Summary
Vi beskriver her en protokoll for rensing og karakterisering av planteproteinkomplekser. Vi viser at ved å immunoutfeller et enkelt protein i et kompleks, slik at vi kan identifisere de post-translasjonelle modifikasjoner og dens samvirkende partnere.
Abstract
Planter rask tilpasning til skiftende miljøer på grunn utdype oppfatning og signalanlegg. Under patogen angrep, planter raskt svare på smitte via rekruttering og aktivering av immunkomplekser. Aktiveringen av immunkomplekser er forbundet med post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) med proteiner, slik som fosforylering, glykosylering eller ubiquitinering. Forstå hvordan disse PTMs er koreografert vil føre til en bedre forståelse av hvordan motstanden er oppnådd.
Her beskriver vi en proteinrensemetode for nukleotid-bindende leucin-rik repeat (NB-LRR)-interagerende proteiner, og den påfølgende identifikasjon av de post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs). Med små modifikasjoner, kan protokollen brukes for rensing av andre plante protein komplekser. Fremgangsmåten er basert på ekspresjonen av et epitop-merket versjon av proteinet av interesse, som deretter delvis renset by immunoutfelling og underkastet massespektrometri for identifisering av interagerende proteiner og PTMs.
Denne protokollen viser at: i). Dynamiske endringer i PTMs eksempel fosforylering kan påvises ved massespektrometri, ii). Det er viktig å ha tilstrekkelige mengder av proteinet av interesse, og dette kan kompensere for manglende renhet av immunoprecipitatet, iii). For å oppdage PTMs av et protein av interesse, har dette proteinet som skal immunoutfelt for å få en tilstrekkelig mengde av protein.
Introduction
Immun trasé avhengige av forskjellige post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) av proteiner til hurtig transduce-signaler og aktivere immunresponser en. PTMs er raske, reversible, og svært spesifikke kjemiske forandringer av proteinstruktur som kan påvirke protein konformasjon, aktivitet, stabilitet, lokalisering, og protein-protein interaksjoner 2-4. I planter, har mer enn 300 typer av PTMs blitt identifisert inkludert ubiquitinering, sumoylation, sulfatering, glykosylering, og fosforylering 2,5. En økende mengde bevis fremhever viktigheten av PTMs i ulike aspekter av plante immunitet 1,5,6. Protein fosforylering, er reversibel festing av en fosfatgruppe til et serin, threonin eller tyrosin er rester en regulator for mange cellulære funksjoner og ikke overraskende den mest studerte PTM i planteforsvar signaleringskaskader 5-11. Fosforylering-avhengig signalisering er en integrert del av anlegget defeNSE aktivering initiert etter ekstracellulære oppfatning av mikrober ved transmembrane reseptorer, eller intracellulær anerkjennelse av multidomain motstand proteiner 5,8.
Ved invaderende planter, er mikrober oppdaget av plasmamembranreseptorer kalt mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) 12. Kjente PRRs er enten reseptor-lignende proteiner (RLPs) eller reseptor-lignende kinase (RLKs), som begge bærer en ligand-bindende ektodomenet og en enkelt-pass-transmembran-domenet. I motsetning til RLPs, RLKs har en intracellulær kinase domene 13-15. Den ektodomenet av PRRs binder seg til konserverte mikrobe elicitor molekyler kalt patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs) ledende, i tilfelle av RLKs, til autophosphorylation og transphosphorylation innenfor den intracellulære domenet 6, 16. Nedstrøms av persepsjon-indusert fosforylering av PRRs, påfølgende fosforylering av cytoplasmatiske proteiner inkludert kinaser 17, 18, ligaser E3 19, mitogenaktiverte protein kinaser (MAPKs) 20, 21, kalsium-avhengige protein kinaser (CDPK) 22, 23, og transkripsjonsfaktorer 24, 25 fører til PAMP-utløst immunitet (PTI).
I tillegg til det ekstracellulære persepsjon ved PRRs, er intracellulær gjenkjennelse av patogene bakterier oppnådd gjennom cytoplasmiske reseptorer. Disse multidomain motstand (R) proteiner inneholder et variabelt N-terminale domene, et sentralt nukleotid-bindende (NB) motiv, og C-terminale leucin-rik gjentar (LRR), og derfor kalles NB-LRR proteiner 26, 27. R-proteiner direkte eller indirekte gjenkjenne patogen-avledet virulens molekyler kalt effektorer, også kjent å målrette PRRs og andre noder i immunsystemet. Anerkjennelse fremkaller sterke forsvar fører til effektor-utløst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindende motiv innen NB domene 30, 32, men de mangler en kinase domene. Fosforylering av konserverte domener av NB-LRRs har blitt rapportert i en storstilt proteomikk undersøkelsen 33, men dens relevans for ETI er uklart. Tilsvar til PTI, aktivering av NB-LRR proteiner fører til fosforylering av cytoplasmatiske proteiner inkludert MAPKs 34-37 og CDPKs 38-40. Viktigst, kan effektor anerkjennelse føre til fosforylering av tilbehørs proteiner som samhandler direkte med NB-LRR proteiner 41. Noen eksempler er RIN4 (Arabidopsis thaliana) og Pto (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner som samhandler med NB-LRR proteiner, RPM1 42, 43 og Prf 44, hhv. Under infeksjon med Pseudo syringae bakterier, effektor protein AvrB induserer RIN4 fosforylering, mest sannsynlig av reseptor-lignende kinase RIPK 45,
Disse eksemplene viser at identifiseringen av immunkomplekskomponenter og deres potensielle PTMs ved effektor gjenkjenning kan føre til en bedre forståelse av hvordan signalene omformet fra effektor oppfatningen til nedstrøms mål. Her beskriver vi et protein rensing metode for NB-LRR-samspill proteiner og den påfølgende identifisering av sine PTMs. Vi bruker Nicotiana benthamiana og tomat Prf / Pto komplisert som en modell, men den samme protokollen kan lett brukes på RLKs fra N. benthamiana og A. thaliana 53 med små modifikasjoner som vi beskriver i protokollen.
Protocol
Merk: alle trinnene er gjort ved romtemperatur, med mindre annet er opplyst.
En. Utarbeidelse av plantemateriale og buffere
- For N. benthamiana
- Grow Agrobacterium tumefaciens stammer av interesse for gående uttrykk (i dette eksempelet Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG og tom vektor som en kontroll) ved å riste (200 rpm) i flytende kultur (L medium med passende antibiotika) på 28 ° C til stasjonær fase.
- Samle-og pellet agrobacteria ved sentrifugering (3000 x g i 5 min). Kast supernatant og resuspender pelleted agrobacteria i infiltrasjon buffer.
- Mål mengden agrobacteria ved å skaffe den optiske tetthet (OD) verdi ved en absorbans på 600 nm (Abs 600 nm). Juster OD av bakterier til 0,1 til 0,8.
- Infiltrere 4 uke gamle N. benthamiana planter (22 ° C, 16 timers lys) med agrobacteria av Hand (med en 1 ml nålløs sprøyte), eller ved hjelp av vakuum (tilsett 0,02% volum / volum overflateaktivt middel).
Merk: Bruk den første nesten-fullt utvidet blad, og de to umiddelbart eldre blader for mest effektive protein uttrykk. For påvisning av ubiquitinmolekyler eller acetylerte proteiner infiltrere blader med 100 nM MG-132 eller 100 ng / ml Trichostatin A, henholdsvis på en og to dager etter infiltrasjon. - Høste infiltrert blader 2-5 dager etter infiltrasjon og fryse i flytende nitrogen. Lagres prøvene i en -80 ° C fryser.
Merk: Bestemme den beste nivå av ekspresjon av proteinet av interesse på forhånd ved å ta prøver i løpet av en tid løpet av 5 dager, og påvise proteinnivåer ved immunoblotting.
- For A. thaliana stabile transgene linjer
- Grow A. thaliana frø i 6-brønns plater supplert med 5 ml væske MS-medium (1% w / v sukrose) per brønn. Sett 04:57 frø (steriliserte og stratifisert) av den transgene linjenav interesse, eller den ikke-transformerte kontroll-ledningen per brønn. Rist på 200 rpm i to dager før overføre platen til en vekst rommet og la for to uker (22 ° C, 10 timers lys).
- Slakte prøver og fryse i flytende nitrogen.
Merk: Du kan bruke den som en kontroll en transgen linje som uttrykker en urelatert protein med den samme koden som protein av interesse.
- Buffere
- Forbered Buffer A. De-gass bufferen i 1-2 timer (for RLKs, andre membranbundet protein og kjerneproteiner, tilsett 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
Merk: Du kan holde Buffer A ved 4 ° C på ubestemt tid. Kan bruke 1% v / v Triton istedenfor IGEPAL CA-360. - Forbered 80 ml kald buffer B i minst 1-2 timer før ekstraksjon.
Merk: Det ideelle forhold mellom vev g. utvinning buffer er 1:04 (w / v).
- Forbered Buffer A. De-gass bufferen i 1-2 timer (for RLKs, andre membranbundet protein og kjerneproteiner, tilsett 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
2. Protein Extraction
- Like før utvinning forberede 80 ml kald buffer C.
- Grind 20 g N. benthamiana vev (ca 15 blader) eller A. thaliana planter (2-4 g per 6-brønn plate) i flytende nitrogen ved hjelp av en morter og støter.
- Tilsett 80 ml kald buffer C til 20 g av grunnvevet, bland godt, og tines på is.
Merk: Grind alle prøvene samtidig (protein av interesse og kontroll). - Homogen med tre pakker med 10 sek hver på full fart med en vevshomogenisator (prechilled ved 4 ° C). Filtrer gjennom en 22 til 25 mikrometer vev og sentrifuger ved 30 000 xg i 30 min ved 4 ° C.
Merk: Alternativt, homogenisere med en frisk prechilled morter. - For blokkeringen og vaske-trinnene i affinitet matrisen, klar 20 ml av buffer D.
- Blokk 100 ml egnet affinitet matrise ved hjelp av 500 ml kald buffer D inneholdende 1% BSA i 5 min ved 4 ° C.
Merk: Ønsket afFinity matriser inkluderer anti-FLAG M2 agarose, Streptavidin agarose, GFP-Trap_A og anti-HA agarose. - Vask 3 ganger med 1 ml kald buffer D.
- Fjern supernatant av bladekstrakt og filteret gjennom et 0,45 um sprøytefilter inn i et nytt rør på is.
Merk: Ekstraktet fargen skal være grønn eller gul, hvis prøven har slått brun, kast og starte på nytt. - Ta en prøve av den rå ekstrakt for immunoblot, tilsett 5 x SDS-PAGE lastebuffer, Vortex og denatureres ved koking prøver for 10 min ved 80-100 ° C i en varmeblokk.
Tre. Protein Immunoutfelling
- Splitt proteinekstrakt i to 50 ml-rør og tilsett 50 pl av affinitet matrisen suspendert i buffer D til hvert rør. Inkuber med forsiktig rotasjon i 2 timer ved 4 ° C.
Merk: Lengre inkubasjoner ikke har blitt funnet å øke utbyttet. - Forbered 600 pl (6x perlevolum affinitet matrise) av elueringsbuffer ved tilsetning tilBuffer D (sluttkonsentrasjoner): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG peptid (for anti-FLAG M2 agarose) eller 10 mM D-biotin (for Streptavidin-agarose).
Merk: Elueringen anbefales ikke i tilfelle av GFP-Trap_A og anti-HA matriser, så gå direkte til koking i 1x SDS-PAGE lasting buffer, steg 3,11. - Utfelle affinitet matrisen ved sentrifugering ved 4 ° C (5 min ved 1000 xg).
- Ta en prøve av den ubundne ekstrakt for immunoblot, kast resten av supernatanten, og etterlater ca 500 mL i bunnen av røret.
- Resuspender slurry-løsning med en bred-boring spissen.
- Overfør den blandede slurry løsning fra begge rør til en enkelt 1,5 ml rør.
Merk: Fra nå av bruker 1,5 ml lav proteinbinding mikrofugerør. - Puls 3x i 5 sek ved å bruke en bordsentrifuge for å utfelle affinitet matrise og fjern supernatanten.
- Vask 3-5x med en ml kald buffer D. Mellom vasker fremskynde den affinitet Matrix som tidligere beskrevet og kast supernatant. I siste vask fjerne overskudd av buffer D med nålen på en injeksjonssprøyte.
Merk: En siste vask ved hjelp av buffer D med 0,1% IGEPAL kan brukes til ytterligere å redusere ikke-spesifikk binding. - Eluer med 200 pl av den hensiktsmessige elueringsbuffer (for anti-FLAG M2-eller streptavidin-agarose se trinn 3.2) 3 ganger, 5 min hver gang med konstant risting.
- Pool 3 eluater i et enkelt rør. Konsentrer proteiner ved å bruke 30 ul av absorpsjon harpiks. Vortex, la det stå i 5 min og utfelle harpiksen (2 min ved 10 000 xg). Kast supernatanten.
Merk: For GFP-Trap_A og anti-HA agarose, hoppe over trinn 3,9 og 3,10. - Tilsett 50 ul av 1 x SDS-PAGE loading buffer til den utfelte affinitets-matrise eller absorpsjon harpiks. Vortex og koke i 10 min ved 80-100 ° C i en varmeblokk.
- Sentrifuger kokt affinitets-matrise eller harpiksen i 2 minutter ved 10.000 x g. Delmengde 5 mL av overståendet for immunoblot, og drives med andre fraksjoner på et ~ 10 cm lang SDS-PAGE-gel (figur 2).
- For separering og identifisering av proteiner fosforylert ved massespektrometri, legger de gjenværende 45 ul på en ~ 19-cm lange SDS-PAGE gel dersom ekstra separasjon er påkrevd (figur 2).
Merk: En blank veibane kan inkluderes mellom alle prøver for å redusere forurensning av prøvene.
4. Protein Fordøyelse
- Flekker på SDS-PAGE gel med kolloidalt Coomassie Brilliant Blue (CCBB) flekken.
Merk: Reduser håndteringen av gelen for å redusere forurensning med keratiner. Pass på at ingen av utstyr eller verktøy har blitt brukt for immunoblotting eller andre aktiviteter som kan ha etterlatt rester av protein forurensning. - Destain gelen med rikelig vasking i vann, fortrinnsvis O / N. Kutt band av interesse fra gelen med et rent barberblad.
Merk: Juster gel med immunoavtrykket hvis nødvendiry for å finne riktig område. Som fosforylering kan forsinke migrasjon av proteiner på SDS-PAGE snitt området umiddelbart over og under båndet av interesse. - Skjær gelen skive i terninger på 2-4 mm (dette sikrer at gelen vil bli dekket av løsninger i røret uten å blokkere pipettespisser). Sett i et rør.
- Anslå volumet som kreves for å holde gel godt under vann. Bruk dette beløpet for derivatisering, inkubasjon med protease og peptid utvinning, og deretter bruke dobbel til trippel volumer for vask.
Merk: I en typisk fordøye med omtrent 100 ul av de avkappede stykker gel, bruker 500 pl oppløsning for vasking, 2 x 180 mL for dehydrering, 150 pl for reduksjon, 120 pl for alkylering, og 120 pl for fordøyelsen. - Vask de gel-bitene 2 x 20 minutter (eller inntil avfarves) ved tilsetning av 50% aceto-nitril (i 50 mM ammoniumbikarbonat, ABC). Pipetter av løsningen tar seg ikke å fjerne gel stykker.
- Dehydrerer med 100% acetonitril i 5 minutter og fjerne fri væske.
Merk: Gelen skal vises krympet og hvitt. Hvis den blå farge vedvarer, inkuber lenger i acetonitril / ABC og / eller ved forhøyet temperatur (45-55 ° C). - Reduser protein disulfidbindinger ved å tilsette 10 mM DTT i vann og inkuberes i 30-45 minutter ved 56 ° C med risting. Fjern fri væske.
- Alkylat cysteinrester ved tilsetning av 55 mM kloracetamid (i 50 mM ABC) for 20 til 30 minutter (romtemperatur, mørkt). Fjern fri væske.
- Vask gel stykker 2 x 10 min med 50% acetonitril (i 50 mM ABC). Fjern fri væske.
- Dehydrate gel stykker med 100% acetonitril i 5 minutter og fjerne fri væske.
- For den tryptiske fordøye, tilsett 40 pl av trypsin arbeidsløsning (100 ng trypsin i fordøyelsen buffer: 50 mM ABC, 5% acetonitril i en gjennomsnittlig Coomassie-farget bånd). Tillat gel stykker å rehydrere etter 10 min. Legg nok med fordøyelsen buffer for å dekke gel stykker om nødvendig. Inkuber ved 37 º CO / N.
- For å stoppe fordøyelse og ekstraher peptidene fra gelen stykker, tilsett 5% maursyre (i 50% acetonitril) (legg samme volum som fordøyelsen volum). Sonicate for 5-10 min. Overfør supernatanten til nye rør. Gjenta utvinning 3x.
- Tørk peptider ved frysetørking (foretrekkes) eller et vakuum konsentrator (for eksempel Speed-Vac eller Savant). Oppbevares ved -20 º C.
- Send inn din prøven for massespektrometri.
Merk: Vi leverte vår prøven til massespektrometri anlegget på The Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protokoller ved massespektrometri anlegg variere betraktelig, men vanligvis peptider vil bli oppløst i 0,2% trifluoreddiksyre med 2% acetonitril før lasting på en væske-kromatografi-system koplet til elektro-spray tandem massespektrometri.
Representative Results
Vi beskriver her en protokoll for rensing av merket proteiner fra stabil transgen A. thaliana linjer eller etter gående uttrykk av proteiner i N. benthamiana. Som illustrert i figur 1 rensingen av den målrettede proteiner er kombinert med massespektrometri for å tillate identifisering av interagerende proteiner og de PTMs av den målrettede proteiner. Protokollen er blitt utviklet for rensing av proteiner involvert i anlegg immunitet og identifisering av deres PTMs, men kan brukes til rensing av en hvilken som helst kodet planteprotein.
Som eksempel kan vi bruke rensing av Prf / Pto kompleks fra N. benthamiana. Den transgene N. benthamiana linjen 38-12 54, uttrykker 35S: Pto, ble forbigående transformert med 35S: Prf-FLAG og komplekset immunoutfelt med anti-FLAG M2 agarose (Figur 2A). De immunoblots (IB) i figur 2Aillustrere at det meste av den målrettede protein (Prf) immunoutfelt. Pto og samspill effektor protein AvrPtoB ble copurified med Prf og oppdaget ved hjelp av antistoffer og massespektrometri analyse (Tall 2A og 2B). Vi fant ut at Pto som copurified med Prf migrert tregere på SDS-PAGE gel når coexpressed med effector konstruerer 35S: AvrPto og 35S: AvrPtoB (Figur 2A). Begge effektor proteiner indusert tregere migrering av Prf-samspill Pto (Figur 2A). Denne effektor gjenkjennelse avhengig langsom migrering av Pto tidligere ble tilskrevet fosforylering som det kan bli fjernet ved behandling med 44 fosfatase. For å oppdage fosforyleringen områder bidrar til langsom migrasjon av Pto, vi utsatt Prf copurifying Pto til massespektrometri analyse. Til tross for den høye uttrykk for Pto og dens lett deteksjon med immunoblots kunne vi hente peptider covering bare 57% av Pto sekvensen, og vi klarte å identifisere eventuelle fosforylering områder (figur 2B).
Deretter endret vi strategier for å målrette den Pto protein med anti-FLAG. N. benthamiana WT planter ble forbigående transformert med 35S: Prf-3HA og 35S: PTO-FLAG, med eller uten 35S: AvrPto og 35S:. AvrPtoB Den totale mengden av Pto protein, som består av både Prf-kompleks og de frie former, immunoutfelt med anti-FLAG M2 agarose og utsatt for SDS-PAGE-fraksjonering, i-gel tryptisk fordøyelse og massespektrometrisk analyse (figur 2C). Med denne tilnærmingen har vi identifisert Pto peptider som spenner over ca 80% av sin sekvens og en ukjent 100 kDa samspill protein. Vi identifiserte et sett med enkle og doble fosforylering nettsteder for Pto peptider 187-202 og 188-202 (Tabell 1). Ser-198 og Thr-199 var de dominerende fosforylering områder, men andre phosphorylation steder ble også påvist (Tabell 1). Viktigst dobbelt fosforylering på Ser-198 og Thr-199 ble påvist bare i nærvær av enten effektor protein (tabell 1). Vi har nylig identifisert et lignende sett med Pto fosforylering sider og illustrerte betydningen av dobbelt fosforylering hendelsen for signale 47. Etter den protokoll som er beskrevet her var vi i stand til å identifisere dynamiske endringer i fosforylering tilstand av målproteinet.
Figur 1. Generelt eksperimentell design. Målet protein for immunoprecipitation (IP) er merket, og uttrykkes i planta, forbigående i Nicotiana benthamiana eller stabilt i Arabidopsis thaliana. Etter protein utvinning påmålprotein er immunoutfelt med en affinitets-matrise. Proteinene blir separert på en akrylamid-gel ved elektroforese. Gel band er fjernet. Proteiner er hentet fra gel band og utsatt for massespektrometri. Fosforylering nettsteder og samspill proteiner er identifisert. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Prf og Pto immunoprecipitation. A). Konstruere 35S: Prf-FLAG ble forbigående uttrykt i 38-12 linje (35S: PTO) sammen med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dager etter infiltrasjon Prf immunoutfelt ved hjelp av anti-FLAG affinitet matrise. Immungnoblots (IB) for Prf, AvrPtoB og Pto ble utført. Som påpekt av pilene nederst i Pto immunoblot panel, AvrPto og AvrPtoB indusere en tregere migrering av Pto. B). Konstruere 35S: Prf-FLAG ble forbigående uttrykt i 38-12 linje (35S: PTO) sammen med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dager etter infiltrasjon Prf immunoutfelt ved hjelp av anti-FLAG agarose og separert på SDS-PAGE. Gelen ble farget med kolloidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) og den synlige Prf ble Pto og AvrPtoB proteiner båndene skåret ut fra gelen og analysert ved massespektrometri. Andelen peptid dekning av kraftuttak og PRF sekvenser identifisert ved massespektrometri indikeres. C). De konstruerer 35S: Prf-3xHA og 35S: Pto-FLAGG ble forbigående uttrykt sammen med 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto eller tom vektor (EV) i N. benthamiana. Tre dager etter infiltrasjon den totale mengden avPto-FLAG immunoutfelt ved hjelp av anti-FLAG agarose og løses på SDS-PAGE. Den synlige Pto og Pto-interagerende proteinbånd ble skåret ut fra gelen og analysert ved massespektrometri. Pto og 100 kDa Pto-samspill protein bandet er tydelig på kolloidalt Coomassie Brilliant Blue (CCBB) farget gel, mens Prf er litt mindre synlig (som angitt med piler). IP: Immunoutfelling; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant Blue flekker; CCBB: kolloidalt Coomassie Brilliant Blue farging. Klikk her for å se større bilde.
| Prf | |||
| EV | AvrPto | AvrPtoB | |
| Pto peptid 188-202 | |||
| GTELDQ [p T 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [p S 198] TVVK | 10 | 7 | 5 |
| GTELDQTHLS [p T 199] VVK | 8 | 3 | 4 |
| G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 8 | 4 |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| Pto peptid 187-202 | |||
| KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [p S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 7 | 5 |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| Peptider 187-202 og 188-202 | 83 | 88 | 50 |
| Andel av peptider med to fosforylering hendelser | 0% | 26,9% | 11,2% |
| Pto Sequence Dekning | 78% | 79% | 82% |
Tabell 1 Double fosforylering av en Pto peptid ved aktivering av signal 35S:.. Prf-3xHA og 35S: Pto-FLAGG ble forbigående uttrykt sammen med empty vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB i N. benthamiana. Tre dager etter infiltrasjon den totale mengden av Pto-FLAGG protein immunoutfelt ved hjelp av anti-FLAG affinitet matrise og løses på SDS-PAGE. De synlige band av Pto på kolloidalt Coomassie strålende blå farget gel ble skåret ut og analysert med massespektrometri. Antallet Pto peptider identifisert med 0, 1 og 2 fosforylering hendelser indikeres.
| Tabell av buffere | ||
| L medium | Tryptone | 10 g / L |
| Gjærekstrakt | 5 g / L | |
| NaCl | 5 g / L | |
| D-glucose | 1 g / L | |
| Agro-infiltrasjon buffer | MgCl 2 | 10 mM |
| MES </ Td> | 10 mM | |
| Juster til pH 5,5 | ||
| Acetosyringone (valgfritt) | 150 uM | |
| Buffer A | Tris-HCl pH 7.5 | 150 mM |
| NaCl | 150 mM | |
| EDTA | 5 mM | |
| EGTA | 2 mM | |
| Glyserol | 5% (v / v) | |
| Buffer B | Buffer A | |
| PVPP | 2% (vekt / volum) | |
| Buffer C | Buffer B | |
| Dithiothreitol (DTT) | 10 mM | |
| Plant proteasehemmer Cocktail | 1% (v / v) | |
| Fenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF) | 0,5 mM | |
| Calyculin A | 50 nM | |
| Natriumfluorid (NaF) | 50 mM | |
| Natriummolybdat (Na 2 MoO 4) | 10 mM | |
| Sodium orthovanadate | 1 mM | |
| Okadasyre | 100 nM | |
| Buffer D | Buffer C uten PVPP | |
| 5x SDS-PAGE lasting buffer | Tris-HCl pH 6.8 | 60 mM |
| SDS | 2% | |
| Glyserol | 0,15% | |
| Bromfenolblå | 0,10% | |
| DTT (legg like før bruk) | 50 mM |
Tabell 2. Buffer og medie oppskrifter.
Discussion
Belyse den mekanismen av reseptor aktivering av PAMPs og effektbokser kan i stor grad bidra til vår forståelse av plante immunitet. I de siste 20 årene, har genetiske og gjær to-hybrid-skjermer vært medvirkende for oppdagelsen av PRRs og NB-LRR proteiner. Mer nylig har massespektrometri-baserte protokoller er etablert for identifisering av proteiner regulert forskjellig i løpet av immunsignale 55-58, deres PTMs 11,33,59,60, mål sammensetningen av immunkomplekser 61 og effektor 62. Her beskriver vi en enkel protokoll for identifisering av PTMs regulerer aktiveringen av immunkomplekser.
Sammenlignet med tidligere beskrevet protokoller, gjør denne protokollen detaljert identifisering av dynamiske endringer av PTMs. Protokoller av store proteomikk tilnærminger kan identifisere PTMs av proteiner, men er ikke i stand til å avsløre nettstedet plastisitet PTMs grunn til å begrenseed mengder protein. I tilfellet med protein-fosforylering, storskala proteomikk metoder vanligvis bare identifisere de dominerende fosforylering områder 11,33,59. Den detaljert karakterisering av et protein phosphorylation status krever en betydelig mengde protein som kan oppnås bare ved delvis rensing av målproteinet 47.. Protokollen er beskrevet her par en proteinrensing tilnærming som gir en vesentlig mengde av målproteinet, med massespektrometri-analyse av det rensede protein. Etter denne protokollen, ble singelen fosforylering ved Pto tilskrives hovedsakelig til Ser-198 som tidligere beskrevet 52, men noen massespektrometri spektra også støttet en enkelt fosforylering hendelse på Thr-195 eller Thr-199. Når doble fosforylering hendelsene i Pto ble observert, den dominerende kombinasjon av fosforylerte aminosyrer var Ser-198 og Thr-199 selv om kombinasjoner på andre nettsteder ble også observert (Tabell 1). Disse resultatene viser klart den fosforyleringssetet plastisitet av proteinkinaser, og evnen av den beskrevne protokoll for å karakterisere i detaljer alle mulige fosforylering områder.
De mest kritiske trinn av denne protokoll er: 1) tilstrekkelig til utvinning av proteiner, 2) beskyttelse av PTMs, og 3) tilstrekkelig mengde av målproteinet. Først, for tilstrekkelig utvinning av proteiner, er det viktig å slipe vevet i flytende nitrogen, og deretter å benytte en vev-homogenisator som beskrevet i protokollen. Hvis en vevshomogenisator ikke er tilgjengelig, kan en morter benyttes. Det er også viktig å benytte et forhold på 2:59 (eller fire) av gram vev til volum av ekstraksjonsbuffer. Dette vevet til buffer-forhold og høy styrke buffer som foreslår vi vil sikre at pH-verdien forblir nøytral under utpakkingen. Vi har funnet at dette er av spesiell betydning for A. thaliana og tomat ekstractions 52. Beskyttelse av PTMs kan oppnås ved å inkludere i alle buffere egnede inhibitorer for enzymer som kan fjerne PTMs. Det er også viktig å utføre alle trinnene ved 4 ° C, og for å prechill buffere og instrumenter. Høyere utbytter av målprotein kan oppnås ved hjelp av planter som uttrykker proteinet i tilstrekkelige mengder, og ved å bruke store mengder av vev (ca. 20 g). Den mest avgjørende trinn for oppnåelse av tilstrekkelige mengder av målproteinet konsentrerer målproteinet ved direkte immunoutfelling. Betydningen av dette trinnet er markert med vår manglende evne til å identifisere PTMs til kraftuttaket etter en Prf immunoprecipitation grunn av den begrensede mengden av coimmunoprecipitated Pto (figur 2B). I motsetning til dette direkte immunoutfelling av Pto ga vesentlig mer målbare peptider (figur 2C) som fører til omtrent 80% dekning av proteinsekvensen og identifisering av PTMs (tabell 1). Vi har også strongly anbefaler bruk av epitop-koder for protein immunoprecipitation. Sammenlignet med antistoffer dannet mot naturlig proteiner epitop-merker affinitet matrise kan gi høyere mengder av delvis renset protein. Ved å bruke et antistoff reist mot innfødte Pto protein 51 (Figur 2A) for immunoprecipitation, var vi i stand til å identifisere bare én fosforylering av de to dominerende fosforylering områder av Pto.
Denne protokollen er primært utviklet for delvis rensing av N. benthamiana cytoplasmatisk protein og påfølgende identifisering av sine fosforylering sider. Men ved hjelp av modifikasjoner som er beskrevet her, denne protokollen kan enkelt tilpasses for A. thaliana proteiner og membran bundet proteiner. Hovedmålet med denne protokollen er å gi tilstrekkelige mengder av målproteinet for identifikasjon av PTMs og ikke for å oppnå den høyeste renhet av komplekset. Hvis høyere renhetav komplekset kreves et andre trinn av rensing kan bli lagt til denne protokoll 52. I så fall vil et første trinn tillater eluering av målprotein fra affinitet matrisen uten bruk av høye salter eller syre og den etterfølgende trinnet kan medføre en matrise, som krever sterke eluering forhold. Det er viktig å understreke at vi kun har testet denne protokollen for identifisering av fosforylering områder og at vi tester nå sin evne til detaljert identifisering av ytterligere PTMs.
Våre representative resultater viser klart den fosforyleringssetet plastisitet av proteinkinaser, og evnen av den beskrevne protokoll for å karakter fosforylering sider. Det viktigste er å markere de at identifisering av fosforylering sider er avhengige i lav mengde av proteiner ved massespektrometri og ved enkeltpunktmutasjoner i auto-fosforylering områder kan gi forvirrende resultater. Vi viser her og tidligere 47 47,63 vist at enslige punktmutasjoner av Ser-198 og Thr-199 til alanine, som hindrer fosforylering på disse nettstedene, er i stand til å signalisere noe som tyder på at fosforylering av disse nettstedene er ikke en forutsetning for kompleks aktivering . Disse resultatene kan nå forklares ved fosforylering av sekundærside Thr-195. Lignende innsikt i fosforyleringssetet plastisitet av andre protein-kinase kan bli oppnådd ved å følge denne protokoll. Videre er en kombinert metode ved hjelp av fosforylering sider punktmutasjoner, proteiner som inhiberer spesifikke kinaser (effektorer) kombinert med protein immunoutfelling og massespektrometri-analyse vil føre til en bedre forståelse av den evolusjonære betydning fosforyleringssetet plastisitet hos proteinkinaser.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser (økonomiske eller andre).
Acknowledgments
VN er støttet av Royal Society. JPR er en australsk Forskningsrådet Future Fellow (FT0992129). Vi takker Dr. Miriam Gifford for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
References
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
