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Biology

संयंत्र प्रोटीन परिसरों के बाद translational संशोधनों की पहचान

Published: February 22, 2014 doi: 10.3791/51095
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2, 3, 1
1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

Summary

हम यहां संयंत्र प्रोटीन परिसरों की शुद्धि और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम एक परिसर के भीतर एक प्रोटीन immunoprecipitating द्वारा, तो हम इसके बाद translational संशोधनों और अपनी बातचीत भागीदारों की पहचान कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है.

Abstract

संयंत्रों धारणा विस्तृत करने के कारण बदलते परिवेश और प्रणालियों संकेत करने के लिए जल्दी से अनुकूलित. रोगज़नक़ हमले के दौरान, पौधों को तेजी से प्रतिरक्षा परिसरों की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से संक्रमण का जवाब. प्रतिरक्षा परिसरों के सक्रियण ऐसे phosphorylation, ग्लाइकोसिलेशन, या ubiquitination के रूप में प्रोटीन के बाद translational संशोधनों (PTMs), के साथ जुड़ा हुआ है. इन PTMs नृत्य कर रहे हैं समझ कैसे प्रतिरोध हासिल की है की एक बेहतर समझ को बढ़ावा मिलेगा.

यहाँ हम न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी leucine संपन्न दोहराने (नो LRR) बातचीत प्रोटीन और उनके बाद translational संशोधनों (PTMs) के बाद पहचान के लिए एक प्रोटीन शोधन विधि का वर्णन. छोटे संशोधनों के साथ, प्रोटोकॉल अन्य संयंत्र प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता है. विधि बाद में आंशिक रूप से शुद्ध होता है जो ब्याज की प्रोटीन, बी के एक मिलान टैग संस्करण की अभिव्यक्ति पर आधारित हैY immunoprecipitation और बातचीत प्रोटीन और PTMs की पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन है.

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि: मैं). ऐसे phosphorylation रूप PTMs में गतिशील परिवर्तन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है, द्वितीय). यह ब्याज की प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में है, और इस immunoprecipitate की शुद्धता की कमी के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं महत्वपूर्ण है, iii). ब्याज की एक प्रोटीन की PTMs का पता लगाने के लिए आदेश में, यह प्रोटीन प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए immunoprecipitated हो गया है.

Introduction

इम्यून रास्ते तेजी से संकेत transduce और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 को सक्रिय करने के लिए प्रोटीन के विभिन्न बाद translational संशोधनों (PTMs) पर भरोसा करते हैं. PTMs प्रोटीन रचना, गतिविधि, स्थिरता, स्थानीयकरण, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 2-4 प्रभावित कर सकते हैं कि प्रोटीन संरचना का तेजी से प्रतिवर्ती, और अति विशिष्ट रासायनिक परिवर्तन होते हैं. पौधों में, PTMs के 300 से अधिक प्रकार के ubiquitination, sumoylation, Sulfation, ग्लाइकोसिलेशन, और phosphorylation 2,5 सहित पहचान की गई है. सबूत के एक बढ़ती शरीर संयंत्र उन्मुक्ति 1,5,6 के विभिन्न पहलुओं में PTMs के महत्व पर प्रकाश डाला गया. प्रोटीन phosphorylation, एक सेरीन के लिए एक फॉस्फेट समूह की प्रतिवर्ती लगाव, threonine या tyrosine अवशेषों कई सेलुलर कार्यों की एक नियामक है और आश्चर्य नहीं कि सबसे उच्च Cascades 5-11 संकेत संयंत्र बचाव में PTM का अध्ययन किया. Phosphorylation निर्भर संकेतन संयंत्र टॉवर का एक अभिन्न हिस्सा हैएनएसई सक्रियण multidomain प्रतिरोध प्रोटीन 5,8 द्वारा transmembrane रिसेप्टर्स द्वारा रोगाणुओं के बाह्य धारणा, या intracellular मान्यता के बाद शुरू की.

पौधों पर हमला करने पर, रोगाणुओं पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) 12 बुलाया प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स द्वारा पता चला रहे हैं. ज्ञात PRRs रिसेप्टर की तरह प्रोटीन (RLPs) या रिसेप्टर की तरह kinases (RLKs), दोनों एक ligand बाध्यकारी ectodomain ले जाने और एक एकल पास transmembrane डोमेन या तो कर रहे हैं. RLPs के विपरीत, RLKs एक intracellular kinase डोमेन 13-15 है. PRRs की ectodomain RLKs के मामले में, intracellular डोमेन 6, 16 के भीतर autophosphorylation और transphosphorylation करने, रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के प्रमुख बुलाया संरक्षित सूक्ष्म जीव elicitor अणुओं को बांधता है. PRRs की धारणा प्रेरित phosphorylation के बहाव, kinases 17 सहित cytoplasmic प्रोटीन के बाद phosphorylation, 18 पी, E3 19 ligases, mitogen सक्रिय प्रोटीन kinases (MAPKs) 20, 21, कैल्शियम पर निर्भर प्रोटीन kinases (CDPK) PAMP ट्रिगर प्रतिरक्षा (पीटीआई) के लिए 22, 23, और प्रतिलेखन 24 कारकों, 25 होता है.

PRRs द्वारा बाह्य धारणा के अलावा, रोगजनकों के intracellular मान्यता cytoplasmic रिसेप्टर्स के माध्यम से हासिल की है. ये multidomain प्रतिरोध (नि.) प्रोटीन एक चर एन टर्मिनस डोमेन, एक केंद्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी (नो बॉल) आकृति, और सी टर्मिनल leucine संपन्न दोहराता (LRR) होते हैं और इसलिए नो बॉल LRR प्रोटीन 26, 27 कहा जाता है. आर प्रोटीन सीधे या परोक्ष रूप से भी PRRs और प्रतिरक्षा प्रणाली के अन्य नोड्स को लक्षित करने के लिए जाना जाता effectors बुलाया रोगज़नक़ व्युत्पन्न डाह अणुओं की पहचान. मान्यता प्रेरक ट्रिगर प्रतिरक्षा (ETI) 28-31 के लिए अग्रणी मजबूत गढ़ लाती है. नो बॉल LRR प्रोटीन एक requisi हैते नायब डोमेन 30, 32 के भीतर आकृति एटीपी बाध्यकारी, लेकिन वे एक kinase डोमेन की कमी है. नो बॉल Lrrs के संरक्षित डोमेन की phosphorylation एक बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक सर्वेक्षण 33 में सूचित किया गया, लेकिन ETI के लिए अपनी प्रासंगिकता स्पष्ट नहीं है. इसी पीटीआई को, नो बॉल LRR प्रोटीन की सक्रियता MAPKs 34-37 और CDPKs 38-40 सहित cytoplasmic प्रोटीन की phosphorylation की ओर जाता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रेरक मान्यता नो बॉल LRR प्रोटीन 41 के साथ सीधे बातचीत कि गौण प्रोटीन की phosphorylation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कुछ उदाहरणों में नो बॉल LRR प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन है कि RIN4 (Arabidopsis thaliana) और Pto (टमाटर, टमाटर) शामिल हैं, RPM1 42, 43 और क्रमशः PRF 44,. स्यूडोमोनास syringae बैक्टीरिया से संक्रमण के दौरान, प्रेरक प्रोटीन AvrB, रिसेप्टर की तरह kinase RIPK 45 से सबसे अधिक संभावना है, RIN4 phosphorylation लाती पी. syringae AvrPto और AvrPtoB Pto 47 की phosphorylation प्रेरित effectors. एक kinase डोमेन का अभाव है और पार phosphorylated होना चाहिए जो RIN4 के विपरीत, Pto ऑटो phosphorylation 48 और substrates 49, 50 के पार phosphorylation में सक्षम एक सक्रिय kinase है. Pto सिगनल की प्रेरक निर्भर दीक्षा के लिए अपने kinase गतिविधि की आवश्यकता है, kinase मृत Pto म्यूटेंट अभी भी एक प्रेरक स्वतंत्र तरीके से 51 में संकेत कर रहे हैं. हमने हाल ही में PRF / Pto जटिल कई PRF युक्त, oligomeric है और Pto 52 अणु और एक ही परिसर के भीतर Pto अणुओं 47 एक दूसरे के पार phosphorylate कर सकते हैं कि प्रदर्शन से इन टिप्पणियों की व्याख्या की. हम Pto (सेंसर) के एक अणु बारी में एक दूसरे Pto अणु (सहायक) बुद्धि को सक्रिय करता है कि नो बॉल LRR प्रोटीन (PRF) के लिए एक रचना परिवर्तन के कारण, प्रेरक प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान, जिसमें एक मॉडल का प्रस्तावजटिल हिन. इसके बाद सहायक Pto अणु सेंसर Pto जटिल प्रतिरोध 47 से भरा सक्रियण के लिए अग्रणी पार phosphorylates.

ये उदाहरण प्रेरक मान्यता पर प्रतिरक्षा जटिल उपकरणों और उनके संभावित PTMs की पहचान संकेत बहाव के लक्ष्यों के लिए प्रेरक धारणा से transduced रहे हैं की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है. यहाँ हम नो बॉल LRR बातचीत प्रोटीन और उनके PTMs के बाद पहचान के लिए एक प्रोटीन शोधन विधि का वर्णन. हम एक मॉडल के रूप में निकोटियाना benthamiana और टमाटर PRF / Pto जटिल उपयोग करें, लेकिन एक ही प्रोटोकॉल आसानी एन से RLKs के लिए लागू किया जा सकता है benthamiana और ए छोटे संशोधनों के साथ thaliana 53 हम प्रोटोकॉल के भीतर का वर्णन के रूप में.

Protocol

नोट: जब तक अन्यथा कहा सभी कदम है, कमरे के तापमान पर किया जाता है.

1. संयंत्र सामग्री और बफ़र की तैयारी

  1. एन के लिए benthamiana
    1. Agrobacterium (इस उदाहरण में PRF-झंडा, PRF-3xHA, PTO-झंडा और एक नियंत्रण के रूप में खाली वेक्टर) 28 पर तरल संस्कृति (उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एल मध्यम) में (200 आरपीएम) के झटकों से क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए ब्याज की उपभेदों tumefaciens बढ़ो स्थिर चरण तक सी °.
    2. लीजिए और centrifugation (5 मिनट के लिए 3000 XG) द्वारा agrobacteria गोली. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और घुसपैठ बफर में pelleted agrobacteria resuspend.
    3. 600 एनएम के एक absorbance पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) मूल्य (एबीएस 600 एनएम) प्राप्त करने के द्वारा agrobacteria की मात्रा को मापने. 0.1-0.8 बैक्टीरिया के आयुध डिपो को समायोजित करें.
    4. 4 सप्ताह पुराने एन घुसपैठ हान द्वारा agrobacteria साथ benthamiana पौधों (22 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा प्रकाश)(एक 1 एमएल needleless सिरिंज के साथ) या वैक्यूम (0.02% v / वी surfactant जोड़ने) द्वारा डी.
      नोट: पहले लगभग पूरी तरह से विस्तार पत्ती का प्रयोग करें, और सबसे प्रभावी प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए दो तुरंत पुरानी पत्तियों. Ubiquitinated या acetylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए 100 एनएम एमजी-132 या 100 एनजी / एमएल Trichostatin ए, क्रमश: 1 और 2 दिनों के बाद घुसपैठ के साथ पत्तियों घुसपैठ.
    5. घुसपैठ की पत्तियों 2-5 दिनों के बाद घुसपैठ और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज हार्वेस्ट. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों की दुकान.
      नोट: पहले से 5 दिनों के समय के पाठ्यक्रम पर नमूने लेने और immunoblotting से प्रोटीन के स्तर का पता लगाने के द्वारा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति का सबसे अच्छा स्तर निर्धारित करते हैं.
  2. ए के लिए thaliana स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों
    1. ए बढ़ो 6 अच्छी तरह प्लेटें में thaliana बीज प्रति अच्छी तरह से तरल एमएस माध्यम के 5 मिलीलीटर (वी सुक्रोज w / 1%) के साथ पूरक. ट्रांसजेनिक लाइन के पांच बीज (निष्फल और स्तरीकृत) को तीन रखोब्याज या अच्छी तरह से प्रति untransformed नियंत्रण रेखा के. एक विकास के कमरे में थाली स्थानांतरित करने से पहले दो दिनों के लिए 200 rpm पर हिला और 2 सप्ताह (22 डिग्री सेल्सियस, 10 घंटा प्रकाश) के लिए छोड़ दें.
    2. फसल के नमूने और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज.
      नोट: आप एक नियंत्रण के रूप में ब्याज की प्रोटीन के रूप में एक ही टैग के साथ एक असंबंधित प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग कर सकते हैं.
  3. बफ़र
    1. 1-2 घंटे के लिए बफर ए डी गैस बफर तैयार (RLKs के लिए, अन्य झिल्ली बाध्य प्रोटीन और परमाणु प्रोटीन, 1% v / वी IGEPAL सीए -630 53 जोड़).
      नोट: आप अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर रख सकते हैं. आप ट्राइटन के बजाय IGEPAL CA-360 वी / 1% V का उपयोग कर सकते हैं.
    2. निकासी से पहले ठंड बफर बी में कम से कम 1-2 घंटे की 80 मिलीलीटर की तैयारी.
      नोट: निष्कर्षण बफर बनाम ऊतक के आदर्श अनुपात 01:04 (w / v) है.

2. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. बस से पहले निकासी करने ठंड बफर सी. की 80 मिलीलीटर की तैयारी
  2. एन की 20 ग्राम पीस benthamiana ऊतक (लगभग 15 पत्ते) या ए एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करते हुए तरल नाइट्रोजन में thaliana seedlings (6 अच्छी तरह से थाली प्रति 2-4 छ).
  3. , जमीन ऊतक के 20 ग्राम तक ठंड बफर सी की 80 मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण अच्छी तरह से, और बर्फ पर पिघलना.
    नोट: एक ही समय (ब्याज और नियंत्रण के प्रोटीन) में सभी नमूनों पीस.
  4. (4 डिग्री सेल्सियस पर prechilled) एक ऊतक homogenizer साथ पूरी गति से 10 सेकंड के 3 फटने के साथ homogenize. 4 में 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर एक 22-25 माइक्रोन ऊतक और अपकेंद्रित्र के माध्यम से फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक ताजा prechilled मोर्टार और मूसल के साथ homogenize.
  5. आत्मीयता मैट्रिक्स के अवरुद्ध और धोने कदम के लिए, बफर डी. की 20 मिलीलीटर की तैयारी
  6. 4 में 5 मिनट के लिए 1% BSA युक्त ठंड बफर डी की 500 मिलीलीटर का उपयोग उपयुक्त आत्मीयता मैट्रिक्स के ब्लॉक 100 मिलीलीटर डिग्री सेल्सियस
    नोट: पसंदीदा वायुसेनाFINITY matrices विरोधी झंडा M2 agarose, Streptavidin agarose, GFP Trap_A और विरोधी हा agarose शामिल हैं.
  7. 1 मिलीलीटर ठंड बफर डी. के साथ 3X धो
  8. बर्फ पर एक नया ट्यूब में 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पत्ती निकालने और फिल्टर की सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    नोट: निकालने का रंग हरा या पीला होना चाहिए, नमूना भूरे रंग बदल गया है, तो त्यागने और अधिक शुरू.
  9. , Immunoblot के लिए कच्चे तेल निकालने के एक विभाज्य लो 5x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर, भंवर जोड़ने और 80-100 पर 10 मिनट के लिए उबलते नमूने द्वारा denature एक गर्मी ब्लॉक में सी °.

3. प्रोटीन Immunoprecipitation

  1. दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रोटीन निकालने विभाजित है और प्रत्येक ट्यूब करने के लिए बफर डी में निलंबित आत्मीयता मैट्रिक्स के 50 μl जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कोमल रोटेशन के साथ सेते
    नोट: अब incubations उपज बढ़ाने के लिए नहीं पाया गया है.
  2. को जोड़कर क्षालन बफर के 600 μl (आत्मीयता मैट्रिक्स की 6x मनका मात्रा) तैयार करेंबफर डी (अंतिम सांद्रता): 0.5% बीएसए, (विरोधी झंडा M2 agarose के लिए) 0.25 मिलीग्राम / एमएल झंडा पेप्टाइड या (Streptavidin agarose के लिए) 10 मिमी डी बायोटिन.
    नोट: क्षालन GFP-Trap_A और विरोधी हा matrices के मामले में सिफारिश नहीं है, तो 1x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर में उबलते के लिए सीधे आगे बढ़ना, 3.11 कदम.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस (1,000 XG पर 5 मिनट) पर centrifugation द्वारा आत्मीयता मैट्रिक्स वेग.
  4. , Immunoblot के लिए अपार निकालने के एक विभाज्य लो सतह पर तैरनेवाला के बाकी त्यागें, ट्यूब के नीचे में लगभग 500 μl छोड़ने.
  5. एक विस्तृत बोर टिप के साथ घोल समाधान Resuspend.
  6. एक भी 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए दोनों ट्यूब से मिश्रित घोल समाधान स्थानांतरण.
    नोट: अब से, microfuge ट्यूबों बाध्यकारी 1.5 मिलीलीटर कम प्रोटीन का उपयोग करें.
  7. आत्मीयता मैट्रिक्स वेग और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र का उपयोग 5 सेकंड के लिए पल्स 3x.
  8. Washes के बीच 1 एमएल ठंड बफर डी के साथ 3-5X धो आत्मीयता मातृ वेगएक्स के रूप में पहले से वर्णित है और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. पिछले धोने में एक सिरिंज की सुई के साथ अतिरिक्त बफर डी को हटा दें.
    नोट: 0.1% IGEPAL साथ बफर डी का उपयोग कर एक अंतिम धोने आगे अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. लगातार झटकों के साथ (एंटी झंडा M2 या Streptavidin agarose देखें 3.2 कदम के लिए) उपयुक्त क्षालन बफर के 200 μl 3x, 5 मिनट के साथ हर बार Elute.
  10. एक ट्यूब में 3 eluates पूल. अवशोषण राल के 30 μl का उपयोग करके प्रोटीन ध्यान लगाओ. भंवर, 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ और राल (10,000 XG पर 2 मिनट) वेग चलो. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    नोट: GFP-Trap_A और विरोधी हा agarose के लिए, कदम 3.9 और 3.10 छोड़ें.
  11. उपजी आत्मीयता मैट्रिक्स या अवशोषण राल के लिए 1x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर के 50 μl जोड़ें. 80-100 पर 10 मिनट के लिए भंवर और फोड़ा एक गर्मी ब्लॉक में सी °.
  12. एक्स छ 10,000 पर 2 मिनट के लिए उबला हुआ आत्मीयता मैट्रिक्स या राल अपकेंद्रित्र. Supernatan की विभाज्य 5 μlimmunoblot के लिए टी, और एक ~ 10 सेमी लंबे एसडीएस पृष्ठ जेल (चित्रा 2) पर अन्य भागों के साथ चला रहे हैं.
  13. अतिरिक्त जुदाई (चित्रा 2) आवश्यक है, तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जुदाई और phosphorylated प्रोटीन की पहचान के लिए, एक ~ 19 सेमी लंबे एसडीएस पृष्ठ जेल पर शेष 45 μl लोड.
    नोट: एक खाली लेन नमूनों के प्रदूषण को कम करने के लिए सभी नमूनों के बीच शामिल किया जा सकता है.

4. प्रोटीन पाचन

  1. कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू (cCBB) दाग के साथ एसडीएस पृष्ठ जेल दाग.
    नोट: keratins साथ प्रदूषण को कम करने के लिए जेल की हैंडलिंग न्यूनतम. उपकरण या उपकरणों में से कोई भी immunoblotting या अवशिष्ट प्रोटीन संदूषण छोड़ दिया है हो सकता है कि अन्य गतिविधियों के लिए इस्तेमाल किया गया है कि सुनिश्चित करें.
  2. पानी में प्रचुर धोने, अधिमानतः हे / एन के साथ जेल destain एक स्वच्छ धार के साथ जेल से ब्याज की बैंड काटें.
    नोट: immunoblot साथ जेल संरेखित अगर necessaसही क्षेत्र का पता लगाने के लिए RY. Phosphorylation एसडीएस पृष्ठ पर प्रोटीन के पलायन में देरी कर सकते हैं तुरंत ब्याज के बैंड के ऊपर और नीचे क्षेत्र में कटौती.
  3. (इस जेल विंदुक युक्तियाँ अवरुद्ध बिना ट्यूब में समाधान द्वारा कवर किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है) 2-4 मिमी के स्थान पर क्यूब्स में जेल टुकड़ा पासा. एक ट्यूब में रखें.
  4. जेल में अच्छी तरह से जलमग्न रखने के लिए आवश्यक मात्रा का अनुमान है. Derivatization, प्रोटीज और पेप्टाइड निष्कर्षण के साथ ऊष्मायन के लिए इस राशि का उपयोग करें, और तब धोने के लिए ट्रिपल संस्करणों के लिए डबल का उपयोग करें.
    नोट: एक ठेठ में कटौती जेल टुकड़े के लगभग 100 μl के साथ पचा धोने के लिए 500 μl समाधान, निर्जलीकरण के लिए 2 X 180 μl, कमी, alkylation के लिए 120 μl, और पाचन के लिए 120 μl के लिए 150 μl का उपयोग करें.
  5. (50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, एबीसी) में 50% acetonitrile जोड़कर जेल टुकड़े 2 एक्स 20 मिनट (या destained तक) धो लें. जेल टुकड़े को दूर करने के लिए नहीं ख्याल रख समाधान बंद पिपेट.
  6. 100% Aceto साथ निर्जलीकरण5 मिनट के लिए Nitrile और मुक्त तरल हटा दें.
    नोट: जेल सिकुड़ा हुआ और सफेद दिखाई देनी चाहिए. नीले रंग बनी रहती है, acetonitrile / एबीसी में और / या ऊंचा तापमान (45-55 डिग्री सेल्सियस) पर अब सेते हैं.
  7. पानी में 10 मिमी डीटीटी जोड़कर प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने और झटकों के साथ 56 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए सेते हैं. मुक्त तरल निकालें.
  8. 20-30 मिनट (कमरे के तापमान, अंधेरे) के लिए (50 मिमी एबीसी) में 55 मिमी chloroacetamide के अलावा द्वारा केलेट सिस्टीन अवशेषों. मुक्त तरल निकालें.
  9. (50 मिमी एबीसी) में 50% acetonitrile साथ जेल टुकड़े 2 एक्स 10 मिनट धो लें. मुक्त तरल निकालें.
  10. 5 मिनट के लिए 100% acetonitrile साथ जेल टुकड़े निर्जलीकरण और मुक्त तरल हटा दें.
  11. Tryptic के लिए, पचाने trypsin काम कर समाधान के 40 μl (पाचन बफर में trypsin के 100 एनजी: 50 मिमी एबीसी, एक औसत Coomassie से सना हुआ बैंड के लिए 5% acetonitrile) जोड़ें. जेल टुकड़े 10 मिनट के लिए rehydrate करने की अनुमति दें. यदि आवश्यक हो तो जेल टुकड़े को कवर करने के लिए पाचन बफर के लिए पर्याप्त जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेओ / एन
  12. पाचन को रोकने और जेल टुकड़े से पेप्टाइड्स निकालने, 5% चींटी एसिड (50% acetonitrile में) (पाचन मात्रा के रूप में एक ही मात्रा जोड़) जोड़ने के लिए. 5-10 मिनट के लिए Sonicate. नई ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. निकासी 3x दोहराएँ.
  13. Lyophilization (पसंद) या (जैसे स्पीड Vac या विद्वान के रूप में) एक शून्य concentrator द्वारा पेप्टाइड्स सूखी. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  14. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए अपने नमूना प्रस्तुत करें.
    नोट: हम Sainsbury प्रयोगशाला (नॉर्विच, ब्रिटेन) में मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए हमारे नमूना प्रस्तुत की. मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधाओं में प्रोटोकॉल में काफी भिन्नता है, लेकिन आम तौर पर पेप्टाइड्स मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री स्प्रे विद्युत मिलकर तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली पर लोड करने से पहले 2% acetonitrile के साथ 0.2% trifluoroacetic एसिड में भंग कर दिया जाएगा.

Representative Results

हम स्थिर ट्रांसजेनिक ए से टैग प्रोटीन की शुद्धि के लिए यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन thaliana लाइनों या एन में प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद benthamiana. चित्रा 1 में सचित्र रूप में लक्षित प्रोटीन की शुद्धि बातचीत प्रोटीन और लक्षित प्रोटीन की PTMs की पहचान की अनुमति मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित है. प्रोटोकॉल संयंत्र उन्मुक्ति और उनके PTMs की पहचान में शामिल प्रोटीन की शुद्धि के लिए डिजाइन किया गया है, लेकिन किसी भी टैग किए गए संयंत्र प्रोटीन की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता है.

एक उदाहरण के रूप में हम एन से PRF / Pto परिसर के शुद्धीकरण का उपयोग benthamiana. ट्रांसजेनिक एन 35S व्यक्त benthamiana लाइन 38-12 54,: PTO, क्षणिक 35S के साथ बदल गया था: PRF-झंडा और जटिल विरोधी झंडा M2 agarose (2A चित्रा) के साथ immunoprecipitated गया था. चित्रा 2A में immunoblots (आईबी)लक्षित प्रोटीन (PRF) के सबसे immunoprecipitated गया था कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना. पीटीओ और बातचीत प्रेरक प्रोटीन AvrPtoB PRF साथ copurified और (आंकड़े 2A और 2 बी) एंटीबॉडी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग पाया गया. AvrPto और 35S: AvrPtoB (2A चित्रा) हम प्रेरक 35S constructs के साथ coexpressed जब PRF साथ copurified कि Pto एसडीएस पृष्ठ जेल पर धीमी माइग्रेट पाया. दोनों प्रेरक प्रोटीन PRF बातचीत Pto (2A चित्रा) की धीमी प्रवास प्रेरित किया. यह फॉस्फेट 44 के साथ इलाज के द्वारा हटाया जा सकता है के रूप में Pto की इस प्रेरक मान्यता पर निर्भर धीमी माइग्रेशन पहले phosphorylation के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. Pto की धीमी गति से प्रवास करने के लिए योगदान phosphorylation साइटों का पता लगाने के लिए, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने PRF copurifying Pto अधीन. Pto की उच्च अभिव्यक्ति और immunoblots साथ अपने आसान पता लगाने के बावजूद हम पेप्टाइड्स सी पुनः प्राप्त कर सकताPto अनुक्रम का केवल 57% overing और हम किसी भी phosphorylation साइटों (चित्रा 2 बी) की पहचान करने में विफल रहा.

इसके बाद, हम विरोधी झंडा. एन के साथ Pto प्रोटीन को लक्षित करने के लिए रणनीति बदल PRF-3HA और 35S: PTO-झंडा के साथ या 35S बिना: AvrPto और 35S: benthamiana गुम्मट पौधों क्षणिक 35S के साथ बदल रहे थे. AvrPtoB PRF-complexed और मुफ्त रूपों दोनों शामिल Pto प्रोटीन, की कुल राशि immunoprecipitated था विरोधी झंडा M2 agarose और एसडीएस पृष्ठ fractionation में जेल tryptic पाचन और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण (चित्रा -2) के अधीन है. इस दृष्टिकोण के साथ हम अपने अनुक्रम का लगभग 80% और एक अज्ञात 100 केडीए बातचीत प्रोटीन फैले Pto पेप्टाइड्स की पहचान की. हम Pto पेप्टाइड्स 187-202 और 188-202 (तालिका 1) के लिए सिंगल और डबल phosphorylation साइटों का एक सेट की पहचान की. Ser-198 और thr-199 प्रमुख phosphorylation साइटों लेकिन अन्य फोटो थेsphorylation साइटों को भी पता चला रहे थे (1 टेबल). Ser-198 और thr-199 पर सबसे महत्वपूर्ण बात यह डबल phosphorylation ही प्रेरक प्रोटीन (तालिका 1) या तो की उपस्थिति में पहचान की थी. हमने हाल ही में Pto phosphorylation साइटों की एक समान सेट की पहचान की और 47 संकेतन के लिए डबल phosphorylation घटना के महत्व को सचित्र. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के बाद हम लक्ष्य प्रोटीन की phosphorylation राज्य में गतिशील परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. जनरल प्रयोगात्मक डिजाइन. लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation (आईपी) के लिए क्षणिक निकोटियाना benthamiana में या stably Arabidopsis thaliana में, Planta में टैग और व्यक्त किया है. प्रोटीन निकासी के बादलक्ष्य प्रोटीन एक आकर्षण मैट्रिक्स के साथ immunoprecipitated है. प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक acrylamide जेल पर अलग हो रहे हैं. जेल बैंड excised हैं. प्रोटीन जेल बैंड से निकाला और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन हैं. Phosphorylation साइटों और बातचीत प्रोटीन की पहचान कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. PRF और Pto immunoprecipitation. ए). निर्माण 35S: PRF-झंडा क्षणिक 38-12 रेखा (35S: PTO) में व्यक्त की गई थी खाली वेक्टर (ईवी) के साथ साथ, 35S: AvrPto या 35S: AvrPtoB. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PRF विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स का उपयोग immunoprecipitated गया था. ImmuPRF, AvrPtoB और Pto के लिए noblots (आईबी) का प्रदर्शन किया गया. Pto immunoblot पैनल के नीचे तीरों से कहा, AvrPto और AvrPtoB) Pto. बी की एक धीमी प्रवास को प्रेरित. निर्माण 35S: PRF-झंडा क्षणिक 38-12 रेखा (35S: PTO) में व्यक्त की गई थी खाली वेक्टर (ईवी) के साथ साथ, 35S: AvrPto या 35S: AvrPtoB. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PRF विरोधी झंडा agarose का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गया था. जेल कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू (cCBB) और दिखाई PRF साथ सना हुआ था, Pto और AvrPtoB प्रोटीन बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान Pto और PRF दृश्यों का प्रतिशत पेप्टाइड कवरेज संकेत दिया है. सी). निर्माणों 35S: PRF-3xHA और 35S: PTO-झंडा क्षणिक 35S के साथ व्यक्त किया गया: AvrPtoB, 35S: AvrPto या एन में खाली वेक्टर (ईवी) benthamiana. तीन दिनों में कुल राशि के बाद घुसपैठPTO-झंडा agarose विरोधी ध्वज का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर हल किया गया था. दिखाई Pto और Pto बातचीत प्रोटीन बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया. PRF (तीर द्वारा संकेत के रूप में) से थोड़ा कम दिखाई देता है जबकि पीटीओ और 100 केडीए PTO-बातचीत प्रोटीन बैंड, कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू (cCBB) दाग जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. आईपी: Immunoprecipitation, आईबी: Immunoblot, CBB: Coomassie खूब ब्लू धुंधला; cCBB: कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू धुंधला हो जाना. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

PRF
ईवी AvrPto AvrPtoB
पीटीओ पेप्टाइड 188-202
GTELDQ [पी टी 195] HLSTVVK 1 0
GTELDQTHL [पी एस 198] TVVK 10 7 5
GTELDQTHLS [पी टी 199] VVK 8 3 4
जी [पी टी 190] ELDQTHLS [पी टी 199] VVK 0 1 2
GTELDQTHL [पी एस 198] [पी टी 199] VVK 0 8 4
GTELDQTHLSTVVK 46 26 48
पीटीओ पेप्टाइड 187-202
KGTELDQ [पी टी 195] एचएलएस TVVK 0 1 0
KGTELDQTHL [पी एस 198] TVVK 17 17 12
KGTELDQTHLS [पी टी 199] VVK 4 2 2
KGTELDQ [पी टी 195] एचएलएस [पी टी 199] VVK 0 1 1
KGTELDQTHL [पी एस 198] [पी टी 199] VVK 0 7 5
KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18
पेप्टाइड्स 187-202 और 188-202 83 88 50
दो phosphorylation घटनाओं के साथ पेप्टाइड्स का प्रतिशत 0% 26.9% 11.2%
पीटीओ अनुक्रम कवरेज 78% 79% 82%

तालिका 1 35S संकेत के सक्रियण पर एक PTO पेप्टाइड का डबल phosphorylation:.. PRF-3xHA और 35S: PTO-झंडा क्षणिक उन्हें साथ साथ व्यक्त किया गयाPty वेक्टर (ईवी), 35S: AvrPto या 35S: एन में AvrPtoB benthamiana. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PTO-झंडा प्रोटीन की कुल राशि विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर हल किया गया था. कोलाइडयन Coomassie शानदार नीले दाग जेल पर Pto दिखाई बैंड मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ excised और विश्लेषण किया गया. Pto 0 के साथ की पहचान पेप्टाइड्स, 1, और 2 phosphorylation घटनाओं की संख्या संकेत दिया है.

बफ़र्स के पटल
एल मध्यम Tryptone 10 जी / एल
खमीर निकालने 5 ग्राम / एल
NaCl 5 ग्राम / एल
डी ग्लूकोज 1 जी / एल
कृषि घुसपैठ बफर 2 MgCl 10 मिमी
एमईएस </ P> 10 मिमी
5.5 पीएच को समायोजित करें
Acetosyringone (वैकल्पिक) 150 माइक्रोन
बफर Tris-एचसीएल 7.5 पीएच 150 मिमी
NaCl 150 मिमी
EDTA 5 मिमी
EGTA 2 मिमी
ग्लिसरोल 5% (v / v)
बफर बी बफर
PVPP 2% (w / v)
बफर सी बफर बी
Dithiothreitol (डीटीटी) 10 मिमी
प्लांट protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल 1% (v / v)
Phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) 0.5 मिमी
Calyculin एक 50 एनएम
सोडियम फ्लोराइड (NAF) 50 मिमी
सोडियम molybdate (2 ना मू 4) 10 मिमी
सोडियम Orthovanadate 1 मिमी
Okadaic एसिड 100 एनएम
बफर डी बफर सी PVPP बिना
5x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर Tris-एचसीएल 6.8 पीएच 60 मिमी
एसडीएस 2%
ग्लिसरोल 0.15%
Bromophenol नीले 0.10%
डीटीटी (बस का उपयोग करने से पहले जोड़) 50 मिमी

तालिका 2. बफर और मीडिया व्यंजनों.

Discussion

PAMPs और effectors द्वारा रिसेप्टर सक्रियण के तंत्र elucidating संयंत्र उन्मुक्ति के बारे में हमारी समझ के लिए काफी योगदान दे सकते हैं. पिछले 20 वर्षों में, आनुवंशिक और खमीर दो संकर स्क्रीन PRRs और नो बॉल LRR प्रोटीन की खोज के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हाल ही में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटोकॉल 55-58 संकेत प्रतिरक्षा, उनके PTMs 11,33,59,60 दौरान विभिन्न विनियमित प्रोटीन की पहचान के लिए स्थापित किया गया है, प्रतिरक्षा परिसरों 61 और प्रेरक की रचना 62 लक्ष्य. यहाँ हम प्रतिरक्षा परिसरों की सक्रियता को विनियमित करने PTMs की पहचान के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन.

पहले वर्णित प्रोटोकॉल के साथ इसकी तुलना में, इस प्रोटोकॉल PTMs के गतिशील परिवर्तन की विस्तृत पहचान देता है. बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण के प्रोटोकॉल प्रोटीन की PTMs पहचान लेकिन सीमित करने के कारण PTMs की साइट plasticity प्रकट करने में सक्षम नहीं हो सकताएड प्रोटीन की मात्रा. प्रोटीन phosphorylation के मामले में बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण आमतौर पर केवल प्रमुख phosphorylation साइटों 11,33,59 पहचान. एक प्रोटीन phosphorylation स्थिति की विस्तृत विशेषताओं केवल लक्ष्य प्रोटीन 47 का आंशिक शोधन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन का एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है. प्रोटोकॉल शुद्ध प्रोटीन का मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ, जोड़ों यहाँ लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में पैदावार कि एक प्रोटीन शुद्धि दृष्टिकोण का वर्णन किया. इस प्रोटोकॉल के बाद Pto की एकल phosphorylation घटना पहले 52 के रूप में वर्णित Ser-198 के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार ठहराया है, लेकिन कुछ मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्पेक्ट्रा भी Thr-195 या Thr-199 पर एक एकल phosphorylation घटना का समर्थन किया था. Pto की डबल phosphorylation घटनाओं मनाया गया जब अन्य साइटों पर संयोजन भी मनाया गया, हालांकि, phosphorylated अमीनो एसिड के प्रमुख संयोजन (SER-198 और thr-199 थातालिका 1). इन परिणामों से स्पष्ट रूप से प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity और विवरण में हर संभव phosphorylation साइटों को चिह्नित करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल की क्षमता प्रदर्शित करता है.

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: प्रोटीन की 1) पर्याप्त निकासी; PTMs के 2) सुरक्षा और लक्ष्य प्रोटीन की 3) पर्याप्त राशि. सबसे पहले, प्रोटीन की पर्याप्त निकासी के लिए, यह तरल नाइट्रोजन में ऊतक पीसने के लिए और बाद में प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ऊतक homogenizer का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक ऊतक homogenizer उपलब्ध नहीं है, तो एक मोर्टार और मूसल इस्तेमाल किया जा सकता है. यह तीन (या चार) निष्कर्षण बफर की मात्रा को ऊतक के ग्राम के लिए एक के अनुपात का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. अनुपात और हम सुझाव है कि उच्च शक्ति बफर बफर करने के लिए इस ऊतक पीएच निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान तटस्थ रहेगा यह सुनिश्चित करेगा. हम इस ए के लिए विशेष महत्व का है कि पाया thaliana और टमाटर अतिरिक्तctions 52. PTMs की सुरक्षा के सभी बफ़र्स PTMs निकाल सकते हैं कि एंजाइमों की उचित inhibitors में शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है. यह 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों को पूरा करने के लिए और buffers और उपकरणों prechill के लिए भी महत्वपूर्ण है. लक्ष्य प्रोटीन की अधिक पैदावार के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन व्यक्त पौधों का उपयोग करके और ऊतक (लगभग 20 ग्राम) की उच्च मात्रा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रत्यक्ष immunoprecipitation द्वारा लक्ष्य प्रोटीन ध्यान केंद्रित कर रहा है. इस कदम के महत्व के कारण coimmunoprecipitated Pto (चित्रा 2 बी) के सीमित राशि को एक PRF immunoprecipitation के बाद Pto की PTMs की पहचान करने के लिए हमारी विफलता से प्रकाश डाला है. इसके विपरीत, Pto के प्रत्यक्ष immunoprecipitation प्रोटीन अनुक्रम और PTMs (1 टेबल) की पहचान की लगभग 80% कवरेज के लिए अग्रणी काफी अधिक औसत दर्जे का पेप्टाइड्स (चित्रा -2) मिले. हम भी सेंटrongly प्रोटीन immunoprecipitation के लिए मिलान टैग के इस्तेमाल की सिफारिश. देशी प्रोटीन का मिलान टैग आत्मीयता मैट्रिक्स के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी की तुलना में आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटीन की उच्च मात्रा प्राप्ति कर सकते हैं. Immunoprecipitation के लिए देशी Pto प्रोटीन 51 (2A चित्रा) के खिलाफ उठाया एक एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम Pto के दो प्रमुख phosphorylation साइटों के केवल एक phosphorylation की पहचान करने में सक्षम थे.

इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एन के आंशिक शुद्धि के लिए विकसित किया गया है benthamiana cytoplasmic प्रोटीन और उनके phosphorylation साइटों के बाद पहचान. हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित संशोधन का उपयोग कर, इस प्रोटोकॉल आसानी ए के लिए अनुकूलित किया जा सकता thaliana प्रोटीन और झिल्ली बाध्य प्रोटीन. इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य PTMs की पहचान के लिए लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उपज के लिए और जटिल की उच्चतम शुद्धता को प्राप्त करने के लिए नहीं है. यदि उच्च शुद्धताजटिल आवश्यक है की शुद्धि के दूसरे चरण में इस प्रोटोकॉल 52 में जोड़ा जा सकता है. उस मामले में, एक पहला कदम कठोर क्षालन स्थितियों की आवश्यकता है, जो उच्च लवण या एसिड के उपयोग और बाद के कदम के बिना आत्मीयता मैट्रिक्स से लक्ष्य प्रोटीन की क्षालन एक मैट्रिक्स आवश्यक हो सकता है की अनुमति देगा. यह हम केवल phosphorylation साइटों की पहचान के लिए इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया है और हम वर्तमान में अतिरिक्त PTMs की विस्तृत पहचान के लिए अपनी क्षमता का परीक्षण कर रहे हैं कि है कि उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है.

हमारे प्रतिनिधि परिणाम स्पष्ट रूप से प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity और phosphorylation साइटों को चिह्नित करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल की क्षमता प्रदर्शित करता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, वे मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा और ऑटो phosphorylation साइटों के एकल बिंदु उत्परिवर्तन से प्रोटीन की कम राशि में भरोसा phosphorylation साइटों की पहचान भ्रामक परिणाम दे सकता है कि प्रकाश डाला. हम यहाँ और पहले दिखाने के 47 47,63 Ser-198 और thr-199 के एकल बिंदु उत्परिवर्तन जटिल सक्रियण के लिए एक शर्त है कि इन साइटों की है कि phosphorylation सुझाव संकेत करने में सक्षम हैं, इन साइटों पर phosphorylation नहीं है जो रोकने, alanine को पता चला है कि . इन परिणामों अब द्वितीयक साइट Thr-195 की phosphorylation द्वारा समझाया जा सकता है. अन्य प्रोटीन kinase की phosphorylation साइट plasticity में इसी प्रकार की अंतर्दृष्टि इस प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, phosphorylation साइटों का उपयोग कर एक संयुक्त दृष्टिकोण म्यूटेशन, प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity की विकासवादी महत्व की एक बेहतर समझ को बढ़ावा मिलेगा प्रोटीन immunoprecipitation और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ मिलकर विशिष्ट kinases (effectors) को बाधित कर सकते हैं कि प्रोटीन इशारा करते हैं.

Disclosures

लेखकों वे (वित्तीय या अन्य) कोई प्रतिस्पर्धा हितों है कि घोषणा.

Acknowledgments

वी.एन. रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित है. JPR एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य बंदे (FT0992129) है. हम समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ. मरियम जिफोर्ड धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MgCl2 Sigma M8266
MES Sigma M8250
Acetosyringone Sigma D134406 toxic - 1 M stock in DMSO
Syringe 1 ml sterile Terumo
Syringe needle Terumo NN-2525R
Silwet L-77 (surfactant) Lehle Seeds VIS-01 toxic
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) Sigma C2211 1 M stock in DMSO, store at -80 °C
MS salts Sigma M5524 oxidizing, toxic
Sucrose Sigma 16104
Trizma base Sigma T1503 adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer
NaCl Sigma S3014 5 M stock
EDTA Sigma E6758 toxic - 0.5 M stock
EGTA Sigma E4378
Glycerol National Diagnostics EC-606
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 corrosive
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) Sigma P5288 do not confuse with PVP
DTT (DL-dithiothreitol) Sigma 43815 toxic - 1 M stock, store at -20 °C
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 do not freeze/thaw too many times
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) Sigma P7626 corrosive, toxic
Calyculin A Cell Signaling Technology 9902
Sodium Fluoride (NaF) Sigma S7920 toxic - 1 M stock
Sodium Molybdate (Na2MoO4) Sigma S6646 0.5 M stock
Sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma 450243 toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. 
Okadaic acid Santa Cruz Biotechnology sc-3513
Kinematica Polytron tissue homogeniser Fisher Scientific 08-451-320
Miracloth Merck Millipore 475855-1R
anti-FLAG M2 agarose Sigma A2220 this matrix is recommended
Streptavidin-agarose Thermo-Scientific 20347 this matrix is recommended
GFP-Trap_A Chromotek gta-20 this matrix is recommended
Anti-HA-Agarose Sigma A2095 this matrix is recommended
0.45 μm filter VWR 513-1902
BSA Sigma A7906
FLAG peptide Sigma F3290
D-biotin Sigma 47868
StrataClean resin Agilent 400714 this absorption resin is recommended for protein precipitation
Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad
PROTEAN II XL Cell Biorad
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 this stain is recommended
Protein low-binding tubes (LoBind) Eppendorf 0030 108.116 these tubes are recommended
Ammonium bicarbonate (ABC) Sigma 9830 toxic
Acetonitrile VWR 83639 toxic, flammable
2-chloroacetamide Sigma 22790 toxic
Trypsin Promega V5280 irritant, sensitizing
Formic acid Sigma 14265 toxic, corrosive
Water-bath sonicator Ultravawe Ultra BT Ultrasonic Bath
LTQ-Orbitrap XL Thermo-Scientific
Trichostatin A Sigma T8552 toxic

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References

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Piquerez, S. J. M., Balmuth, A. L., Sklenář, J., Jones, A. M. E., Rathjen, J. P., Ntoukakis, V. Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes. J. Vis. Exp. (84), e51095, doi:10.3791/51095 (2014).

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