा जाता है एक प्राथमिक संक्रमण, लाती TGS, टीका साइट के आधार पर बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी), और पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी). प्राथमिक संक्रमण के लक्षण उत्तरोत्तर गायब हो और विलंबता पूरी तरह से आगे के बारे में 28-30 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) की स्थापना पर विचार कर रहा है. Neuronal ऊतकों तीव्र संक्रमण पर अध्ययन के लिए 4 डीपीआई से आमतौर पर काटा, और विलंबता पढ़ाई के लिए 28 डीपीआई से किया जा सकता है.

2. माउस छिड़काव तय

  1. शारीरिक खारा बफर के 50ml: शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार

    1x पीबीएस के 60 मिलीलीटर
    1x पीबीएस में हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde की 150 मिलीलीटर
    1x पीबीएस में 20% sucrose के 60 मिलीग्राम. <br />
  2. छिड़काव टयूबिंग तैयार: एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है जो एक केशिका, सुई कनेक्ट.
  3. (Srep 1.2) जैसा कि ऊपर वर्णित माउस anesthetize और पिन के साथ चार पैरों से जुड़ी एक विच्छेदन ट्रे, पर अपनी पीठ पर लेट गया.
  4. का प्रयोग कैंची * गले तक पेट से त्वचा में कटौती. अंगों को कवर पतली ऊतक परत आंसू दूर. उरोस्थि के एक तरफ की पसलियों को काटने से रिब पिंजरे खोलें. बंद फाड़ से त्वचा निकालें. एक दूसरे से दूर दिल प्रकट करने के लिए रिब पिंजरे के दाईं और बाईं भागों हटो नोट:. छिड़कना निर्धारण असंभव कर देगा जो हिम्मत, फेफड़ों और बड़े जहाजों (मन्या धमनियों और कंठ नसों), काटकर अलग कर देना करने के लिए नहीं ध्यान दे.
  5. * बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें. कैंची के साथ सही आलिंद काटकर अलग कर देना. दिल के माध्यम से रक्त वाहिकाओं में शारीरिक खारा की 20 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा Exsanguination के साथ आगे बढ़ें. ट्रे में रक्त का प्रवाह करते हैं. नहींते: इस प्रक्रिया के दौरान, दिल के दूसरे पक्ष के माध्यम से पंचर नहीं ध्यान देते हैं.
  6. 15 मिनट * दौरान 1x पीबीएस में 4% पीएफए ​​के 150 मिलीलीटर के साथ छिड़कना (चेतावनी: पीएफए ​​विषाक्त है, धूआं हुड के तहत हेरफेर). 6 मिनट के दौरान 1x पीबीएस में 20% sucrose के 60 मिलीलीटर छिड़कना. . उस अवस्था में माउस टीजी कटाई नोट के लिए तैयार है: 10 मिलीग्राम / मिनट के लिए पंप सेट. एक अच्छा छिड़काव माउस पूंछ ऊपर stiffens जब, ध्यान देने योग्य है तो फिर से गिर उठा.

3. टीजी कटाई

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    1x पीबीएस में 20% sucrose
  2. गर्दन के स्तर पर सिर काट दिया. नाक गुहा प्रकट करने के क्रम में सिर्फ कृन्तक पीछे नाक की टिप कट. कैंची से दो में तालू काटकर अलग कर देना और तालु के प्रत्येक पक्ष दूर स्थानांतरित नोट:. Tgs, बस तालू के नीचे दिखाई देता है दो सफेद और आयताकार सही पर स्थित लंबाई में 2-3 मिमी की जनता और रूपओर छोड़ दिया और trigeminal तंत्रिका से जुड़े.
  3. Brainstem से tgs जारी करने के लिए TGS के प्रत्येक पक्ष पर trigeminal तंत्रिका शाखाओं में कटौती. शल्य सरौता के साथ tgs निकालें और 24 घंटे के लिए नोट एक 20% sucrose बाँझ समाधान में उन्हें रखने के लिए:. का प्रयोग करें बाएँ और दाएँ TGS के लिए दो अलग प्राप्तकर्ताओं छोड़ दिया, टीजी (संक्रमित) और सही टीजी (नहीं या के बीच भ्रम की स्थिति से बचने के लिए कमजोर) संक्रमित. एम्बेड करने से पहले 24 घंटे के लिए 1x पीबीएस में 20% sucrose में tgs सेते हैं.
  4. सेल्सियस -80 पर मध्यम और फ्रीज embedding cryosectioning में एक ही ब्लॉक में एम्बेड tgs
  5. स्टोर ब्लॉक -80 डिग्री सेल्सियस सेक्शनिंग जब तक.

4. Cryosection तैयारी

  1. पर 10 माइक्रोन वर्गों के रूप में tgs लंबेबल कटौती एक -20 डिग्री सेल्सियस cryostat, और थोड़ा गर्म (30 डिग्री सेल्सियस) Superfrost स्लाइड्स उन पर जगह है. . स्लाइस 5-10 मिनट तो -80 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक फ्रीज और दुकान के लिए सूखी हैं: अप करने के लिए 4-5 वर्गों पीएलए हो सकता हैवर्गों के बड़ी संख्या में एक ही समय में संसाधित किया जा रहा है, एक एकल स्लाइड पर ced. हम पालन के रूप में आगे बढ़ना: धारावाहिक वर्गों इतने पर ए 1, बी 1 लेबल स्लाइड्स के 3 श्रृंखला पर जमा है, और सी 1, तो ए 2, बी 2, सी 2 और कर रहे हैं. इसलिए, प्रत्येक स्लाइड श्रृंखला (ए, बी, और सी) (सीटू पीसीआर, एलसीएम में, स्वस्थानी संकरण, मछली में) अलग धुंधला के लिए कार्रवाई की जा सकती है और विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त डेटा एक ही नंबर ले जाने स्लाइड्स अनुरूप जानते हुए भी कि तुलना की जा सकती टीजी के एक ही क्षेत्र के लिए.

5. एचएसवी -1 जांच लेबल

प्रोटोकॉल डीएनए मछली द्वारा एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के लिए इसके बाद वर्णित सफलतापूर्वक जांच के दो प्रकार के साथ प्रयोग किया गया है. पहली उच्च बढ़ाई फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से व्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर परमाणु संगठन के ठीक विश्लेषण, के लिए उपयुक्त है जो एक घर का बना Cy3 लेबल फ्लोरोसेंट जांच है. दूसरी गठबंधन किया जा सकता है जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध biotinylated जांच, हैएक उज्ज्वल संकेत प्रदान करने के लिए peroxidase आधारित संकेत प्रवर्धन के साथ डी. बाद के पूरे खंड में कम बढ़ाई न्यूरॉन्स युक्त वायरस की पहचान और मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त है, और एचएसवी -1 जीनोम पैटर्न के विश्लेषण के लिए. अंत उपयोगकर्ताओं को अपने अध्ययन का लक्ष्य सबसे अच्छा फिट बैठता है जो दृष्टिकोण का मूल्यांकन करना चाहिए. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच अभिकर्मक खंड में सूचीबद्ध है, और घर में बने जांच की तैयारी में नीचे वर्णित है.

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    एचएसवी -1 जीनोम युक्त वैक्टर (चरण 1 देखें)
    70% इथेनॉल, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड.
  2. . एचएसवी -1 जीनोम के 30 केबी अंश युक्त cosmids (संख्या 14, 28 cosmids, और 56 बड़े वैक्टर के लिए समर्पित शुद्धि स्तंभों का उपयोग संदर्भ 20 में वर्णित तैयार करें नोट: इस तरह के जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम के रूप में एचएसवी -1 जीनोम, जिसमें पुस्तकालयों के अन्य प्रकार होना चाहिए जब तक कि जांच अल शामिल किया गया है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कामपर्याप्त संकेत 27-29 निर्माण करने के लिए एचएसवी -1 जीनोम का नुस्खा: भाग. हमारे हाथ में, cosmid वेक्टर रीढ़ की हड्डी से बना जांच किसी भी संकेत उत्पादन नहीं किया था, और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. एचएसवी -1 अनुक्रम युक्त इस प्रकार पूरे cosmid वैक्टर हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. यह एचएसवी -1 अनुक्रम में कटौती और जांच को तैयार करने के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए भी संभव है.
  3. . लेबल निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार एक निक अनुवाद किट का उपयोग कर Cy3-dCTP साथ प्रत्येक cosmid की 2 ग्राम नोट: केवल Cy3-dCTP और कोई unlabeled dCTP युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ लेबलिंग प्रदर्शन करना.
  4. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और ताप में 0.5 एम EDTA के 3 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. बर्फ पर शांत.
  5. एक G50 जेल बहिष्कार minicolumn पर जांच शुद्ध. जांच के लिए सामन शुक्राणु डीएनए के 150 माइक्रोग्राम जोड़ें और इथेनॉल तेज़ी से जांच वेग. डीएनए गोली कारण Cy3 समावेश करने के लिए गुलाबी होना चाहिए. 70% इथेनॉल के साथ गोली धोने और जितना इथेनॉल हटानेएक विंदुक के साथ संभव के रूप में. गोली सूखी मत देना.
  6. विआयनीकृत formamide के 100 μl के साथ गोली भंग (चेतावनी: formamide विषाक्त है धूआं हुड के तहत हेरफेर.). जांच एकाग्रता मज़बूती से इस बिंदु पर मापा नहीं जा सकता. पाठ के भीतर उल्लेख जांच मात्रा की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया टेम्पलेट डीएनए की मात्रा को देखें. प्रोटोकॉल डीएनए टेम्पलेट और formamide के 100 μl के 2 ग्राम के आधार पर किया जा रहा है, यह 20 एनजी / μl माना जाता है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर लेबल जांच के लिए बड़ी मात्रा में तैयार और कई महीनों के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है.

6. डीएनए मछली

चित्रा 1 डीएनए मछली प्रोटोकॉल, और कैसे प्रोटोकॉल 7-9 में वर्णित के रूप में, आरएनए और प्रोटीन codetect के लिए एक से अधिक धुंधला प्रयोग के हिस्से के रूप में डीएनए मछली प्रदर्शन करने का मुख्य चरण का अवलोकन से पता चलता है.

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100
    2x एसएससी और 0.2x एसएससी बफर
    100 मिमी पीएच 6.0 साइट्रेट बफर (10x शेयर समाधान) और 10 मिमी पीएच 6.0 साइट्रेट बफर (काम कर समाधान)
    2x संकरण बफर (प्रोटोकॉल 4 देखें)
  2. 1 दिन, कमरे के तापमान पर एक स्लाइड धारक पर स्लाइड जगह है, और वर्गों 10 मिनट के लिए सूखी हैं. एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ वर्गों सर्कल. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में वर्गों rehydrate. ऊतक permeabilize करने 1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ वर्गों 20 मिनट सेते हैं. 3X धो 10 2x एसएससी के साथ मिनट, और unmasking बफर गरम किया जाता है जब तक (नीचे देखें) 2x एसएससी में रहते हैं.
  3. Unmasking के लिए, 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) के 200 मिलीलीटर के साथ भरा एक गिलास स्लाइड ट्रे (20 स्लाइड्स क्षमता) तैयार करते हैं. आसुत पानी की 500 मिलीलीटर के साथ भरा एक बड़े कंटेनर में ट्रे जगह. यह सेटिंग ताप दालों की एक बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. ट्रे में स्लाइड्स रखने से पहले, बू तक माइक्रोवेव ओवन में बफर पहले से गरमffer (800 डब्ल्यू में 8 मिनट के आसपास) उबलते तक पहुँचता है.
  4. Preheated साइट्रेट बफर युक्त ट्रे में स्लाइड्स प्लेस, और वे पूरी तरह से बफर के साथ आते हैं कि सत्यापित. गर्मी के बारे में 20 सेकंड के लिए बफर उबलते जब तक. सावधानी, ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है, जो फोड़ा अधिक बफर मत देना. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत हो जाओ. हीटिंग चक्र 6x (7 हीटिंग चक्र कुल) * दोहराएँ. 2 मिनट शांत हो जाओ और 5min के लिए 2x एसएससी में स्लाइड्स स्थानांतरण.
    * नोट: यह सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है. हीटिंग के चक्र का इष्टतम संख्या और अवधि अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए, और ऊतक के प्रकार या प्रयोग किया जांच के प्रकार पर भिन्न हो सकते हैं. माइक्रोवेव, ट्रे, कंटेनर और कंटेनर में ट्रे और पानी में बफर की मात्रा unmasking के reproducibility के लिए समान रखा जाना चाहिए. अत्यधिक उबलते ऊतक नुकसान और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में हो सकता है. प्रत्येक हीटिंग नाड़ी के लिए, उबलते की उपस्थिति ध्यान से देखा, और गर्मी हैआईएनजी उबलते के पहले संकेत में बंद होना चाहिए. एक बार की स्थापना की, unmasking मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य. चित्रा 2A unmasking स्थितियां आगे का पता लगाया जा सकता है कि यह दर्शाता है, एचएसवी -1 जीनोम अलग buffers के साथ अनमास्किंग से पता लगाया जा सकता है कि पता चलता है प्रकट होता है. साइट्रेट आधारित unmasking लगातार विभिन्न प्रयोगशाला और पशु मॉडल से वर्गों के साथ, अच्छा मछली संकेत, और ऊतक संरक्षण प्रदान करने के लिए पाया गया था.
  5. एसिटिक एसिड: एक मेथनॉल में स्लाइड्स सेते 15 मिनट के लिए पीबीएस मिक्स (03:01:04), तो एक मेथनॉल में: 15 मिनट (सावधानी के लिए एसिटिक एसिड मिश्रण (3:1): एसिटिक एसिड संक्षारक है धूआं तहत हेरफेर. डाकू और पर्याप्त सुरक्षा का उपयोग करें.) सही उपयोग करने से पहले इस समाधान तैयार करें.
  6. , 70% में लगातार 10 मिनट ऊष्मायन के माध्यम से खंड निर्जलीकरण तो 100% इथेनॉल में 10 मिनट 2x. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करते हैं. जांच कर रही जब तक सूखा रखें.
  7. पालन ​​के रूप में जांच कर समाधान तैयार: अग्रिम में 2x संकरण बफर सह की एक 20 मिलीलीटर स्टॉक तैयार20% dextran सल्फेट (मेगावाट 500,000), 2x Denhardt समाधान, 4x एसएससी * ntaining. -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 microtubes में μl, और दुकान के रूप में समाधान विभाज्य 1 स्लाइड (x 50 मिमी 22 मिमी coverslip) के लिए, एचएसवी -1 Cy3 लेबल जांच (प्रत्येक cosmid के लिए जांच की 30 एनजी) के 90 एनजी मिश्रण, और formamide साथ 40 μl के लिए मात्रा को पूरा करें. 2x संकरण बफर के 40 μl जोड़ें. ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से मिलाएं.
    * नोट:, 2x संकरण बफर तैयार आसुत पानी की 10 मिलीलीटर में मेगावाट 500,000 dextran सल्फेट की 4 जी मिश्रण करने के लिए. यह 70 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे पर भंग कि एक चिपचिपा मिश्रण बनाता है भंग मदद करने के लिए नियमित रूप से मिलाएं. 20x एसएससी, 100x Denhardt समाधान के 400 μl के 4 मिलीलीटर जोड़ें. 20 मिलीलीटर के लिए पूर्ण और एक भंवर का उपयोग कर अच्छी तरह मिला लें.
  8. सूखे वर्गों पर समाधान की जांच कर 80 μl गिरा. एक 22 मिमी x 50 मिमी कांच coverslip के साथ कवर, और जांच समाधान भर में फैलता है, इसकी पुष्टिcoverslip की पूरी सतह. सावधानी: कोई बुलबुले होना चाहिए. बुलबुले की उपस्थिति संकरण दक्षता कम हो जाती है. रबर सीमेंट का उपयोग coverslip सील, और इसे सूखा. स्लाइड भर इष्टतम संकरण संकेत के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्लाइड्स रखें.
    नोट: यह जल्दी सूख जाता है के रूप में रबर सीमेंट सुविधाजनक है, निविड़ अंधकार है, और संकरण के दौरान सूखने से नमूना बचाता है. यह संकरण के बाद coverslip दूर करने के लिए बंद छील करने के लिए भी आसान है. नेल पॉलिश कुशल एक वैकल्पिक है, लेकिन कम सुविधाजनक विकल्प.
  9. 5 मिनट के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस स्लाइड इनक्यूबेटर पर स्लाइड्स रखकर विकृतीकरण के साथ आगे बढ़ें. वैकल्पिक रूप से, एक धातु ट्रे पर स्लाइड जगह और (ट्रे नाव चाहिए) एक 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्रे जगह. फिर जल्दी से बर्फ पर रखा एक धातु ट्रे पर स्लाइड हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए छोड़ दें. रातोंरात संकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (स्लाइड हीटर या इनक्यूबेटर) में स्लाइड्स स्थानांतरण. नोट: हम कम कमजोर जो परिणामों में संकरण, या कोई संकेत सिफारिश नहीं है.
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर खंड रखने के लिए हीटर पर स्लाइड को बनाए रखते हुए 2 दिन, संदंश के साथ रबर सीमेंट हटाने एक स्केलपेल ब्लेड के टिप के साथ धीरे coverslip निकालें.
  11. 5 मिनट, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.2x एसएससी के साथ तीन बार के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी साथ 3X धो. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2x एसएससी के साथ एक बार धोएं और डीएनए धुंधला और बढ़ते के साथ आगे बढ़ना (नीचे प्रोटोकॉल 10 देखें).
    नोट: इस विधि centromeric और pericentromeric दृश्यों 22 के लिए प्रकाशित रूप एचएसवी -1 विशिष्ट जांच के साथ मिलकर जांच कर समाधान में इसी जांच का उपयोग करके, सेलुलर जीनोमिक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.

7. दोहरी शाही सेना डीएनए मछली

चित्रा 1, एक सिंहावलोकन के लिए हरे बॉक्स देखें.

कई के लिएएक शाही सेना मछली कदम सहित प्रक्रियाओं धुंधला हो जाना, यह आम तौर पर इस तरह की पहली लक्ष्य के रूप में शाही सेना जांच के लिए प्रदर्शन करने की सलाह दी है RNAse और रसायनों से गिरावट के प्रति संवेदनशील है. इसके अतिरिक्त, डीएनए मछली प्रक्रिया अन्य धुंधला की क्षमता को कम उपचार है कि शामिल हैं. आरएनए मछली के लिए, हम (biotinylated जांच और peroxidase (एचआरपी) युग्मित streptavidin का उपयोग Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए)) एक एंजाइम आधारित पहचान दृष्टिकोण चुना है. टीएसए covalently एक peroxidase enzymatic प्रतिक्रिया से ऊतक से जुड़ा हुआ है जो एक फ्लोरोसेंट Tyramide सब्सट्रेट (विवरण के लिए अभिकर्मक तालिका देखें) पर आधारित है. आरएनए मछली संकेत इस प्रकार डीएनए मछली के दौरान संरक्षित है.

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    वेक्टर अक्षां लोकस की इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए (pSLAT -2)
    1x पीबीएस 2 मिमी आर वी सी युक्त
    2 मिमी आर वी सी युक्त 1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100
    3% एच आसुत जल में 2 0 2.
    70%, 80%, 95% इथेनॉल, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड.
    4x शाही सेना संकरण समाधान (प्रोटोकॉल 4 देखें)
  2. कम से कम एक दिन आरएनए मछली प्रयोग से पहले, आरएनए मछली जांच को तैयार. पहले संदर्भ 26 में वर्णित के रूप में, एचएसवी -1 लेटेंसी एसोसिएटेड ट्रांसक्रिप्ट (LAT) का पता लगाने pSLAT -2 वेक्टर 30, या अक्षां लोकस की इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए एक और वेक्टर से एक biotinylated RIBO जांच को तैयार करने के लिए. संक्षेप में: HindIII साथ pSLAT-2 की 10 ग्राम linearize और एक डीएनए शुद्धि किट के साथ पचा वेक्टर शुद्ध. बायोटिन-16-UTP की उपस्थिति में एक T7 में इन विट्रो प्रतिलेखन किट * के साथ पचा pSLAT-2 की 2 ग्राम से एक भी कतरा RIBO जांच synthesize. एक शाही सेना मिनी स्तंभ के साथ जांच को शुद्ध और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 260 एनएम quantitate. ठंड विगलन चक्र से बचने के लिए छोटे aliquots में, -80 डिग्री सेल्सियस पर DNase / RNase मुफ्त पानी और दुकान में 50 एनजी / μl में जांच पतला.
    नोट: * बायोटिन-16-UTP: UTP अनुपात अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. हम चound एक 40:60 अनुपात कुशलतापूर्वक आरएनए मछली द्वारा LAT पता लगाने जांच प्रदान करने के लिए.
  3. 1 दिन, कमरे के तापमान पर एक स्लाइड धारक पर स्लाइड जगह है, और वर्गों 10 मिनट के लिए सूखी हैं. एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ वर्गों सर्कल. 10 मिनट के लिए 2 मिमी Ribonucleoside Vanadyl कॉम्प्लेक्स (आर वी सी) * युक्त 1x पीबीएस में वर्गों rehydrate. ऊतक permeabilize 2 मिमी आर वी सी युक्त 1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ 20 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं. 1x पीबीएस, 2 मिमी आर वी सी के साथ 3x 10 मिनट धो लें. , किसी भी अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने 2x 10 मिनट के लिए 3% एच 2 ओ 2 में खंड सेते हैं, और फिर 1x पीबीएस, 2 मिमी आर वी सी के साथ एक बार धोने के लिए.
    * नोट: शाही सेना मछली प्रक्रिया के दौरान, (आर वी सी) ribonucleoside vanadyl जटिल आरएनए गिरावट को रोकने के लिए buffers और समाधान करने के लिए जोड़ा गया है.
  4. 70% इथेनॉल में 2x 10 मिनट सेते हैं. इस स्तर पर, वर्गों कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है. 80% में ऊष्मायन, 95%, और 100% ETH द्वारा वर्गों निर्जलीकरणanol, 5 मिनट प्रत्येक. कम से कम 10 मिनट के लिए खंड शुष्क करते हैं.
    नोट: कुछ मामलों में, इथेनॉल उपचार अन्य ठिकानों का पता लगाने के लिए हानिकारक हो सकता है. 50% formamide में एक prehybridization कदम का उपयोग कर एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल - 2x एसएससी (ट्रिपल धुंधला पर जानकारी के लिए प्रोटोकॉल 9 में नीचे देखें) का उपयोग किया जा सकता है. हालांकि, इथेनॉल उपचार आरएनए मछली के लिए सबसे बहुमुखी दृष्टिकोण है और सबसे कम पृष्ठभूमि प्रदान करता है.
  5. पालन ​​के रूप में जांच कर समाधान तैयार: पहले से तैयार एक 10 मिलीलीटर 8x एसएससी, 20x Denhardt समाधान, 4 मिमी EDTA, 40% dextran * युक्त एक 4x शाही सेना संकरण समाधान का जायजा. -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 microtubes में μl, और दुकान के रूप में समाधान विभाज्य 1 स्लाइड के लिए 20 biotinylated अक्षां riboprobe की एनजी, खमीर tRNA के 40 एनजी, 2 मिमी आर वी सी, और पानी के साथ 20 μl को पूरा मिश्रण से, समाधान (x 50 मिमी 22 मिमी coverslip) का 80 μl तैयार करते हैं. 4x शाही सेना संकरण समाधान के 20 μl, और 40 μl जोड़ेंformamide (50% अंतिम एकाग्रता) के. आसान pipetting और मिश्रण के लिए, यह 75 डिग्री सेल्सियस पर 4x शाही सेना संकरण समाधान prewarm की सिफारिश की है ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से मिलाएं.
    * नोट:, 4x शाही सेना संकरण समाधान तैयार आसुत जल के 3 मिलीग्राम और 20x एसएससी के 4 एमएल में dextran सल्फेट की 4 जी (मेगावाट 500,000) मिश्रण करने के लिए. यह 70 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे पर घुल कि एक चिपचिपा मिश्रण बनाता है भंग करने के लिए मदद करने के लिए नियमित रूप से मिलाएं. 100x Denhardt समाधान के 2 मिलीलीटर, और एक 0.5 एम EDTA समाधान के 80 μl जोड़ें. पानी के साथ 10 मिलीलीटर के लिए पूर्ण और एक भंवर का उपयोग कर अच्छी तरह मिला लें. सावधानी: केवल RNAse / DNase मुक्त उत्पादों का उपयोग करें.
  6. 75 डिग्री सेल्सियस पर जांच 10 मिनट denature इस बीच, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक स्लाइड इनक्यूबेटर पर स्लाइड जगह वर्गों पर जांच समाधान के 80 μl ड्रॉप और जल्दी से ड्रॉप पर एक coverslip जगह. सावधानी: कोई बुलबुला नहीं होनी चाहिए. बुलबुले की उपस्थिति संकरण EFF कम हो जाती हैiciency. ऊष्मायन coverslip सील नहीं है क्योंकि एक humidified कक्ष में जगह लेने के लिए किया है. (सामग्री तालिका देखें) पानी पकड़, या एक मोहरबंद बॉक्स के भीतर एक humidified कक्ष तैयार है और एक 65 डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में रख सकते हैं कि एक स्लाइड इनक्यूबेटर भी उपयोग.
  7. 65 डिग्री सेल्सियस नोट पर रातोंरात सेते: LAT आरएनए मछली 37 डिग्री सेल्सियस पर मनाया जाता है, जो जांच का अविशिष्ट बंधन को रोकने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है कई अन्य आरएनए मछली जांच 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छा संकेत में परिणाम चाहिए
  8. 2 दिन, वाशिंग शुरू होने से पहले, टीएसए जांच किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार पता लगाने अभिकर्मकों तैयार करते हैं. पता लगाने के एक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) युग्मित streptavidin और एक हरे या नीले रंग फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सहित एक वाणिज्यिक टीएसए जांच किट के साथ किया जाता है.
  9. 65 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड हीटर पर स्लाइड रखें ध्यान coverslip हटाने और जल्दी 2x एसएससी में 50% formamide के 1 मिलीलीटर जोड़ने, prewarmed एकटी 65 डिग्री सेल्सियस सावधानी, अनुभाग सूखा नहीं है. 65 डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी में 50% formamide में 65 डिग्री सेल्सियस पर दो बार 10 मिनट धो लें और 2x एसएससी में 2x 10 मिनट 2x एसएससी के साथ एक बार फिर धो लें और एक 37 डिग्री सेल्सियस स्लाइड हीटर पर स्लाइड जगह.
  10. टीएसए जांच किट निर्माता अनुदेश के अनुसार पता लगाने के कदम के साथ आगे बढ़ें. एचआरपी streptavidin की एकाग्रता, फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट की एकाग्रता और प्रतिक्रिया का समय अनुभवतः * निर्धारित किया जाना चाहिए. 1/500 में पतला एचआरपी streptavidin, नीला प्रतिदीप्ति और हरी प्रतिदीप्ति के लिए 1/500 के लिए 1/100 में फ्लोरोसेंट अभिकर्मक, और 10 मिनट की प्रतिक्रिया समय: LAT आरएनए का पता लगाने के लिए, हम नियमित रूप से निम्नलिखित हालत इस्तेमाल किया. संकेत जल्दी से डीएनए मछली के साथ आगे बढ़ने से पहले, बढ़ते बिना एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ की जाँच की जा सकती है.
    * नोट: प्रवर्धन प्रोटोकॉल प्रयोग के मुख्य लक्ष्यों के अनुसार डिजाइन किया जाएगा. उदाहरण के लिए, सूक्ष्मता लक्ष्य शाही सेना स्थानीयकरण करने के लिए, यह विज्ञापन हैकम प्रतिक्रिया समय का उपयोग करने के लिए vised. इसके विपरीत, जल्दी पहचान और कम बढ़ाई सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, प्रतिक्रिया समय एक उज्ज्वल संकेत उत्पन्न करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.
  11. डीएनए मछली के लिए, unmasking कदम (6.2 कदम) से शुरू, ऊपर संकेत प्रक्रिया का पालन करें.

8. इम्यूनो डीएनए मछली

चित्रा 1, एक सिंहावलोकन के लिए बैंगनी रंग के बक्से देखें.

इसी शाही सेना डीएनए मछली के लिए, यह डीएनए मछली प्रोटीन denature और एंटीबॉडी द्वारा उनकी पहचान को रोकने की संभावना है, के बाद से पहली immunofluorescence प्रदर्शन करने की सलाह दी है. immunofluorescence संकेत की गुणवत्ता एंटीबॉडी विशेषताओं पर अत्यधिक निर्भर है, और कई एंटीबॉडी संभव है जब भी परीक्षण किया जाना चाहिए. मिलान unmasking प्रोटीन का पता लगाने और डीएनए मछली दोनों में सुधार करने के लिए immunofluorescence से पहले एक बार किया जाता है. डीएनए मछली प्रक्रिया के दौरान नमूने पर immunofluorescence संकेत बनाए रखने के लिए यह cov करने के लिए आवश्यक हैalently ऊतक से लिंक. हम यहाँ हमारे हाथ में अच्छे परिणाम प्रदान की है कि दो दृष्टिकोण, एंटीबॉडी के बाद निर्धारण और Tyramide आधारित पहचान (कदम 8.5 देखें) उपस्थित थे. चुनाव प्रत्येक लक्ष्य / एंटीबॉडी जोड़ी के लिए प्रारंभिक परीक्षणों से प्रेरित किया जाना चाहिए.

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    1x पीबीएस 3% सामान्य बकरी सीरम (NGS) युक्त.
    1x पीबीएस में 2% पीएफए ​​(4% शेयर समाधान से कमजोर पड़ने)
  2. 1 दिन, पहला कदम (6.1-6.2 कदम) unmasking कदम अप करने के लिए, डीएनए मछली के समान हैं.
  3. अनमास्किंग के बाद, 1x पीबीएस 1 घंटे के लिए 3% NGS को रोकने के साथ वर्गों सेते हैं.
  4. 24 घंटे के लिए 3% NGS युक्त 1x पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. हम एक रात ऊष्मायन आमतौर पर एक मजबूत संकेत है कि परिणाम में पाया हालांकि निचले ऊष्मायन समय, प्रोटोकॉल को छोटा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊष्मायन के ऊपर से 48-72 घंटा ऐसी आईजीएम के रूप में कम समानता प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हो सकता है.
  5. दिन2, 1x पीबीएस के साथ 3x 10 मिनट धो लो.
  6. एंटीबॉडी के बाद निर्धारण के साथ प्रोटोकॉल: 3% NGS युक्त 1x पीबीएस में 1/200 में, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट डाई के साथ मिलकर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटा सेते हैं. 1x पीबीएस के साथ तीन बार 10 मिनट धो लें. बाद के निर्धारण 10 मिनट * के लिए 1x पीबीएस में 2% पीएफए ​​के साथ किया जाता है. 1x पीबीएस के साथ 3x 10 मिनट धो लें.
    टीएसए पता लगाने के साथ प्रोटोकॉल: 3% NGS युक्त 1x पीबीएस में 1/250 में एचआरपी युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटा सेते हैं. 1x पीबीएस के साथ तीन बार 10 मिनट धो लें. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Tyramide का पता लगाने के साथ आगे बढ़ें. (कदम 7.9), अभिकर्मक कमजोर पड़ने और प्रतिक्रिया समय ऊपर संकेत के रूप में अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. ज्यादातर मामलों में, हमारे प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के एक 1/500 कमजोर पड़ने और एक 10 मिनट की प्रतिक्रिया समय के आधार पर किया गया है. 1x पीबीएस के साथ 3x 10 मिनट धो लें.
    * नोट: पोस्ट निर्धारण इम्युनो मछली में एक महत्वपूर्ण कदम है, और सावधान सेट अप की आवश्यकता है. बाद नियतन मजबूतबेहतर संकेत अगर, और कम डीएनए मछली दक्षता.
  7. मेथनॉल एसिटिक एसिड कदम (कदम 6.3) से डीएनए मछली के साथ आगे बढ़ें. इम्युनो डीएनए मछली की अवधि रातोंरात incubated पहली एंटीबॉडी के साथ, आमतौर पर 3 दिन है.

9. Immunofluorescence साथ युग्मित दोहरी डीएनए शाही सेना मछली

चित्रा 1, एक सिंहावलोकन के लिए नारंगी बॉक्स देखें.

आरएनए मछली, पहली बार प्रदर्शन immunofluorescence द्वारा पीछा किया, और अन्त में डीएनए मछली है. Immunofluorescence Tyramide प्रतिक्रिया से पता चला है, यह एच 2 ओ 2 के साथ शाही सेना मछली कदम से पूरी तरह से एचआरपी गतिविधि बुझाने के लिए, और है कि शमन कुशल है सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह एक स्लाइड एक "कोई प्राथमिक एंटीबॉडी" नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.

इथेनॉल आधारित निर्जलीकरण कुछ विलायक के प्रति संवेदनशील प्रोटीन के लिए हानिकारक है, क्योंकि आरएनए मछली के इस कदम immunofluorescence बाधित कर सकते हैं. यदि हां, आरएनए मछली डब्ल्यू किया जा सकता हैstpe 9.3 में नीचे विस्तृत रूप ith एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल,.

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    2 मिमी आर वी सी युक्त 1x पीबीएस में 50% formamide
  2. 1 दिन, आरएनए मछली जांच को तैयार करने और एच 2 ओ 2 शमन कदम (कदम 7.2) के लिए, दोहरी आरएनए मछली के लिए के रूप में आगे बढ़ना.
  3. केस 1, immunofluorescence धुंधला इथेनॉल निर्जलीकरण के बाद काम करता है: कदम 7.3-7.9 में ऊपर संकेत के रूप में शाही सेना मछली के साथ आगे बढ़ना. फिर नीचे 9.6 कदम आगे बढ़ना.
  4. केस 2, immunofluorescence धुंधला इथेनॉल उपचार से रोका है: 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक स्लाइड हीटर पर एक humidified कक्ष में स्लाइड्स प्लेस और 50% formamide, 1x पीबीएस, और 2 मिमी आर वी सी युक्त prehybridization समाधान में 1.5 घंटे के लिए सेते हैं. Prehybridization समाधान नाली और कदम 7.4 और 7.5 में संकेत के रूप में संकरण समाधान के 80 μl ड्रॉप. तब बताए abov के रूप में शाही सेना मछली संकरण और पहचान के साथ आगे बढ़नाकदम 7.6-7.9 (2 दिन और 3) में ई.
  5. आरएनए मछली पूर्ण होने के बाद 2 दिन, इम्युनो डीएनए मछली unmasking कदम (6.2 कदम देखें) के साथ शुरू करने के साथ आगे बढ़ना. फिर, कदम 8.2-8.6 में ऊपर संकेत के रूप में इम्युनो डीएनए मछली प्रोटोकॉल का पालन करें.

10. स्लाइड बढ़ते और इमेजिंग

  1. शुरू करने से पहले निम्न समाधान तैयार:

    1x पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल Hoechst 33342
  2. DAPI या Hoechst 33342 * 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ 10 मिनट के लिए दाग नाभिक. 1x पीबीएस के साथ 3x 10 मिनट धो लें.
    नोट: *. सावधानी का पता लगाने प्रणालियों में से एक एक फ्लोरोसेंट नीले रंग का उपयोग करता है, तो DAPI या Hoechst का उपयोग नहीं करते. इसके बजाय, Topro3 जहाँ तक लाल तरंग दैर्ध्य के भीतर एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ एक फ्लोरोसेंट डीएनए रंगों का उपयोग करें.
  3. स्लाइड से जितना संभव हो उतना तरल नाली. स्लाइड के एक छोर पर एक antifading एजेंट युक्त बढ़ते मध्यम के 80 μl गिरा. एक उच्च ऑप्टिकल गुणवत्ता के साथ वर्गों को कवरcoverslip (एन 1.5 कांच °). Coverslip बुलबुले के बिना खंड पर बढ़ते मध्यम फैल जाने के क्रम में, संदंश के साथ एक छोर पर इसे बनाए रखने के द्वारा धीरे - धीरे नीचे चलते हैं.
  4. एक अंधेरे स्लाइड बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर नेल पॉलिश और दुकान के साथ सील.
  5. अव्यक्त एचएसवी -1 जीनोम के डीएनए मछली संकेत का प्रत्यक्ष अवलोकन उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x या उच्च बढ़ाई तेल विसर्जन उद्देश्य, (उदाहरण के लिए 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100x NA 1.3) और एक उत्तेजना प्रकाश स्रोत की आवश्यकता एक 100 डब्ल्यू पारा दीपक को कम से कम बराबर. हम (उपकरण की तालिका देखें) ऐसे पिछले 5 वर्षों में निर्माताओं द्वारा प्रदान की उन के रूप में एक उच्च दक्षता संचरण माइक्रोस्कोप का उपयोग की सलाह. Confocal माइक्रोस्कोपी ऐसी पतली सेक्शनिंग या वर्णक्रमीय इमेजिंग के रूप में की वजह से ऊतक के ऑटो प्रतिदीप्ति को कम पृष्ठभूमि के साथ छवियों, इकट्ठा करने के लिए उपकरण प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

व्यापक परीक्षण के कई महीनों के बाद, हम गर्मी आधारित रासायनिक unmasking स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट के लिए अव्यक्त एचएसवी -1 जीनोम उपलब्ध कराया कि खोज की. प्रक्रिया के दौरान, हम विभिन्न unmasking प्रक्रियाओं की कोशिश की, और केवल गर्मी के आधार पर उपचार (यानी एक माइक्रोवेव ओवन में उप उबलते तापमान पर निर्भर वर्गों हीटिंग) कुशल दिखाई दिया. हम तो नियमित तौर पर 0.01 एम पीएच 6.0 साइट्रेट बफर (हम सब हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया है), 1x पीबीएस, 1 मिमी EDTA, 0.1 एम सहित epitopes 31,32, पुनः प्राप्त करने immunohistochemistry (आईएचसी) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में उपयोग किया जाता है कि कई नमक बफ़र्स का परीक्षण किया Tris-एचसीएल 7.4 पीएच और आसुत जल. EDTA बफ़र्स ऊतकों को नुकसान करते हैं, अन्य सभी बफ़र्स न्यूरॉन्स के नाभिक के भीतर के रूप में एक या कई धब्बे (चित्रा 2A, इन ऊतकों अत्यधिक ऑटो फ्लोरोसेंट, कुछ में दिखाई देता है, जो ध्यान दें कि प्रतीत होता है जो एचएसवी -1 का पता लगाने, के लिए उपयुक्त थे cytop में एक सजातीय संकेत के रूप में छवियोंlasm). हमारे हाथ में, साइट्रेट बफर लगातार ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना एक अच्छा संकेत प्रदान करने के लिए और इस तरह हमारी दिनचर्या प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था दिखाई दिया.

(cosmids में क्लोन एचएसवी -1 जीनोम के कुछ हिस्सों से बना) सीधे लेबल Cy3 डीएनए जांच के उपयोग के मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है. हालांकि, यह एचएसवी -1 जीनोम पुस्तकालयों का उपयोग करने की आवश्यकता है. हम इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल किसी को केवल वाणिज्यिक जांच के लिए उपयोग होने के लिए काम करेंगे कि सत्यापित. चित्रा 2B Enzo बायोकेम से प्राप्त एक अखिल एचएसवी -1 biotinylated जांच का उपयोग डीएनए मछली द्वारा एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम का पता लगाने से पता चलता है. इन पंक्तियों के साथ, हम डीएनए मछली प्रोटोकॉल संभवतः. चित्रा 3A तीन आमतौर पर इस्तेमाल किया उपभेदों से संक्रमित माउस और खरगोश से नमूने पर एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने, दिखाता अन्य एचएसवी -1 पशु मॉडल का उपयोग करते हुए वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या परीक्षण किया SC16, त्रिपृष्ठी जी के वर्गों के भीतर संक्रमण की तीव्र या अव्यक्त या तो मंच पर 17syn + और McKrae,,एंग्लिया. सभी मामलों में एचएसवी -1 जीनोम चमक और सेल से सेल को बदलता है कि तीव्रता का एक असमान संकेत के रूप में दिखा. अंत में, हम एक सामान्य दाद संक्रमण के दौर से गुजर चूहों से ऊतकों पर डीएनए मछली के प्रदर्शन से, एचएसवी -1 की replicative चक्र के लिए हमारे प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता बढ़ाया. इन जानवरों में एचएसवी -1 जीनोम के बड़े और उज्ज्वल समुच्चय मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी, आंख और पृष्ठीय रूट ganglia (3B चित्रा) सहित विभिन्न ऊतकों में पता लगाया जा सकता है.

एचएसवी -1 विलंबता के कई पहलुओं को अभी भी खराब ऐसी एचएसवी -1 जीन अभिव्यक्ति परमाणु वास्तुकला 33-35 के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है के रूप में कैसे, समझ रहे हैं, न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सबसेट विलंबता स्थापना और पुनर्सक्रियन 13 के लिए मेजबान सेल पसंद कर रहे हैं कि क्या , 14,36,37, या कैसे प्रतिरक्षा निगरानी वायरस लोड या वायरस के जीन की अभिव्यक्ति 9,10 के अनुसार गैन्ग्लिया के भीतर जगह लेता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल से, इन सवालों से निपटने में मदद मिलेगीएचएसवी -1 जीनोम और वायरल या सेलुलर RNAs और प्रोटीन की codetection. 4 ऐसे centromeric प्रोटीन CENP ए के रूप में सेलुलर प्रोटीन के साथ (आंकड़े 4A और 4C), एक साथ एचएसवी -1 अक्षां शाही सेना के साथ एचएसवी -1 जीनोम की codetection दिखाता चित्रा , या chromatin और पीएमएल नायब जुड़े प्रोटीन ATRX (पीएफए ​​के बाद नियतन से अगर इसके बाद चित्रा 4 बी) (चित्रा 4C टीएसए आधारित पता लगाने के द्वारा अनुसरण करते हैं,). चित्रा 4C (एचएसवी -1 डीएनए दिखा एक ट्रिपल धुंधला प्रयोग से डेटा दिखाता है लाल) अपने आरएनए उत्पाद अक्षां (नीला) और एक उम्मीदवार नियामक प्रोटीन, ATRX (हरा). हमारे डीएनए मछली प्रोटोकॉल और आरएनए मछली और immunofluorescence संकेत के प्रत्यक्ष या एंजाइम आधारित पता लगाने के संयोजन, बगल में सेल और ऊतक स्तर पर वायरस मेजबान संबंधों का पता लगाने के लिए उपकरणों की एक बहुमुखी और व्यापक रूप से लागू सेट का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 1 चित्रा 1. एकाधिक लक्ष्य धुंधला में डीएनए मछली प्रोटोकॉल और एकीकरण का अवलोकन. डीएनए मछली प्रोटोकॉल और RNAs और प्रोटीन की codetection के लिए प्रोटोकॉल के साथ संबंध के मुख्य चरण रेखाचित्र के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. महत्वपूर्ण कदम चेतावनी के संकेत के संकेत हैं. डीएनए मछली मुख्य कदम पुनर्जलीकरण, permeabilization, unmasking, मेथनॉल एसिटिक एसिड उपचार और संकरण हैं. प्रक्रिया के भीतर, unmasking ध्यान से सेट अप और सम्मान करने की आवश्यकता है जो एक महत्वपूर्ण कदम है. दो अन्य महत्वपूर्ण कदम तकनीकी प्रक्रियाओं immunodetection के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के साथ संगत कर रहे हैं पर निर्भर करते हैं. ये ट्रिपल धुंधला के लिए आरएनए मछली प्रक्रिया पर असर, और immunofluorescence. का पता लगाने की रणनीति पर होगा सीबड़ी छवि को देखने के लिए यहां चाटना.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रोटोकॉल अनुभाग में संकेत के रूप में प्रतिजन unmasking बाद एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम की जांच. 28 डीपीआई संक्रमित चूहों से ए टीजी वर्गों तैयार थे. टीजी वर्गों चित्र 1 में संकेत के रूप में डीएनए मछली के लिए संसाधित, और गर्मी आधारित unmasking प्रत्येक छवि के शीर्ष पर संकेत दिया बफर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. नाभिक की रूपरेखा एक धराशायी लाइन के रूप में दिखाया गया है. कोशिका द्रव्य में मनाया संकेत ऊतक के ऑटो प्रतिदीप्ति की वजह से है. एक के रूप में तैयार बी टीजी वर्गों. एक व्यावसायिक रूप से प्राप्त biotinylated एचएसवी -1 जांच का उपयोग डीएनए मछली के लिए प्रोसेस किया गया. संकरित जांच टीएसए और एक एलेक्सा Fluor लेबल substra का उपयोग कर पाया गया थाते (हरा). नाभिक Hoechst 33352 (नीला) के साथ counterstained थे. एक बढ़े हुए फसली छवि सही कॉलम में दिखाया गया है. एचएसवी -1 जीनोम पैटर्न के दो प्रकार एक ठेठ एचएसवी -1 intranuclear स्थानीयकरण वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं. सभी छवियों को एक व्यापक क्षेत्र epifluorescence खुर्दबीन पर एकत्र किए गए थे. स्केल बार 5 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. कई मॉडल में एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने. ए मानक डीएनए मछली प्रोटोकॉल विभिन्न मूल से टीजी वर्गों के लिए लागू किया गया था. SC16 प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में टीजी वर्गों तैयार किए गए माउस संक्रमित. 17syn + संक्रमित माउस वर्गों और McKrae संक्रमित खरगोश वर्गों कर्नल द्वारा प्रदान किया गयाlaborators. छवियाँ एक व्यापक क्षेत्र epifluorescence खुर्दबीन पर एकत्र किए गए थे. स्केल बार 5 माइक्रोन है. एक सामान्य दाद संक्रमण के दौर से गुजर बी SC16 संक्रमित चूहों 6 डीपीआई पर बलिदान किया गया और कई ऊतकों जमी, एकत्र और sectioned थे. चित्रा 1 में संकेत के रूप में मानक डीएनए मछली प्रोटोकॉल लागू किया गया था. छवियाँ एक व्यापक क्षेत्र epifluorescence खुर्दबीन पर एकत्र किए गए थे. स्केल बार 10 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 4. एचएसवी -1 जीनोमिक डीएनए और एकल वर्गों पर RNAs और प्रोटीन की Codetection. SC16 संक्रमित माउस टीजी वर्गों शाही सेना डीएनए मछली, इम्युनो डीएनए मछली या ट्रिपल stainin के लिए प्रोसेस किया गयाजी. ए शाही सेना डीएनए मछली एक एचएसवी -1 जीनोम Cy3 का उपयोग कर चित्र 1 में संकेत के रूप में जांच (लाल) और एक शाही सेना अक्षां biotinylated RIBO जांच (हरा) लेबल. अक्षां आरएनए जांच टीएसए और एक एलेक्सा Fluor 488 लेबल सब्सट्रेट का उपयोग करने का पता चला था. नाभिक एक विरोधी CENP एक एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग Hoechst 33352 (नीला) बी इम्यूनो डीएनए मछली के साथ counterstained और एक एचएसवी -1 जीनोम Cy3 जांच (लाल) लेबल रहे थे. एंटीबॉडी डीएनए मछली चलाने से पहले पीबीएस में 1% पीएफए ​​के साथ के बाद निश्चित 10min थे. नाभिक Hoechst 33352 (नीला). सी. इम्यूनो शाही सेना डीएनए मछली एक शाही सेना अक्षां biotinylated RIBO जांच (नीला) का उपयोग कर, एक विरोधी ATRX एंटीबॉडी (हरा) और Cy3 जांच लेबल एक एचएसवी -1 जीनोम (साथ counterstained गया लाल). अक्षां आरएनए जांच Tyramide का पता लगाने और एक नीले रंग की fluorescently लेबल सब्सट्रेट का उपयोग करने का पता चला था, और विरोधी ATRX और माध्यमिक एंटीबॉडी Tyramide का पता लगाने और एक हरे रंग की fluorescently लेबल सब्सट्रेट से पता चला रहे थे. सभी छवियों को एक व्यापक क्षेत्र epifluorescence मीटर पर एकत्र किए गएicroscope. स्केल बार 5 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस neuronal ऊतक वर्गों के न्यूरॉन्स के भीतर एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोम का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. वायरल जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के रास्ते के बारे में हमारी समझ neuronal ऊतकों के भीतर बगल में एचएसवी -1 जीनोमिक डीएनए का पता लगाने के लिए विधि की कमी के द्वारा सीमित किया गया है. जीनोम प्रतिलिपि संख्या और संक्रमित न्यूरॉन्स के अनुपात पर सूचना अलग न्यूरॉन्स 11,12 पर पीसीआर विश्लेषण से मुख्य रूप से आया था. एचएसवी -1 विलंबता पर भूमिका मेजबान सेल परमाणु वास्तुकला elucidating में, हम गुप्त रूप से संक्रमित चूहों के न्यूरॉन्स के नाभिक के भीतर डीएनए मछली द्वारा अव्यक्त एचएसवी -1 जीनोम का स्थानीयकरण, यह निर्धारित करने के लिए निर्धारित किया है. हम डीएनए मछली प्रोटोकॉल और ऊतक उपचार की एक विस्तृत विविधता का परीक्षण किया, और वायरस डीएनए मछली का पता लगाने का एक अनिवार्य कदम के रूप में गर्मी आधारित "मिलान अनमास्किंग" मिल गया है. इस तरह के उपचार नियमित immunohistochemistry के लिए आयल एम्बेडेड वर्गों के भीतर प्रोटीन का मिलान प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह लगभग सार्वभौमिक प्रयोग किया जाता हैविकृति में, यह पारंपरिक डीएनए मछली में उपयोग नहीं किया है. कई अध्ययनों से इस तकनीक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के पैमाने पर ऊतक की आकारिकी को बरकरार रखता है कि समर्थन करते हैं, अंत उपयोगकर्ता अपने विशेष जैविक प्रणाली 38 में इस बिंदु को मान्य करने के लिए उचित नियंत्रण शामिल होना चाहिए. विभिन्न buffers का उपयोग गर्मी आधारित unmasking लगातार मछली जांच करने के लिए उपलब्ध एचएसवी -1 अव्यक्त जीनोमिक डीएनए (चित्रा 2) बनाया है, जबकि हमारे हाथ में है, ऐसे प्रोटीज उपचार के रूप में अन्य unmasking प्रक्रियाओं, एचएसवी -1 डीएनए का पता लगाने की अनुमति नहीं थी. गर्मी आधारित unmasking एचएसवी -1 डीएनए कसकर प्रोटीन से जुड़ा हुआ है यह दर्शाता है कि प्रोटीन के बीच crosslinks के हिस्से को खत्म करने के बारे में सोचा है. इस एचएसवी -1 अव्यक्त और अपघट्य जीनोम सेलुलर histones 2,39,40 के साथ जुड़ा हुआ है कि हाल के प्रदर्शन के साथ संगत है. ; एचसीएम्वी 42,43, EBV 44-46, KHSV 47-49, prot VZV 41: अन्य herpesviruses के जीनोम histones साथ जुड़े रहे हैंयहाँ वर्णित ocol ऐसे papillomaviruses, हेपेटाइटिस बी वायरस, और रेट्रोवायरस के रूप में अन्य लगातार परमाणु वायरस का पता लगाने के लिए भी शायद इन herpesviruses के जीनोम के साथ ही कई अन्य लोगों का पता लगाने, लेकिन करने के लिए लागू किया जा सकता है. दिलचस्प है, अलग प्रयोगात्मक (संक्रमित चूहों और खरगोशों से ऊतकों, विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा तैयार वर्गों, और विभिन्न एचएसवी -1 उपभेदों का उपयोग) सेटिंग्स पर मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग एचएसवी -1 जीनोम का पता लगाने के लिए अतिरिक्त सेट अप की जरूरत नहीं थी. अन्य जैविक प्रणालियों के लिए प्रोटोकॉल लागू करने के लिए, हम निर्धारण प्रक्रिया और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तकनीक आगे विकास के क्षेत्रों में हो सकता है कि आशा.

एचएसवी -1 विलंबता के मूल्यांकन में शास्त्रीय दृष्टिकोण न्यूरॉन्स में अपघट्य चक्र जीन उत्पादों का पता लगाने के अभाव के संयुक्त अक्षां शाही सेना की उपस्थिति का पता लगाने के लिए है. हालांकि, विलंबता के माउस मॉडल से अलग न्यूरॉन्स पर सीटू पीसीआर और qPCR में पर आधारित अध्ययन में संकेत दिया है कि संक्रमित Neu की संख्याRons (यानी एचएसवी -1 जीनोम सकारात्मक न्यूरॉन्स) LAT न्यूरॉन्स 12,18 व्यक्त की तुलना में 2-3 समय अधिक था. शाही सेना डीएनए मछली का उपयोग करना, यह हमारी माउस मॉडल में एचएसवी -1 डीएनए सकारात्मक न्यूरॉन्स के 20-30% को अक्षांश आरएनए 22 के लिए सकारात्मक रहे हैं कि इस बात की पुष्टि की गई थी. डीएनए मछली और वायरल और सेलुलर डीएनए की codetection का उपयोग, आरएनए और प्रोटीन घटक एचएसवी -1 अव्यक्त जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के रास्ते को चिह्नित करने के लिए उपकरणों का एक नया सेट प्रदान करेगा. इसके अलावा, एचएसवी -1 विलंबता यह न्यूरॉन उपप्रकार की एक विस्तृत विविधता में जगह लेता है के रूप में एक विषम घटना माना जाता है, और यह जीनोम प्रतिलिपि संख्या में और अक्षां आरएनए अभिव्यक्ति 12,22 में विविधता की विशेषता है. डीएनए मछली की एक प्रमुख लाभ ऊतक की जटिलता के भीतर एकल कक्ष विश्लेषण करने के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए, और इस प्रकार के खाते में एचएसवी -1 विलंबता की विविधता ले रहा है. उदाहरण के लिए, हम व्यक्तिगत न्यूरॉन्स 22 में एचएसवी -1 जीनोम की बहुतायत के साथ अक्षां शाही सेना की अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है. विज्ञापन मेंप्रत्यर्पण, इस तकनीक को भी इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से SCID चूहों 13-17 में प्रत्यारोपित मानव नाड़ीग्रन्थि उपयोग पशु मॉडल वायरल जीनोम की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है. हमारे डीएनए मछली प्रोटोकॉल का भविष्य आवेदन एचएसवी -1 जीनोम सकारात्मक न्यूरॉन्स की संख्या के माध्यम से एचएसवी -1 विलंबता चिह्नित करने के लिए संभावना हो जाएगा. इस biotinylated जांच और कम बढ़ाई पता लगाया जा करने के लिए पर्याप्त एक मजबूत संकेत है जो उत्पादन Tyramide आधारित पहचान, का उपयोग किया जा सकता है. इस तरह के आवेदन Tyramide पहचान प्रणाली द्वारा उत्पन्न बहुत कम पृष्ठभूमि से संभव बनाया है. Cy3 अच्छी तरह से हालांकि अत्यधिक समय लेने वाली वर्गों की बड़ी संख्या को पढ़ने के लिए किया जाएगा जो उच्च बढ़ाई अवलोकन, आवश्यकता के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित एचएसवी -1 जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है लेबल.

शायद यहाँ वर्णित डीएनए मछली प्रोटोकॉल का प्रमुख गुण टी के साथ संगत बना देता है, जो बहुमुखी प्रतिभा और मजबूती हैंवह आरएनए और प्रोटीन दोनों की codetection. दरअसल हम शाही सेना या प्रोटीन, या दोनों का पता लगाने के लिए आवश्यक सभी उपचार, डीएनए मछली संकेत की गुणवत्ता और चमक में परिवर्तन नहीं कर पाया. आरएनए मछली इथेनॉल निर्जलीकरण या formamide आधारित prehybridization का उपयोग, डीएनए मछली से पहले किया जा सकता है. हम टीएसए पता लगाने अभिकर्मकों के साथ कम पृष्ठभूमि में जो परिणाम इथेनॉल आधारित प्रोटोकॉल, सलाह देते हैं. आरएनए मछली इथेनॉल इलाज के नमूने पर काम नहीं करते कि एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence द्वारा पीछा किया जाता है जब formamide आधारित प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इम्युनो डीएनए मछली करते समय, immunofluorescence संकेत के सहसंयोजक जोड़ने प्रोटीन स्थानीयकरण पैटर्न का विवरण संरक्षित करने के लिए Tyramide आधारित पहचान (जो संकेत amplifies), या बाद के निर्धारण द्वारा द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. बाद निर्धारण का अनुकूलन करने के लिए, immunofluorescence प्रोटोकॉल पहले एक मजबूत संकेत मिल को स्थापित किया जाना चाहिए, और अच्छा डीएनए मछली संकेत की अनुमति मजबूत बाद निर्धारण प्रक्रिया निर्धारित की जानी चाहिए. यह wilएल immunofluorescence संरक्षण और डीएनए मछली संकेत के बीच सबसे अच्छा समझौता प्राप्त किया जा सकता है जो भीतर की स्थिति की एक श्रृंखला प्रदान करते हैं. किसी भी अन्य एंटीबॉडी आधारित पहचान पद्धति के रूप में, संकेत की गुणवत्ता और सबसे अच्छा प्रोटोकॉल एंटीबॉडी पर ही निर्भर है. हमारे प्रोटोकॉल कोई अपवाद नहीं है और हम कुछ एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए विरोधी पीएमएल एमएबी क्लोन 36.1) और कुछ अन्य महत्वपूर्ण परीक्षण की जरूरत है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में से किसी के साथ बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं कि मनाया है. कुल मिलाकर, हम सफलतापूर्वक विभिन्न परमाणु डोमेन (chromatin-HP1, centromeres-CENP ए, CENP बी, पीएमएल के साथ जुड़े cytoplasmic और झिल्ली प्रोटीन, और परमाणु प्रोटीन सहित (एक अपवाद SP100 प्रोटीन था) हमारे इच्छित लक्ष्य से ज्यादातर का पता चला परमाणु निकायों-पीएमएल, Daxx, ATRX-). हमारे परीक्षण के आधार पर हम हमारे डीएनए मछली प्रोटोकॉल संवाददाता निर्माणों की इम्युनो codetection साथ संगत हो कि आशा (β-galactosidase, फ्लोरोसेंट प्रोटीन ...) है कि आमतौर पर प्रोमो का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता हैवायरल जीनोम से आतंकवाद गतिविधि.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम एचएसवी -1 से नमूने उपलब्ध कराने के लिए एन Sawtell (सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल के मेडिकल सेंटर, सिनसिनाटी, ओहियो, संयुक्त राज्य अमरीका), एस Efstathiou (कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) और जेम्स हिल (LSU स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र न्यू ऑरलियन्स, यूएसए) धन्यवाद क्रमशः, चूहों और खरगोशों से संक्रमित है, और अभिकर्मकों के लिए, उपयोगी विचार विमर्श के लिए एच. Masumoto (Kazusa डीएनए अनुसंधान संस्थान, चिबा, जापान) और एस Khochbin (Institut अल्बर्ट Bonniot, ग्रेनोबल, फ्रांस).

यह काम (पी एल, http://www.cnrs.fr को ATIP कार्यक्रम,) केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (CNRS) से अनुदान, फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) (ANR-05-MIIM द्वारा वित्त पोषित किया गया 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), FINOVI फाउंडेशन ( http://www.finovi.org/:fr:start ), LABEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) Université डी ल्योन की, इस कार्यक्रम के भीतर "Investissemenटीएस डी 'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) ANR द्वारा संचालित ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), ल एसोसिएशन ला Recherche contre Le कैंसर (एआरसी-7979 और एआरसी-डालना 4910, http://www.arc-cancer.net ), ला लीग नेशनल Contre ले कैंसर (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), और इंका (EpiPro कार्यक्रम, http://www.e -cancer.fr ). एफसी और पी एल CNRS शोधकर्ताओं हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015  
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound SAKURA 4583  
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001  
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5 M EDTA Sigma E6758  
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01  
Salmon sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen Life Technologies 15632-011  
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe  Enzo Life Sciences ENZ-40838  
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000  
20x Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099  
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415  
Dextran sulfate - MW 500,000 Euromedex EU0606-A  
Denhardt's solution (100x) Euromedex 1020-A  
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000  
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104  
T7 in vitro transcription kit Ambion Life Technologies AM1314  
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910  
RNA purification minicolumn Qiagen 73404  
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S  
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000  
Primary antibodies any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) Invitrogen Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen Life Technologies H3570 Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass Electron Microscopy Sciences 72204-04  
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15  
Equipment/Material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310  
Cryostat Leica France CM 1510-1  
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven  
Dry block heater Eppendorf 022670204  
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000  
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512  
Staining glass container Dominique Dutscher 68506  
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 83 जीवन विज्ञान (सामान्य) विषाणु विज्ञान दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) विलंबता, परमाणु संगठन जीन अभिव्यक्ति माइक्रोस्कोपी
फ्लोरिसेंट द्वारा neuronal ऊतकों में एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम और देखिए की जांच<i> सीटू</i> संकरण Immunostaining के साथ संयुक्त
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, … More

Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter