Summary
We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.
Abstract
Planten zich snel aanpassen aan veranderende omgevingen te wijten aan de perceptie werken en signaleringssystemen. Tijdens pathogeen aanval, planten snel te reageren op infectie via de werving en activering van immuuncomplexen. Activering van immuuncomplexen wordt geassocieerd met post-translationele modificaties (PTMs) van eiwitten, zoals fosforylering, glycosylering of ubiquitinering. Begrijpen hoe deze PTMs zijn gechoreografeerd zal leiden tot een beter begrip van hoe de weerstand wordt bereikt.
Hier beschrijven we een werkwijze voor eiwitzuivering-nucleotide bindende leucine-rich repeat (NB-LRR)-interagerende eiwitten en de daaropvolgende identificatie van de post-translationele modificaties (PTMs). Met kleine aanpassingen, kan het protocol worden toegepast voor de zuivering van andere plantaardige eiwitten complexen. De methode is gebaseerd op de expressie van een epitoop-gemerkte versie van het eiwit van belang, dat vervolgens gedeeltelijk gezuiverd by immunoprecipitatie en onderworpen aan massaspectrometrie voor identificatie van interagerende eiwitten en PTMs.
Dit protocol blijkt dat: i). Dynamische veranderingen in PTMs zoals fosforylering kan worden gedetecteerd door massaspectrometrie, ii). Het is belangrijk om voldoende hoeveelheden van het eiwit van belang hebben, en dit kan compenseren voor het gebrek aan zuiverheid van het immunoprecipitaat, iii). Om PTMs van een eiwit van belang te detecteren, dit eiwit moet immunologisch voldoende hoeveelheid eiwitten.
Introduction
Immune paden langs diverse post-translationele modificaties (PTMs) van eiwitten snel transduceren signalen en activeert immuunresponsen 1. PTMs zijn snel, reversibel en zeer specifieke chemische veranderingen in eiwitstructuur dat eiwit conformatie, activiteit, stabiliteit, lokalisatie en eiwit-eiwit interacties 2-4 beïnvloeden. In planten, hebben meer dan 300 soorten PTMs geïdentificeerd waaronder ubiquitination, sumoylation, sulfatering, glycosylering, fosforylering en 2,5. Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst op het belang van PTMs in verschillende aspecten van plantaardige immuniteit 1,5,6. Eiwitfosforylering, de omkeerbare bevestiging van een fosfaatgroep aan een serine, threonine of tyrosine is een regulator van vele cellulaire functies en niet verrassend de meest bestudeerde PTM in verdediging van planten signaleringscascades 5-11. Fosforylatie-afhankelijke signalering is een integraal onderdeel van plantaardige defense activering gestart na extracellulaire perceptie van microben door transmembraanreceptoren, of intracellulaire erkenning door multidomein resistentie eiwitten 5,8.
Bij de invasie van planten, zijn microben ontdekt door plasmamembraan receptoren genaamd patroonherkenning receptoren (PRRS) 12. Bekend PRRs zijn ofwel receptor-achtige eiwitten (RLPs) of receptor-achtige kinasen (RLKs), beide met een ligandbindend ectodomein en een single-pass transmembraan domein. In tegenstelling tot RLPs, RLKs een intracellulair kinasedomein 13-15. Het ectodomein van PRRS bindt aan geconserveerde microbe opwekkende moleculen genaamd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) leidende, bij RLKs tot autofosforylering en transfosforylering in het intracellulaire domein 6, 16. Stroomafwaarts van waarneming geïnduceerde fosforylering van PRRS, na fosforylering van cytoplasmatische eiwitten, waaronder kinases 17, 18, E3 ligasen 19, mitogeen geactiveerde eiwitkinasen (MAPK's) 20, 21, calcium-afhankelijke proteïnekinasen (CDPK) 22, 23 en transcriptiefactoren 24, 25 leidt tot PAMP-triggered immuniteit (PTI).
Naast de extracellulaire waarneming door PRRS wordt intracellulaire opname van pathogenen bereikt door cytoplasmatische receptoren. Deze multidomain weerstand (R) proteïnen bevatten een variabel N-uiteinde domein, een centrale nucleotide-bindende (NB) motief, en C-terminale leucine-rijke herhalingen (LRR) en derhalve NB-LRR eiwitten 26, 27 genoemd. R-eiwitten direct of indirect herkennen van een pathogeen afkomstig virulentie moleculen genaamd effectoren, ook bekend PRRS en andere knooppunten van het immuunsysteem te richten. Erkenning induceert sterke verdediging leidt tot-effector geactiveerd immuniteit (ETI) 28-31. NB-LRR eiwitten een requisite ATP-bindende motief binnen de NB-domein 30, 32, maar ze missen een kinase domein. Fosforylering van geconserveerde domeinen van NB-LRRs is gemeld bij een grootschalige proteomics onderzoek 33, maar de relevantie ETI is onduidelijk. Net zoals bij PTI, activering van NB-LRR eiwitten leidt tot fosforylering van cytoplasmatische eiwitten waaronder MAPKs 34-37 en CDPKs 38-40. Het belangrijkste is, kan effector erkenning leiden tot fosforylering van accessoire eiwitten die directe interactie met de NB-LRR-eiwitten 41. Enkele voorbeelden zijn RIN4 (Arabidopsis thaliana) en Pto (tomaat, Solanum lycopersicum) eiwitten die interageren met NB-LRR eiwitten, RPM1 42, 43 en Prf 44, respectievelijk. Tijdens infectie door Pseudomonas syringae bacteriën, de effector eiwit AvrB RIN4 induceert fosforylering, waarschijnlijk de receptor-like kinase RIPK 45,
Deze voorbeelden tonen aan dat de identificatie van immuuncomplex componenten en hun potentieel PTMs bij effector herkenning kan leiden tot een beter begrip van hoe signalen getransduceerd van effector waarneming stroomafwaartse doelwitten. Hier beschrijven we een eiwit zuiveringsmethode voor NB-LRR-interagerende eiwitten en de latere identificatie van hun PTMs. We maken gebruik van Nicotiana benthamiana en de tomaat Prf / Pto complex als een model, maar hetzelfde protocol kan eenvoudig worden toegepast op RLKs van N. benthamiana en A. thaliana 53 met kleine aanpassingen zoals we beschrijven in het protocol.
Protocol
Opmerking: alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.
1. Bereiding van plantaardige materialen en Buffers
- Voor N. benthamiana
- Groeien de Agrobacterium tumefaciens stammen van belang zijn voor tijdelijke expressie (in dit voorbeeld Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG en lege vector als controle) door schudden (200 rpm) in vloeibare cultuur (L medium met geschikte antibiotica) bij 28 ° C tot stationaire fase.
- Verzamel pellet agrobacteriën door centrifugeren (3000 g gedurende 5 minuten). Gooi en resuspendeer gepilleerd agrobacteriën in infiltratie buffer.
- Meet de hoeveelheid agrobacteriën door het verkrijgen van de optische dichtheid (OD) waarde bij een absorptie van 600 nm (Abs 600 nm). Stel de OD van bacteriën 0,1-0,8.
- Infiltreren 4 weken oude N. benthamiana planten (22 ° C, 16 uur licht) met agrobacteriën door hand (met 1 ml naaldloze injectiespuit) of vacuüm (voeg 0,02% v / v oppervlakteactieve stof).
Opmerking: Gebruik de eerste bijna-volledig uitgevouwen blad, en de twee onmiddellijk oudere bladeren voor de meest effectieve proteïne-expressie. Voor detectie van geübiquitineerde of geacetyleerd eiwitten infiltreren bladeren met 100 nM MG-132 of 100 ng / ml trichostatine A, respectievelijk op 1 en 2 dagen na de infiltratie. - Oogst de geïnfiltreerde bladeren 2-5 dagen na de infiltratie en vries in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in een -80 ° C vriezer.
Opmerking: Bepaal het beste niveau van expressie van het eiwit van belang vooraf door bemonstering in een tijdsverloop van 5 dagen en detecteren eiwitniveaus door immunoblotting.
- Voor A. thaliana stabiele transgene lijnen
- Grow A. thaliana zaden in 6-well platen gesupplementeerd met 5 ml vloeibaar MS-medium (1% gew / vol sucrose) per putje. Zet 3-5 zaden (gesteriliseerd en gelaagde) van de transgene lijnvan belang of de getransformeerde controle lijn per putje. Schudden bij 200 rpm gedurende twee dagen alvorens de plaat een kweekkamer en laat gedurende 2 weken (22 ° C, 10 uur licht).
- Oogst monsters en vries in vloeibare stikstof.
Opmerking: u kunt gebruiken als een controle een transgene lijn uiten van een niet verwant eiwit met hetzelfde label als het eiwit van belang.
- Buffers
- Bereid buffer A. De gas-buffer gedurende 1-2 uur (voor RLKs andere membraangebonden eiwitten en nucleaire eiwitten, voeg 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
Opmerking: U kunt blijven Buffer A bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. U kunt gebruik maken van 1% v / v Triton plaats van IGEPAL CA-360. - Bereid 80 ml koude buffer B minstens 1-2 uur voor extractie.
Opmerking: De ideale verhouding weefsel versus extractiebuffer 1:4 (w / v).
- Bereid buffer A. De gas-buffer gedurende 1-2 uur (voor RLKs andere membraangebonden eiwitten en nucleaire eiwitten, voeg 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
2. Protein Extraction
- Net voor de extractie bereiden 80 ml koude buffer C.
- Maal 20 g N. benthamiana weefsel (ongeveer 15 bladeren) of A. thaliana zaailingen (2-4 g per 6-wells plaat) in vloeibare stikstof met behulp van een vijzel en stamper.
- Voeg 80 ml koud Buffer C aan de 20 g gemalen weefsel, meng goed, en ontdooien op ijs.
Opmerking: Grind alle monsters op hetzelfde moment (eiwit van interesse en controle). - Homogeniseer met 3 uitbarstingen van 10 seconden elk bij volle snelheid een weefselhomogenisator (voorgekoeld bij 4 ° C). Filtreer door een 22-25 urn weefsel en centrifugeer bij 30.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
Opmerking: Als alternatief, homogeniseren met een frisse voorgekoeld mortier en een stamper. - Voor het blokkeren en wasstappen van de affiniteitsmatrix, bereiden 20 ml buffer D.
- Blok 100 ml geschikte affiniteitsmatrix met 500 ml koude buffer D bevattende 1% BSA gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Voorkeur affinity matrices omvatten anti-FLAG M2 agarose, Streptavidin agarose, GFP-Trap_A en anti-HA agarose. - Wash 3x met 1 ml koude buffer D.
- Verwijder supernatant van extract en filter door een 0,45 urn spuit filter in een nieuwe buis op ijs.
Opmerking: Het extract kleur moet groen of geel zijn, als het monster bruin is geworden, weggooien en opnieuw beginnen. - Neem een monster van het ruwe extract immunoblot, voeg 5x SDS-PAGE laadbuffer, vortex en denatureren door koken monsters gedurende 10 minuten bij 80-100 ° C in een warmte-blok.
3. Eiwit Immunoprecipitatie
- Verdeel het eiwit extract in twee 50 ml buisjes en voeg 50 ul van de affiniteitsmatrix gesuspendeerd in buffer D aan elke buis. Incubeer met zachte rotatie gedurende 2 uur bij 4 ° C.
Opmerking: Langere incubatie zijn niet gevonden om de opbrengst te verhogen. - Bereid 600 ul (6x kraal volume affiniteitsmatrix) elutiebuffer door aanBuffer D (uiteindelijke concentraties): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG-peptide (voor anti-FLAG M2 agarose) of 10 mm D-biotine (voor Streptavidin agarose).
Opmerking: De elutie wordt niet aanbevolen in het geval van GFP-Trap_A en anti-HA matrices, dus ga direct aan de kook in 1x SDS-PAGE laadbuffer, stap 3.11. - Neerslag de affiniteitsmatrix door centrifugeren bij 4 ° C (5 min bij 1000 xg).
- Een aliquot van de ongebonden extract immunoblot, de rest van de bovenstaande vloeistof, waardoor ongeveer 500 pi in de bodem van de buis.
- Resuspendeer de slurry oplossing met een wide-bore tip.
- Breng de gemengde slurry oplossing van beide buizen naar een 1,5 ml buis.
Opmerking: Van nu af aan, gebruik 1,5 ml lage eiwitbinding microfugebuizen. - Pulse 3x 5 seconden met behulp van een tafelcentrifuge om de affiniteit matrix neerslaan en verwijder het supernatant.
- Was 3-5x met 1 ml koude buffer D. Tussen de wasbeurten neerslaan de affiniteit Matrix zoals eerder beschreven en gooi het supernatant. In de laatste wasbeurt verwijdert overtollige Buffer D met de naald van een injectiespuit.
Opmerking: Een laatste wassing met Buffer D met 0,1% IGEPAL kan worden gebruikt om verder te reduceren specifieke binding. - Elueren met 200 ul van de juiste elutie buffer (voor anti-FLAG M2 of Streptavidin agarose zie stap 3.2) 3x, 5 min elke keer met constant schudden.
- Verzamel de 3 eluaten in een enkele buis. Concentreer de eiwitten met 30 ui van absorptie hars. Vortex, laat staan voor 5 min en neerslaan van de hars (2 min bij 10.000 xg). Verwijder het supernatant.
Opmerking: Voor GFP-Trap_A en anti-HA agarose, slaat u de stappen 3.9 en 3.10. - Voeg 50 ul van 1x SDS-PAGE laadbuffer aan de neergeslagen affiniteitmatrix of absorptie hars. Vortex en kook gedurende 10 minuten bij 80-100 ° C in een warmte-blok.
- Centrifugeer de gekookte affiniteitsmatrix of hars gedurende 2 min bij 10.000 x g. Aliquot 5 pi van de supernatant voor immunoblot en lopen met andere fracties op een ~ 10 cm lang SDS-PAGE gel (Figuur 2).
- Voor scheiding en identificatie van de gefosforyleerde eiwitten door massaspectrometrie, laadt de resterende 45 ui op een ~ 19-cm SDS-PAGE-gel als extra scheiding vereist (figuur 2).
Opmerking: Een lege baan kunnen tussen alle monsters om verontreiniging van monsters te beperken.
4. Eiwitvertering
- Vlekken op de SDS-PAGE-gel met colloïdaal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) vlek.
Opmerking: Minimaliseer pakken van de gel om besmetting te verminderen met keratine. Zorg ervoor dat geen van de apparatuur of instrumenten zijn gebruikt voor immunoblotting of andere activiteiten die restverontreiniging eiwit zou hebben verlaten. - Destain de gel met overvloedig wassen in water, bij voorkeur O / N. Snijd de band van belang uit de gel met een schone scheermesje.
Opmerking: Breng de gel met de immunoblot als noodzakelijkerwijsry om de juiste plek te lokaliseren. Zoals fosforylering migratie van eiwitten kan vertragen op SDS-PAGE snijd het gebied direct boven en onder de band van belang. - Snijd de gel sneetje in blokjes van 2-4 mm (dit zorgt ervoor dat de gel van oplossingen in de buis vallen zonder blokkering pipetpunten). Plaats in een buis.
- Schatten het volume dat nodig is om de gel goed onder water te houden. Gebruik dit bedrag voor derivatisering, incubatie met protease en peptide extractie, en dubbelklik vervolgens gebruiken om triple volumes voor het wassen.
Opmerking: In een typische verteren met ongeveer 100 ul van de snede gel stukken, gebruik 500 ul oplossing voor het wassen, 2 x 180 ul voor uitdroging, 150 ul voor reductie, 120 ul voor alkylering en 120 ul voor de spijsvertering. - Was de gelstukken 2 x 20 min (of totdat ontkleurd) door toevoeging van 50% acetonitril (in 50 mM ammoniumbicarbonaat, ABC). Pipetteer van de oplossing zorg gel stukken niet te verwijderen.
- Dehydrateren met 100% acetonitril gedurende 5 minuten en verwijder vrije vloeistof.
Opmerking: De gel moet gekrompen en wit verschijnen. Wanneer de blauwe kleur blijft, langer incuberen in acetonitril / ABC en / of bij verhoogde temperatuur (45-55 ° C). - Verminder eiwit disulfidebindingen door het toevoegen van 10 mM DTT in water en incubeer 30-45 minuten bij 56 º C met schudden. Verwijder vrije vloeistof.
- Alkylaat cysteïne residuen door de toevoeging van 55 mm chlooraceetamide (in 50 mM ABC) gedurende 20-30 min. (kamertemperatuur, donker). Verwijder vrije vloeistof.
- Was gelstukken 2 x 10 minuten met 50% acetonitril (in 50 mM ABC). Verwijder vrije vloeistof.
- Uitdrogen gel stukken met 100% acetonitril gedurende 5 minuten en verwijder vrije vloeistof.
- Voor de tryptic verteren, voeg 40 ul van trypsine werkoplossing (100 ng van trypsine in de spijsvertering buffer: 50 mM ABC, 5% acetonitril voor een gemiddelde Coomassie gekleurde band). Laat gel stukken te rehydrateren gedurende 10 minuten. Genoeg van de spijsvertering buffer toe te voegen aan gelstukken dekken indien nodig. Incubeer bij 37 º CO / N.
- Om de vertering stoppen en extraheer de peptiden uit de gelstukken, voeg 5% mierenzuur (in 50% acetonitril) (voeg hetzelfde volume als de vertering volume). Ultrasone trillingen gedurende 5-10 minuten. Breng de bovenstaande nieuwe buis. Herhaal de extractie 3x.
- Droog de peptiden door lyofilisatie (voorkeur) of een vacuümconcentrator (zoals Speed-Vac of Savant). Bewaren bij -20 º C.
- Dien uw steekproef voor massaspectrometrie.
Opmerking: Wij legden onze steekproef aan de massaspectrometrie faciliteit in De Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protocollen bij massaspectrometrie faciliteiten variëren aanzienlijk, maar meestal peptides worden opgelost in 0,2% trifluorazijnzuur met 2% acetonitril Voordat aan vloeistofchromatografie systeem gekoppeld aan electro-spuiten tandem massaspectrometrie.
Representative Results
We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van tagged eiwitten uit stabiele transgene A. thaliana lijnen of na transiënte expressie van eiwitten in N. benthamiana. Zoals weergegeven in figuur 1, de zuivering van het beoogde eiwit is gekoppeld aan massaspectrometrie identificatie van interagerende eiwitten en PTMs van het beoogde eiwit toestaan. Het protocol is ontworpen voor het zuiveren van proteïnen betrokken bij planten immuniteit en identificatie van de PTMs maar kan worden toegepast op de zuivering van een gelabeld plantaardige eiwitten.
Als voorbeeld gebruiken we de zuivering van de Prf / Pto complex van N. benthamiana. De transgene N. benthamiana lijn 38-12 54, uiten 35S: Pto, werd kortstondig getransformeerd met 35S: Prf-vlag en het complex werd geïmmunoprecipiteerd met anti-FLAG M2 agarose (Figuur 2A). De immunoblots (IB) in Figuur 2Aillustreren dat de meeste beoogde eiwit (Prf) werd immunologisch neergeslagen. Pto en de interactie effectoreiwit AvrPtoB werden meegezuiverde met Prf en gedetecteerd met antilichamen en massaspectrometrie (Figuren 2A en 2B). We vonden dat de PTO die meegezuiverde met Prf gemigreerd langzamer op SDS-PAGE gel wanneer tezamen tot expressie gebracht met de effector construeert 35S: AvrPto en 35S: AvrPtoB (Figuur 2A). Beide effector-eiwitten geïnduceerde langzamer migratie van de Prf-interactie Pto (Figuur 2A). Deze effector erkenning afhankelijk langzame migratie van Pto werd eerder toegeschreven aan fosforylering als het zou kunnen worden verwijderd door behandeling met fosfatase 44. Om de fosforylatieplaatsen dragen aan de trage migratie van Pto detecteren, onderwierpen wij de Prf copurifying Pto aan massaspectrometrie-analyse. Ondanks de hoge expressie van Pto en haar eenvoudige detectie met immunoblots konden we peptiden halen covering slechts 57% van Pto volgorde en we geen enkel fosforylatieplaatsen (Figuur 2B) te identificeren.
Vervolgens hebben we strategieën om de Pto eiwit richten met anti-FLAG. N. veranderd benthamiana WT planten werden tijdelijk getransformeerd met 35S: Prf-3HA en 35S: Pto-FLAG, met of zonder 35S: AvrPto en 35S:. AvrPtoB Het totale bedrag van Pto eiwit, bestaande uit zowel de Prf-complex en de vrije vormen, was immunogeprecipiteerd met anti-FLAG M2 agarose en onderworpen aan SDS-PAGE fractionering in-gel tryptische digestie en massaspectrometrische analyse (Figuur 2C). Met deze benadering identificeerden we Pto peptiden die ongeveer 80% van zijn sequentie en een onbekend 100 kDa eiwit interactie. We identificeerden een reeks van enkele en dubbele fosforyleringsplaatsen voor Pto peptiden 187-202 en 188-202 (tabel 1). Ser-198 en Thr-199 waren de overheersende fosforylatieplaatsen maar andere phoOok werden sphorylation plaatsen gedetecteerd (Tabel 1). Belangrijker dubbele fosforylering van Ser-198 en Thr-199 werd alleen in de aanwezigheid van een effector eiwit (Tabel 1) geïdentificeerd. We identificeerden recent een gelijkaardige set van Pto fosforylatieplaatsen en illustreerde het belang van de dubbele fosforylering evenement voor signalering 47. Volgens de hier beschreven protocol konden we dynamische veranderingen in de fosforylatie toestand van het doeleiwit te identificeren.
Figuur 1. Algemene experimentele opzet. Het doeleiwit voor immunoprecipitatie (IP) wordt gelabeld en uitgedrukt in planta, tijdelijk in Nicotiana benthamiana of stabiel in Arabidopsis thaliana. Na eiwitextractie dedoeleiwit immuunprecipitatie met een affiniteitsmatrix. De eiwitten worden gescheiden op een acrylamide gel elektroforese. Gel banden worden weggesneden. Eiwitten worden uit de gel banden en onderworpen aan massaspectrometrie. Fosforylatieplaatsen en interacterende eiwitten geïdentificeerd. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Prf en Pto immunoprecipitatie. A). Het construct 35S: Prf-FLAG werd tijdelijk tot expressie gebracht in de 38-12 regel (35S: PTO), samen met de lege vector (EV), 35S: AvrPto of 35S: AvrPtoB. Drie dagen na de infiltratie Prf werd geïmmunoprecipiteerd met behulp van anti-FLAG affiniteit matrix. Immunoblots (IB) voor Prf, AvrPtoB en Pto werden uitgevoerd. Zoals door pijlen op de bodem van Pto immunoblot paneel, AvrPto en AvrPtoB veroorzaken een tragere migratie van Pto. B). Het construct 35S: Prf-FLAG werd tijdelijk tot expressie gebracht in de 38-12 regel (35S: PTO), samen met de lege vector (EV), 35S: AvrPto of 35S: AvrPtoB. Drie dagen na infiltratie Prf werd geïmmunoprecipiteerd met anti-FLAG agarose en gescheiden op SDS-PAGE. De gel werd gekleurd met colloïdaal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) en de zichtbare Prf werden Pto en AvrPtoB eiwitten banden uitgesneden uit de gel en geanalyseerd door massaspectrometrie. Het percentage peptide dekking van Pto en Prf sequenties geïdentificeerd door massaspectrometrie wordt aangegeven. C). De constructen 35S: Prf-3xHA en 35S: Pto-vlag werden tijdelijk tot expressie samen met 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto of lege vector (EV) in N. benthamiana. Drie dagen na de infiltratie het totale bedrag vanPto-FLAG werd immunogeprecipiteerd behulp van anti-FLAG agarose en opgelost op SDS-PAGE. De zichtbare en Pto Pto-interagerende proteïne banden werden uit de gel gesneden en geanalyseerd door massaspectrometrie. Aftakas en de 100 kDa Pto-interagerende proteïne band zijn duidelijk zichtbaar op de colloïdale Coomassie Brilliant Blue (CCBB) glas-in-gel, terwijl Prf is iets minder zichtbaar is (zoals aangegeven door de pijlen). IP: Immunoprecipitatie; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant Blue kleuring; CCBB: colloïdaal Coomassie Brilliant Blue kleuring. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Prf | |||
| EV | AvrPto | AvrPtoB | |
| Pto peptide 188-202 | |||
| GTELDQ [p T 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [p S 198] TVVK | 10 | 7 | 5 |
| GTELDQTHLS [p T 199] VVK | 8 | 3 | 4 |
| G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 8 | 4 |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| Pto peptide 187-202 | |||
| KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [p S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 7 | 5 |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| Peptiden 187-202 en 188-202 | 83 | 88 | 50 |
| Percentage van peptiden met twee fosforylatiegebeurtenissen | 0% | 26,9% | 11.2% |
| Pto Sequence Coverage | 78% | 79% | 82% |
Tabel 1 Dubbele fosforylering van een PTO peptide na activering van signaal 35S:.. Prf-3xHA en 35S: Pto-vlag werden tijdelijk tot expressie samen met empty vector (EV), 35S: AvrPto of 35S: AvrPtoB in N. benthamiana. Drie dagen na de infiltratie het totale bedrag van Pto-FLAG eiwit werd geïmmunoprecipiteerd met behulp van anti-FLAG affiniteit matrix en opgelost op SDS-PAGE. De zichtbare banden van Pto op de colloïdale Coomassie brilliant blauw gekleurde gel werden uitgesneden en geanalyseerd met massaspectrometrie. Het aantal Pto peptiden geïdentificeerd met 0, 1 en 2 fosforylatiegebeurtenissen aangegeven.
| Tabel buffers | ||
| L medium | Tryptone | 10 g / L |
| Gistextract | 5 g / L | |
| NaCl | 5 g / L | |
| D-glucose | 1 g / L | |
| Agro-infiltratie buffer | MgCl2 | 10 mM |
| MES </ Td> | 10 mM | |
| Breng de pH 5.5 | ||
| Acetosyringone (optioneel) | 150 uM | |
| Buffer A | Tris-HCl pH 7,5 | 150 mM |
| NaCl | 150 mM | |
| EDTA | 5 mM | |
| EGTA | 2 mM | |
| Glycerol | 5% (v / v) | |
| Buffer B | Buffer A | |
| PVPP | 2% (w / v) | |
| Buffer C | Buffer B | |
| Dithiothreitol (DTT) | 10 mM | |
| Plant proteaseremmercocktail | 1% (v / v) | |
| Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | 0,5 mM | |
| Calyculin A | 50 nM | |
| Natriumfluoride (NaF) | 50 mM | |
| Natriummolybdaat (Na 2 Moo 4) | 10 mM | |
| Natriumorthovanadaat | 1 mM | |
| Okadazuur | 100 nM | |
| Buffer D | Buffer C zonder PVPP | |
| 5x SDS-PAGE laadbuffer | Tris-HCl pH 6,8 | 60 mM |
| SDS | 2% | |
| Glycerol | 0,15% | |
| Broomfenolblauw | 0,10% | |
| DTT (voeg vlak voor gebruik) | 50 mM |
Tabel 2. Buffer en media recepten.
Discussion
Het ophelderen van het mechanisme van de receptor activering door PAMPs en effectoren kunnen een grote bijdrage leveren aan ons begrip van plantaardige immuniteit. In de afgelopen 20 jaar, hebben de genetische en gist twee-hybride schermen instrumenteel voor de ontdekking van PRRS en NB-LRR eiwitten geweest. Meer recent zijn massa-spectrometrische protocollen vastgesteld voor de identificatie van eiwitten differentieel gereguleerd in immuun signalering 55-58 hun PTMs 11,33,59,60, de samenstelling van immuuncomplexen 61 en effector richt 62. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het identificeren van PTMs reguleren de activering van immuuncomplexen.
In vergelijking met eerder beschreven protocollen, dit protocol kan de gedetailleerde identificatie van dynamische veranderingen van PTMs. Protocollen van grootschalige proteomics benaderingen PTMs van eiwitten te identificeren maar zijn niet in staat de plaats plasticiteit van PTMs door beperken onthullened hoeveelheden eiwit. In het geval van eiwitfosforylatie, grootschalige proteomics aanpak meestal alleen identificeren van de overheersende fosforylatieplaatsen 11,33,59. De gedetailleerde karakterisering van proteïne fosforylatie-status is een substantiële hoeveelheid eiwit die kan worden verkregen door tussenkomst gedeeltelijke zuivering van het doeleiwit 47. Het protocol hier beschreven koppelt een eiwitzuivering benadering dat een aanzienlijk deel van het doelwiteiwit oplevert, met massaspectrometrie analyse van het gezuiverde eiwit. Naar aanleiding van dit protocol, is de enige fosforylering geval van Pto voornamelijk toegeschreven aan Ser-198 zoals eerder beschreven 52 maar sommige massaspectrometrie spectra ook ondersteund een fosforylering evenement op Thr-195 of Thr-199. Wanneer dubbele fosforylering gebeurtenissen van Pto werden waargenomen, de overheersende combinatie van gefosforyleerd aminozuren was Ser-198 en Thr-199, hoewel combinaties op andere sites ook waargenomen (Tabel 1). Deze resultaten tonen duidelijk de fosforylatieplaats plasticiteit van eiwitkinasen en het vermogen van de beschreven protocol te karakteriseren in detail alle mogelijke fosforyleringsplaatsen.
De meest kritische stappen van dit protocol zijn: 1) voldoende extractie van eiwitten, 2) bescherming van PTMs, en 3) een voldoende hoeveelheid van target eiwitten. Allereerst voldoende extractie van eiwitten, is het belangrijk om het weefsel te malen in vloeibare stikstof en vervolgens aan een weefsel homogenisator als beschreven in het protocol. Als een weefselhomogenisator niet beschikbaar is, kan een mortier en stamper worden gebruikt. Het is ook belangrijk om een verhouding van een om drie (of vier) gram weefsel extractiebuffer. Dit weefsel verhouding en hoge sterkte buffer die we stellen buffer zorgen dat de pH tijdens het extractieproces neutraal blijft. We vonden dat dit van bijzonder belang A. thaliana en tomaat extraACTIES 52. Bescherming van PTMs kan worden bereikt door alle buffers passende remmers van enzymen die PTMs kan verwijderen. Het is ook essentieel om alle stappen uitgevoerd bij 4 ° C en buffers en instrumenten prechill. Hogere opbrengsten van doeleiwit kan worden bereikt door planten die het eiwit in voldoende hoeveelheden en met grote hoeveelheden weefsel (ongeveer 20 g). De meest cruciale stap voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden doeleiwit concentreert het doeleiwit door directe immunoprecipitatie. De betekenis van deze stap wordt benadrukt door onze niet PTMs van Pto identificeren na Prf immunoprecipitatie vanwege de beperkte hoeveelheid coimmunoprecipitated Pto (figuur 2B). Daarentegen directe immunoprecipitatie van Pto leverde aanzienlijk meer meetbaar peptiden (figuur 2C) die tot circa 80% dekking van de eiwitsequentie en identificatie van PTMs (tabel 1). We hebben ook strongly raden het gebruik van epitoop-tags voor eiwit immunoprecipitatie. In vergelijking met antilichamen opgewekt tegen natieve eiwitten epitoop-labels affiniteitsmatrix kunnen hogere hoeveelheden gedeeltelijk gezuiverd eiwit verkregen. Door een antilichaam opgewekt tegen natief Pto eiwit 51 (figuur 2A) voor immunoprecipitatie, konden we eenmalig fosforylering van de twee overheersende fosforylatieplaatsen van Pto identificeren.
Dit protocol is primair ontwikkeld voor gedeeltelijke zuivering van N. benthamiana cytoplasmatische eiwitten en daaropvolgende identificatie van de fosforylatieplaatsen. Bij gebruikmaking van de hierin beschreven modificaties, dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor A. thaliana eiwitten en membraangebonden eiwitten. Het hoofddoel van dit protocol is om voldoende hoeveelheden van het doeleiwit opleveren voor de identificatie van PTMs en de hoogste zuiverheid van het complex niet bereiken. Als hogere zuiverheidvan het complex vereist een tweede zuiveringsstap worden toegevoegd bij protocol 52. In dat geval wordt een eerste stap elutie van het doeleiwit uit de affiniteitsmatrix zonder gebruik van hoge zouten of zuren en de volgende stap kan een matrix inhouden, die zware elutieomstandigheden vereist. Het is belangrijk om te benadrukken dat we alleen dit protocol hebben getest voor de identificatie van fosforylatieplaatsen en dat we momenteel de mogelijkheid voor gedetailleerde identificatie van bijkomende PTMs testen.
De representatieve resultaten tonen duidelijk de fosforylatieplaats plasticiteit van eiwitkinasen en het vermogen van de beschreven protocol fosforylatieplaatsen karakteriseren. Belangrijker nog, ze benadrukken dat de identificatie van fosforylatieplaatsen vertrouwen in lage hoeveelheid eiwitten door massaspectrometrie en door enkele puntmutaties van auto-fosforylatieplaatsen verwarrende resultaten kan geven. We zien hier en voorheen 47 47,63 hebben aangetoond dat enkel punt mutaties van Ser-198 en Thr-199 in alanine, die fosforylering voorkomen op deze sites, zijn kan signaleren suggereert dat fosforylering van deze sites is niet een voorwaarde voor complexe activering . Deze resultaten kunnen nu worden verklaard door fosforylering van de secundaire plaats Thr-195. Vergelijkbaar inzicht in de fosforylatieplaats plasticiteit van andere proteïne kinase kan worden verkregen na dit protocol. Verder is een gecombineerde benadering, waarbij fosforylatieplaatsen puntmutaties, eiwitten die specifieke kinasen (effectoren) gekoppeld aan eiwitten immunoprecipitatie en massaspectrometrie analyse remmen leiden tot een beter begrip van de evolutionaire betekenis van de fosforylatieplaats plasticiteit van proteïnekinasen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen (financiële of andere).
Acknowledgments
VN wordt gesteund door de Royal Society. JPR is een Australische Research Council Future Fellow (FT0992129). Wij danken dr. Miriam Gifford voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
References
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
