Summary
Мы описываем здесь протокол для очистки и характеристики растений белковых комплексов. Показано, что по иммунопреципитации один белок в комплексе, поэтому мы можем определить свои пост-трансляционные модификации и ее взаимодействующих партнеров.
Abstract
Растения быстро адаптироваться к изменениям в окружающей среде из-за выработки восприятие и систем сигнализации. Во время атаки патогена, растения быстро реагировать на инфекции через вербовку и активации иммунных комплексов. Активация иммунных комплексов связана с посттрансляционных модификаций (PTMs) белков, таких как фосфорилирование, гликозилирование, или убиквитинирования. Понимание того, как эти платежные терминалы хореографии приведет к лучшему пониманию того, как сопротивление достигается.
Здесь мы опишем способ очистки белка для нуклеотид-связывающего лейцин-богатый повтор (NB-LRR)-белков, взаимодействующих с и последующего определения их пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы). С небольшими модификациями, протокол может быть применен для очистки других белковых комплексов растение. Метод основан на экспрессии эпитопа-меченый вариант белка, представляющего интерес, который затем частично очищают бу иммунопреципитации и подвергали масс-спектрометрии для идентификации взаимодействующих белков и PTMs.
Этот протокол показывает, что: I). Динамические изменения в PTMs, таких как фосфорилирование можно обнаружить методом масс-спектрометрии; II). Важно иметь достаточное количество белка, представляющего интерес, и это может компенсировать отсутствие чистоты Иммунопреципитат; III). Для того чтобы обнаружить PTMs протеина интереса, этот белок должен быть иммунопреципитировали чтобы получить достаточное количество белка.
Introduction
Иммунные пути полагаться на различные пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы) белков быстро преобразовывать сигналы и активировать иммунные реакции 1. Платежные терминалы являются быстрые, реверсивные, и очень специфические химические изменения структуры белка, которые могут повлиять конформацию белка, активность, стабильность, локализацию и белок-белковых взаимодействий 2-4. В растениях, более 300 видов PTMs были выявлены в том числе убиквитинирования, SUMOylation, сульфатации, гликозилирования и фосфорилирования 2,5. Все больше доказательств свидетельствует о важности PTMs в различных аспектах иммунитета растений 1,5,6. Белок фосфорилирования, обратимое присоединение фосфатной группы на серин, треонин или тирозин остаток является регулятором многих клеточных функций и не удивительно в наиболее хорошо изученной PTM в защиту растений сигнальных каскадов 5-11. Фосфорилирования зависит от сигнализации является неотъемлемой частью растительного DefeNSE активации начато после внеклеточной восприятия микробов по трансмембранных рецепторов, или внутриклеточного признания многодоменных белков сопротивления 5,8.
По вторжения растения, микробы обнаруживаются в плазме мембранных рецепторов называемых шаблон рецепторы распознавания (РРСС) 12. Известные PRRS являются либо рецептор-подобные белки (РЛП) или рецептор-подобных киназ (RLKs), и несущий лиганд-связывающий эктодомена и трансмембранный домен однопроходный. В отличие от РЛП, RLKs есть внутриклеточный домен киназы 13-15. Эктодомен PRRS связывается с консервативных молекул микроб элиситора называемых патогенных-связанная молекулярные структуры (PAMPs), что приводит, в случае RLKs, чтобы автофосфорилированию и трансфосфорилирования в пределах внутриклеточного домена 6, 16. Вниз по течению от восприятия вызванной фосфорилирования РРСС, последующее фосфорилирование цитоплазматических белков, включая киназ 17, 18, E3 лигазы 19, митоген-активированной протеинкиназы (МАРК) 20, 21, кальций-зависимой протеинкиназы (CDPK) 22, 23 и факторов транскрипции 24, 25 приводит к PAMP-срабатывает иммунитета (PTI).
В дополнение к внеклеточной восприятия PRRS, внутриклеточный распознавание патогенов достигается за счет цитоплазматических рецепторов. Эти многодоменное сопротивление (R) белки содержат вариабельный домен N-конце, центральный нуклеотид-связывающим (NB) мотив, и С-терминального богатого лейцином повторы (LRR) и поэтому называется NB-LRR белки 26, 27. R белки прямо или косвенно признать патогенов молекул, полученных из вирулентности называемых эффекторами, также известный целевой PRRS и другие узлы иммунной системы. Признание вызывает сильную оборону, ведущие к эффекторной-срабатывает иммунитет (ETI) 28-31. NB-LRR белки имеют requisiТе АТФ-связывающий мотив в домене NB 30, 32, но они не имеют киназный домен. Фосфорилирование консервативных областей NB-LRRs было сообщено в крупномасштабной протеомного опроса 33, но его актуальность для ETI непонятно. Аналогично PTI, активация NB-LRR белков приводит к фосфорилирования белков цитоплазмы включая MAPKs 34-37 и CDPKs 38-40. Самое главное, признание эффектор может привести к фосфорилированию вспомогательных белков, которые взаимодействуют непосредственно с белками NB-LRR 41. Некоторые примеры включают RIN4 (арабидопсис) и ВОМ (томатный, Solanum Lycopersicum) белки, которые взаимодействуют с NB-LRR белков, RPM1 42, 43 и 44 Prf, соответственно. Во время заражения Pseudomonas syringae бактерий, эффектор белок AvrB вызывает RIN4 фосфорилирования, скорее всего, рецептор-как киназы RIPK 45,
Эти примеры показывают, что выявление иммунных сложных компонентов и их потенциальных PTMs после признания эффекторной может привести к лучшему пониманию того, как сигналы трансдуцировали от эффекторной восприятия к нижестоящих мишеней. Здесь мы опишем способ очистки белка для NB-LRR-взаимодействующих белков и последующей идентификации их PTMs. Мы используем Nicotiana benthamiana и комплекс помидор Prf / вал отбора мощности в качестве модели, но и тот же протокол может быть легко применены к RLKs от Н. benthamiana и А. THALIANA 53 с небольшими изменениями, мы опишем в рамках протокола.
Protocol
Примечание: все шаги сделаны при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Подготовка материалов и буферов растений
- Для N. benthamiana
- Расти Agrobacterium tumefaciens штаммов интерес для временной экспрессии (в данном примере Prf-FLAG, ПРФ-3xHA, ВОМ-FLAG и пустой вектор в качестве контроля) путем встряхивания (200 оборотов в минуту) в жидкой культуре (L средней с соответствующими антибиотиками) на 28 не ° С до стационарной фазы.
- Сбор и осаждения агробактерии путем центрифугирования (3000 мкг в течение 5 мин). Удалите супернатант и ресуспендируют осаждали Agrobacteria в инфильтрации буфера.
- Измеряют количество агробактерий, получив значение оптической плотности (OD) при оптической плотности 600 нм (ABS 600 нм). Отрегулируйте OD бактерий к 0,1-0,8.
- Проникнуть 4-недельный N. benthamiana растения (22 ° C, 16 ч света) с агробактериями ХанD (с 1-мл безыгольного шприца) или с помощью вакуума (добавить 0,02% объем / объем поверхностно-активное вещество).
Примечание: Используйте первый почти-полностью расширенную лист, и два сразу старые листья для наиболее эффективного экспрессии белка. Для обнаружения убиквитинированных или ацетилированных белков проникнуть листья с 100 нМ MG-132 или 100 нг / мл трихостатин А, соответственно, на 1 и 2-х дней после инфильтрации. - Урожай проникли листья 2-5 дней после инфильтрации и заморозить в жидком азоте. Хранить образцов в -80 ° C морозильник.
Примечание: Определить оптимальный уровень экспрессии интересующего белка заранее путем отбора проб в течение времени течение 5 дней и обнаружить уровни белка с помощью иммуноблоттинга.
- Для А. THALIANA стабильные трансгенных линий
- Расти А. THALIANA семена в 6-луночных планшетах с добавлением 5 мл жидкой среде МС (1% вес / объем сахарозы) на лунку. Положите 4:57 семян (стерилизованных и слоистых) от трансгенной линииинтереса или нетрансформированном линии управления на лунку. Встряхнуть при 200 оборотах в минуту в течение двух дней до передачи тарелку в комнату роста и оставьте на 2 недели (22 ° C, 10 ч света).
- Образцы промыслом и заморозить в жидком азоте.
Примечание: Вы можете использовать в качестве контроля трансгенной линии с выражением неродственного белок с тем же тегом как белка.
- Буферы
- Получают буфер А. де газов буфер в течение 1-2 ч (для RLKs, других мембранных белков и связаны ядерных белков, добавить 1% объем / объем Igepal CA-630 53).
Примечание: Вы можете сохранить буфер А при 4 ° С на неопределенный срок. Можно использовать 1% объем / объем Triton вместо IGEPAL СА-360. - Подготовка 80 мл холодной буфера В, по крайней мере 1-2 часа до экстракции.
Примечание: идеальное соотношение ткани против буфера для экстракции составляет 1:4 (вес / объем).
- Получают буфер А. де газов буфер в течение 1-2 ч (для RLKs, других мембранных белков и связаны ядерных белков, добавить 1% объем / объем Igepal CA-630 53).
2. Белок Добыча
- Непосредственно перед экстракцией подготовить 80 мл холодного буфера C.
- Измельчить 20 г N. benthamiana ткани (примерно 15 листов) или А. THALIANA саженцы (2-4 г на 6-луночный планшет) в жидком азоте с использованием ступки и пестика.
- Добавить 80 мл холодного буфера C к 20 г измельченной ткани, хорошо перемешать и оттаивают на льду.
Примечание: Измельчите все образцы в то же время (представляющего интерес белка и контроля).- Гомогенизируют с 3 всплесков 10 сек каждой на полной скорости с тканевой гомогенизатора (prechilled при 4 ° С). Фильтруют через 22-25 мкм ткани и центрифуге при 30000 х г в течение 30 мин при 4 ° C.
Примечание: В качестве альтернативы, гомогенизации со свежим prechilled ступки и пестика.- Для блокирования и стиральных шагов аффинной матрицы, готовят 20 мл буфера D.
- Блок 100 мл подходящей аффинной матрицы с использованием 500 мл холодного буфера D, содержащем 1% БСА в течение 5 мин при 4 ° C.
Примечание: предпочитаемый афбесконечности матрицы включают анти-FLAG M2 агарозы, Стрептавидин агарозы, GFP-Trap_A и анти-HA агарозы.- Вымойте 3x 1 мл холодного буфера D.
- Удалить супернатант экстракта листьев и фильтруют через фильтрующий шприц 0,45 мкм в новую пробирку на льду.
Примечание: Цвет экстракт должен быть зеленым или желтым; если образец получился коричневый, отбросить и начать все сначала.- Возьмите аликвоту неочищенного экстракта для иммуноблота, добавить 5x SDS-PAGE загрузки буфера, вихрь и денатурации кипячением образцов в течение 10 мин при 80-100 ° С в тепловой блок.
3. Белок Иммунопреципитация
- Разделить белкового экстракта на две 50 мл пробирки и добавить 50 мкл матрицы аффинной суспендировали в буфере D в каждую пробирку. Инкубируют при осторожном вращении в течение 2 часов при 4 ° С.
Примечание: Более длинные инкубации не было обнаружено увеличение урожайности. - Подготовка 600 мкл (6x громкости шарик аффинной матрицы) буфера для элюции, добавив кБуфер D (конечные концентрации): 0,5% BSA, 0,25 мг / мл FLAG пептид (для анти-FLAG M2 агарозы) или 10 мМ D-биотин (для стрептавидин агарозы).
Примечание: Элюция не рекомендуется в случае GFP-Trap_A и анти-HA матриц, так перейдем непосредственно к кипящей в 1x SDS-PAGE загрузки буфера, шаг 3,11. - Осадок аффинной матрицы центрифугированием при 4 ° С (5 мин при 1000 х г).
- Возьмем аликвоту несвязанного экстракта для иммуноблоттинга, отменить остальную часть надосадочной жидкости, в результате чего около 500 мкл на дне пробирки.
- Ресуспендируют суспензии, с наконечником широким отверстием.
- Трансфер смешанную суспензию решение с обеих трубок к одной 1,5 мл трубки.
Примечание: С сегодняшнего дня, использовать 1,5 мл с низким содержанием белка связывания микроцентрифужные пробирки. - Импульсный 3x в течение 5 секунд с помощью настольной центрифуге, чтобы осадить аффинного матрикса и удалить супернатант.
- Вымойте 3-5x с 1 мл холодного буфера D. между моет осадить сродства Матрих, как описано выше, и отбросить супернатант. В последней промывки удалить избыток буфера D с иглой шприца.
Примечание: Окончательное мытье используя буфер D с 0,1% Igepal могут быть использованы для дальнейшего снижения неспецифического связывания. - Элюируют 200 мкл соответствующего буфера элюирования (для анти-FLAG M2 или стрептавидином агарозы см. шаг 3.2) 3x, 5 мин каждый раз при постоянном встряхивании.
- Бассейн на 3 элюаты в одной пробирке. Концентрат белков с помощью 30 мкл поглощения смолы. Vortex, дать постоять 5 мин и осадить смолы (2 мин при 10000 х г). Удалите супернатант.
Примечание: Для GFP-Trap_A и анти-HA агарозы, пропустить шаги 3,9 и 3,10. - Добавить 50 мкл 1x SDS-PAGE загрузки буфера к осажденному матрицы сродства или поглощения смолы. Vortex и кипятят в течение 10 мин при 80-100 ° С в тепловой блок.
- Центрифуга кипяченой аффинного матрикса или смолу для 2 мин при 10000 х г. Алиготе 5 мкл supernatanт для иммуноблота, и работать с другими фракциями на ~ 10 см длинной геля SDS-PAGE (рис. 2).
- Для выделения и идентификации фосфорилированными белков методом масс-спектрометрии, загрузить оставшиеся 45 мкл на ~ 19 см длинной геля SDS-PAGE, если дополнительная разделение требуется (рис. 2).
Примечание: пустой переулок могут быть включены между всеми образцами для уменьшения загрязнения образцов.
4. Белок Пищеварение
- Пятно SDS-PAGE гель с Кумасси бриллиантовым синим (ККЕБ) пятно.
Примечание: Свернуть обработку геля для снижения загрязнения с кератинами. Убедитесь в том, что ни один из оборудования или инструментов не были использованы для иммуноблотинга или других действий, которые могут оставивших загрязнения остаточной белка. - Destain геля с обильным мытья в воде, предпочтительно O / N. Отрежьте полосу интерес из геля с чистой бритвой.
Примечание: Совместите гель с иммуноблоте если necessaры, чтобы найти правильную область. Как фосфорилирование может задержать миграцию белков на SDS-PAGE сократить область непосредственно выше и ниже зоны интереса. - Нарезать куска геля на кубики 2-4 мм (это гарантирует, что гель будет покрыта за счет решений в трубке, не блокируя наконечники). Поместите в трубке.
- Оцените объем необходимой для поддержания гель хорошо погруженной. Используйте эту сумму за производных, инкубации с протеазы и добычи пептида, а затем использовать два-три раза объемов для стирки.
Примечание: В типичный переварить с примерно 100 мкл разрезанных кусочки геля, используйте 500 мкл раствора для стирки, 2 х 180 мкл для обезвоживания, 150 мкл для снижения, 120 мкл для алкилирования, и 120 мкл для пищеварения. - Промыть кусочки геля 2 х 20 мин (или до обесцвечивают), добавив 50% ацетонитрила (в 50 мМ бикарбоната аммони, ABC). Внесите от решения, стараясь не удалить кусочки геля.
- Дегидрировать со 100% Acetoнитрил в течение 5 мин и удаления свободной жидкости.
Примечание: Гель должен появиться усохшие и белый. Если синий цвет сохраняется, инкубировать больше в смеси ацетонитрил / ABC и / или при повышенной температуре (45-55 ° C). - Уменьшите белковые дисульфидные связи путем добавления 10 мМ DTT в воде и выдержать в течение 30-45 мин при 56 ° С при встряхивании. Удалить свободной жидкости.
- Алкилата остатки цистеина добавлением 55 мМ хлорацетамида (в 50 мМ БКА) в течение 20-30 мин (при комнатной температуре, темный). Удалить свободной жидкости.
- Промыть кусочки геля 2 х 10 мин с 50%-ным ацетонитрилом (в 50 мМ БКА). Удалить свободной жидкости.
- Высушить кусочки геля при 100% ацетонитрила в течение 5 мин и удаления свободной жидкости.
- Для расщепления трипсином, добавить 40 мкл рабочего раствора трипсина (100 нг трипсина в пищеварении буфер: 50 мМ БКА, 5% ацетонитрила в течение средним Кумасси-окрашенном полосы). Разрешить кусочки геля увлажняет в течение 10 мин. Добавить достаточное количество пищеварения буфера для покрытия кусочки геля при необходимости. Инкубировать при 37 ° CO / N.
- Чтобы остановить пищеварение и извлечь пептиды с гелевых частей, добавляют 5% муравьиной кислоты (в 50% ацетонитриле) (Добавить тот же объем, что и объема пищеварения). Разрушать ультразвуком в течение 5-10 мин. Передача супернатант в новую пробирку. Повторите экстракции 3 раза.
- Высушите пептиды путем лиофилизации (предпочтительнее) или вакуумной концентратора (например, Speed-Vac или Savant). Хранить при -20 ° С.
- Представьте свой образец для масс-спектрометрии.
Примечание: Мы представили нашу выборку в масс-спектрометрии объекта в The Sainsbury Laboratory (Норидж, Великобритания). Протоколы в массовых объектов спектрометрии значительно различаются, но обычно пептиды будет распущен в 0,2% трифторуксусной кислоты с 2% ацетонитрила перед загрузкой на систему жидкостной хроматографии в сочетании с электро-спрей тандемной масс-спектрометрии.
Representative Results
Мы описываем здесь протокол для очистки меченых белков из стабильной трансгенных А. THALIANA линии или после транзиторной экспрессии белков в N. benthamiana. Как показано на фиг.1, очистка белка-мишени в сочетании с масс-спектрометрией, чтобы позволить идентификацию взаимодействующих белков и PTMs из белка-мишени. Протокол был разработан для очистки белков, участвующих в иммунитете растений и идентификации их PTMs но может быть применен к очистке любой меткой растительного белка.
В качестве примера мы используем очистку комплекса Prf / Pto из N. benthamiana. Трансгенное Н. benthamiana линии 38-12 54, выражая 35S: ВОМ, был временно трансформированные с 35S: Prf-FLAG и комплекс иммунопреципитировали с анти-FLAG M2 агарозы (рис. 2А). Иммуноблотах (IB) в рисунке 2Апоказывают, что большинство из белка-мишени (PRF) подвергали иммунопреципитации. Pto и взаимодействующих эффектор белок AvrPtoB были copurified с Prf и детектировали с использованием антитела и масс-спектрометрического анализа (фиг. 2А и 2В). Мы обнаружили, что карданный что copurified с Prf мигрировали медленнее на SDS-PAGE геля, когда коэкспрессируются с эффектор строит 35S: AvrPto и 35S: AvrPtoB (рис. 2а). Оба эффекторные белки индуцированных медленнее миграцию ПРФ-взаимодействующего ВОМ (рис. 2А). Это эффектор признание зависит от медленно миграция Pto ранее было связано с фосфорилированием, как это могло быть удалена обработкой фосфатазой 44. Для обнаружения сайты фосфорилирования, способствующих медленной миграции ВОМ, мы подвергли Prf copurifying Pto для масс-спектрометрического анализа. Несмотря на высокую экспрессию Pto и его легко обнаружить с иммуноблотах мы могли получить пептиды Covering только 57% от Pto последовательности, и мы не смогли выявить любые сайты фосфорилирования (рис. 2б).
Впоследствии мы изменили стратегию для целевой белок Pto с Anti-Flag. Н. benthamiana WT растения временно трансформированные с 35S: ПРФ-3HA и 35S: Pto-FLAG, с или без 35S: AvrPto и 35S:. AvrPtoB Общая сумма Pto белка, включающий как ПРФ-комплекс и свободные формы, иммунопреципитировали с анти-FLAG M2 агарозы и подвергали SDS-PAGE фракционирования, в геле триптического пищеварения и масс-спектрометрического анализа (рис. 2С). При таком подходе мы определили ВОМ пептиды, охватывающие около 80% своей последовательности и неизвестный 100 кДа взаимодействующий белок. Мы определили набор одно-и двухместных сайтов фосфорилирования на ВОМ пептидов 187-202 и 188-202 (табл. 1). Ser-198 и Тре-199 были преобладающими сайты фосфорилирования, но и другие фоsphorylation сайты были также обнаружены (табл. 1). Наиболее важно двойной фосфорилирование по Ser-198 и Thr-199 был идентифицирован только в присутствии либо эффекторных белков (табл. 1). Недавно мы определили аналогичный набор ВОМ сайтов фосфорилирования и проиллюстрированы значимость двоеборья фосфорилирования для сигнализации 47. После протоколу, описанному здесь мы смогли определить динамические изменения в фосфорилирования белка-мишени.
Рисунок 1. Генеральный план эксперимента. Целевой белок для иммунопреципитации (IP) помечен и выражается в Планта, временно в Nicotiana benthamiana или стабильно в арабидопсис. После экстракции белкацелевой белок иммунопреципитации с аффинной матрицы. Белки разделяются на гель акриламида с помощью электрофореза. Гель полосы вырезали. Белки экстрагировали из геля полос и подвергали масс-спектрометрии. Сайты фосфорилирования и взаимодействующие белки идентифицированы. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Prf и Pto иммунопреципитацию.). Конструкцию 35S: Prf-флаг был временно экспрессируется в 38-12 линии (35S: PTO) вместе с пустым вектором (EV), 35S: AvrPto или 35S: AvrPtoB. Через три дня после инфильтрации Prf подвергали иммунопреципитации с использованием анти-FLAG аффинного матрикса. IMMUпроводились noblots (IB) для Prf, AvrPtoB и отбора мощности. Как отметил стрелками в нижней части Pto иммуноблоттинге панели, AvrPto и AvrPtoB вызвать медленную миграцию отбора мощности. B). Конструкцию 35S: Prf-флаг был временно экспрессируется в 38-12 линии (35S: PTO) вместе с пустым вектором (EV), 35S: AvrPto или 35S: AvrPtoB. Через три дня после инфильтрации Prf подвергали иммунопреципитации с использованием анти-FLAG агарозы и отделенный на SDS-PAGE. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим (ККЕБ) и видимой Prf, ВОМ и AvrPtoB белки полосы вырезали из геля и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Пептид охват процент отбора мощности и PRF последовательностей, определенных масс-спектрометрии указывается. C). Конструкции 35S: Prf-3xHA и 35S: ПТО-ФЛАГ были временно экспрессируется вместе с 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto или пустой вектор (EV) в N. benthamiana. Три дня после инфильтрационным общее количествоПТО-ФЛАГ иммунопреципитировали помощью Anti-Flag агарозы и решен на SDS-PAGE. Видимая Pto и Pto-взаимодействующий белок полосы вырезали из геля и анализировали с помощью масс-спектрометрии. ВОМ и 100 кДа ПТО-взаимодействующих полоса белка хорошо видны на коллоидной кумасси бриллиантовым голубым (ККЕБ) цветного геля, в то время как Prf немного менее заметными (как показано стрелками). IP: Иммунопреципитация; И.Б.: Иммуноблот; CBB: окраски кумасси бриллиантовым синим; ККЕБ: Кумасси бриллиантовым синим. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| Prf | |||
| Е.В. | AvrPto | AvrPtoB | |
| Pto пептид 188-202 | |||
| GTELDQ [р Т 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [р S 198] TVVK | 10 | 7 | 5 |
| GTELDQTHLS [р Т 199] ВВК | 8 | 3 | 4 |
| G [р Т 190] ELDQTHLS [р Т 199] ВВК | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [р S 198] [р Т 199] ВВК | 0 | 8 | 4 |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| Pto пептид 187-202 | |||
| KGTELDQ [р Т 195] HLS TVVK | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [р S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [р Т 199] ВВК 4 | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [р Т 195] HLS [р Т 199] ВВК | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [р S 198] [р Т 199] ВВК | 0 | 7 | 5 |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| Пептиды 187-202 и 188-202 | 83 | 88 | 50 |
| Процент пептидов с двух событий фосфорилирования | 0% | 26,9% | 11,2% |
| Pto Последовательность покрытия | 78% | 79% | 82% |
Таблица 1 Двухместный фосфорилирования пептида Pto при активации сигнализации 35S:.. ПРФ-3xHA и 35S: ПТО-ФЛАГ были временно экспрессируется вместе с Е.М.PTY векторные (EV), 35S: AvrPto или 35S: AvrPtoB в N. benthamiana. Три дня после инфильтрации общая сумма ПТО-FLAG белка иммунопреципитировали использованием анти-FLAG аффинного матрикса и решен на SDS-PAGE. Видимые полосы МОМ на коллоидной кумасси бриллиантовым голубым цветного геле, вырезали и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Количество ВОМ пептидов, идентифицированных с 0, 1, 2 и событий фосфорилирования указано.
| Таблица буферов | ||
| Л среды | Триптон | 10 г / л |
| Дрожжевой экстракт | 5 г / л | |
| NaCl | 5 г / л | |
| D-глюкозы | 1 г / л | |
| Агро-инфильтрация буфер | MgCl 2 | 10 мМ |
| МЧС </ TD> | 10 мМ | |
| Отрегулируйте до рН 5,5 | ||
| Ацетосирингона (опционально) | 150 мкм | |
| Буфер | РН Трис-HCl 7,5 | 150 мМ |
| NaCl | 150 мМ | |
| ЭДТА | 5 мм | |
| ЭГТА | 2 мм | |
| Глицерин | 5% (объем / объем) | |
| Буфер B | Буфер | |
| ПВПП | 2% (вес / объем) | |
| Буфер C | Буфер B | |
| Дитиотреитола (DTT) | 10 мМ | |
| Завод ингибитор протеазы коктейль | 1% (объем / объем) | |
| Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) | 0,5 мМ | |
| Calyculin | 50 нМ | |
| Фторид натрия (NaF) | 50 мМ | |
| Молибдат натрия (Na 2 MoO 4) | 10 мМ | |
| Ортованадата натрия | 1 мм | |
| Окадаевая кислоты | 100 нМ | |
| Буфер D | Буфер C без PVPP | |
| 5x SDS-PAGE загрузки буфера | РН Трис-HCl 6,8 | 60 мм |
| SDS | 2% | |
| Глицерин | 0,15% | |
| Бромфенол синий | 0,10% | |
| DTT (добавить непосредственно перед использованием) | 50 мМ |
Таблица 2. Буферизации и СМИ рецепты.
Discussion
Выяснение механизма активации рецептора на PAMPs и эффекторов могут внести значительный вклад в наше понимание иммунитета растений. В последние 20 лет, генетические и дрожжей двух гибридных экранов играют важную роль для открытия РРСС и NB-LRR белков. Совсем недавно, масс-спектрометрии протоколы на основе было создано для идентификации белков регулируется по-разному в течение иммунной сигнализации 55-58, их PTMs 11,33,59,60, состав иммунных комплексов 61 и 62 эффектора цели. Здесь мы опишем простой протокол для идентификации PTMs регулирующих активацию иммунных комплексов.
По сравнению с ранее описанными протоколов, этот протокол позволяет подробной идентификации динамических изменений PTMs. Протоколы крупномасштабных протеомики подходов может определить PTMs белков, но не в состоянии раскрыть сайта пластичность PTMs из-за ограниченияред количество белка. В случае фосфорилирования белков, крупномасштабные протеомики подходы обычно только определить преобладающие сайтов фосфорилирования 11,33,59. Подробное характеристика состояния фосфорилирования белков требует значительного количества белка, который может быть получен только путем частичной очистки целевого белка 47. Протокол, описанный здесь парам Protein Purification подход, который дает существенное количество белка-мишени, с масс-спектрометрического анализа очищенного белка. После этого протокола, одно событие фосфорилирования Pto было связано преимущественно с Ser-198, как описано выше 52, но некоторые масс-спектры спектрометрии также поддерживается одно событие фосфорилирования на Тре-195 или THR-199. Когда наблюдались двойные события фосфорилирования ПТО, преобладающим сочетание фосфорилированными аминокислот было Ser-198 и Тре-199, хотя наблюдались и комбинации на других сайтах (Табл. 1). Эти результаты ясно показывают фосфорилирование сайта пластичность протеинкиназ и способность описанного протокола для характеристики в деталях все возможные сайты фосфорилирования.
Наиболее важные шаги этого протокола являются: 1) достаточно экстракция белков; 2) защита PTMs и 3) достаточное количество белка-мишени. Во-первых, в течение достаточного экстракции белков, важно, чтобы размолоть ткани в жидком азоте и в дальнейшем использовать тканевом гомогенизаторе, как описано в протоколе. Если ткань гомогенизатор не доступен, ступка и пестик могут быть использованы. Важно также использовать соотношение 2:59 (или четыре) граммов ткани в объеме экстракционного буфера. Эта ткань в буфер соотношение и высокую буферную силу, что мы предлагаем гарантирует, что рН останется нейтральным в процессе экстракции. Мы обнаружили, что это имеет особое значение для А. THALIANA и томатный дополнительнаястрельчатые 52. Защита PTMs может быть достигнуто путем включения во всех буферов соответствующие ингибиторы ферментов, которые можно удалить PTMs. Важно также, чтобы выполнить все шаги при 4 ° С и prechill буферы и инструменты. Более высокие выходы целевого белка может быть достигнуто с помощью растений, экспрессирующих белок в достаточных количествах и с помощью большое количество ткани (примерно 20 г). Наиболее важным шагом для получения достаточного количества белка-мишени концентрирует целевого белка путем прямого иммунопреципитацией. Значение этого шага будет выделен нашей связи с неустановлением PTMs ПТО после иммунопреципитацией Prf из-за ограниченного количества coimmunoprecipitated ВОМ (рис. 2В). В противоположность этому, прямое иммунопреципитация Pto дали значительно более ощутимые пептиды (рис. 2, в), ведущие к примерно 80% покрытия белковой последовательности и идентификации PTMs (табл. 1). Мы также улrongly рекомендуем использовать эпитопных-тегов для белка иммунопреципитацией. По сравнению с антителами, индуцированными против нативных белков эпитоп-метки аффинной матрицы может дать более высокие количества частично очищенного белка. Используя антитела поднял против родной Pto белка 51 (рис. 2А) для иммунопреципитации, мы смогли определить только один фосфорилирования двух преобладающих сайтов фосфорилирования ПТО.
Этот протокол в первую очередь был разработан для частичной очистки N. benthamiana цитоплазматический белок и последующее определение их сайтов фосфорилирования. Однако, использование модификации описанных здесь, этот протокол может быть легко адаптирована для А. THALIANA белки и мембранные связаны белки. Основная цель этого протокола является, чтобы получить достаточное количество белка-мишени для идентификации PTMs, а не для достижения высокой чистоты комплекса. Если более высокой чистотыкомплекса требуется второй этап очистки может быть добавлен к этому протоколу 52. В этом случае первым шагом позволит элюирование целевого белка от аффинной матрицы без использования высоких соли или кислоты и последующей стадии может повлечь за собой матрицу, которая требует суровых условий элюирования. Важно подчеркнуть, что мы проверили только этот протокол для идентификации сайтов фосфорилирования и что мы в настоящее время испытываем свою способность к детальной идентификации дополнительных PTMs.
Наши репрезентативные результаты четко демонстрируют сайт фосфорилирования пластичность протеинкиназ и способность описанного протокола для характеристики сайты фосфорилирования. Самое главное, они подчеркивают, что выявление сайтов фосфорилирования, полагающихся в низком количестве белков методом масс-спектрометрии и одиночными точечными мутациями авто-сайтов фосфорилирования может давать неверные показания. Мы показываем здесь и ранее 47 47,63 показали, что точечные мутации из Ser-198 и THR-199 на аланин, которые предотвращают фосфорилирование на этих сайтах, способны сигнализации предполагая, что фосфорилирование этих сайтов не является необходимым условием для комплексной активации . Эти результаты теперь можно объяснить фосфорилирования вторичном узле Thr-195. Похожие проникновение в фосфорилирования сайта пластичности другой протеинкиназы можно получить после этого протокола. Кроме того, комбинированный подход с использованием сайтов фосфорилирования точечные мутации, белки, которые могут ингибировать определенные киназы (эффекторов) в сочетании с белковой иммунопреципитации и масс-спектрометрического анализа приведет к лучшему пониманию эволюционного значения в фосфорилирования сайта пластичности протеинкиназ.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы (финансовые или другие).
Acknowledgments
В.Н. поддерживается Королевского общества. JPR является Австралийский исследовательский совет Будущее сотрудник (FT0992129). Мы благодарим доктора Мириам Гиффорд для критически чтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
References
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
