Summary
Vi beskriver her en protokol for oprensning og karakterisering af plante protein komplekser. Vi viser, at ved immunopræcipitere et enkelt protein i et kompleks, så vi kan identificere sine post-translationelle modifikationer og dets interagerende partnere.
Abstract
Planter hurtigt at tilpasse sig skiftende miljøer på grund uddybe opfattelsen og signalsystemer. Under patogen angreb, planter reagere hurtigt på infektion via rekruttering og aktivering af immunkomplekser. Aktivering af immunkomplekser er forbundet med post-translationelle modifikationer (PTMS) af proteiner, såsom phosphorylering, glycosylering eller ubiquitinering. Forstå, hvordan disse PTMS er koreograferet vil føre til en bedre forståelse af, hvordan modstand er opnået.
Her beskriver vi en proteinoprensning fremgangsmåde til nukleotid-bindende leucinrig gentagelse (NB-LRR)-interagerende proteiner, og den efterfølgende identifikation af deres post-translationelle modifikationer (PTMS). Med små ændringer kan protokollen anvendes til rensning af andre plante protein komplekser. Metoden er baseret på ekspressionen af en epitop-mærket version af proteinet af interesse, som derefter delvist oprenset by immunpræcipitation og underkastes massespektrometri til identifikation af interagerende proteiner og PTMS.
Denne protokol viser, at: i). Dynamiske ændringer i PTMS såsom phosphorylering kan detekteres ved massespektrometri ii). Det er vigtigt at have tilstrækkelige mængder af proteinet af interesse, og det kan kompensere for manglen af renheden af immunopræcipitatet iii). For at påvise PTMS af et protein af interesse, dette protein skal immunpræcipiteret at få en tilstrækkelig mængde af protein.
Introduction
Immun veje afhængige af forskellige post-translationelle modifikationer (PTMS) af proteiner til hurtigt at transducere signaler og aktivere immunresponser 1. PTMS er hurtige, reversible, og meget specifikke kemiske ændringer af proteinstruktur, der kan påvirke protein-konformation, aktivitet, stabilitet, lokalisering og protein-protein interaktioner 2-4. I planter har mere end 300 typer af PTMS blevet identificeret, herunder ubiquitination sumoylation, sulfatering, glykosylering og phosphorylering 2,5. En voksende mængde af beviser fremhæver betydningen af PTMS i forskellige aspekter af plante immunitet 1,5,6. Proteinphosphorylering, den reversible fastgørelse af en fosfat gruppe til en serin, threonin eller tyrosin rester er en regulator af mange cellulære funktioner og ikke overraskende de mest studerede PTM i plante forsvar signalering kaskader 5-11. Phosphorylering-afhængig signalering er en integreret del af anlægget sikkerhNSE aktivering påbegyndt efter ekstracellulær opfattelse af mikrober ved transmembrane receptorer, eller intracellulær anerkendelse af Multidomain modstand proteiner 5,8.
Efter invaderende planter er mikrober detekteres ved plasmamembran-receptorer kaldet mønstergenkendelsesteknikker receptorer (PRRS) 12. PRRS er enten receptor-lignende proteiner (RLPs) eller receptor-lignende kinaser (RLKs), som begge bærer et ligandbindende ektodomænet og en enkelt-pass transmembrane domæne. I modsætning til RLPs, RLKs har et intracellulært kinase domæne 13-15. Ektodomænet PRRS binder til konserverede mikrobe elicitor molekyler kaldet patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) førende, i tilfælde af RLKs til autophosphorylering og transphosphorylering i det intracellulære domæne 6, 16. Nedstrøms for opfattelsen-induceret phosphorylering af PRRs, efterfølgende phosphorylering af cytoplasmatiske proteiner, herunder kinaser 17, 18 E3 ligase 19 mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK'er) 20, 21, calcium-afhængige proteinkinaser (CDPK) 22, 23 og transkriptionsfaktorer 24, 25 fører til PAMP-udløste immunitet (PTI).
Ud over det ekstracellulære opfattelse af PRRs er intracellulær anerkendelse af patogener gennem cytoplasmatiske receptorer. Disse multidomain modstand (R)-proteiner indeholder en variabel N-terminale domæne, et centralt nukleotid-bindende (NB) motiv, og C-terminale leucin-rige gentagelser (LRR), og derfor kaldes NB-LRR-proteiner 26, 27. R-proteiner direkte eller indirekte anerkende patogen-afledt virulens molekyler kaldet effektorer, også kendt for at målrette PRRs og andre knudepunkter i immunsystemet. Anerkendelse inducerer stærke forsvar fører til effektor-udløst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindende motiv i NB domæne 30, 32, men de mangler en kinase domæne. Phosphorylering af konserverede domæner af NB-LRRs er blevet rapporteret i en storstilet proteom undersøgelse 33, men dets relevans for ETI er uklar. Ligeledes til PTI, aktivering af NB-LRR proteiner fører til phosphorylering af cytoplasmatiske proteiner, herunder MAPKs 34-37 og CDPKs 38-40. Vigtigst er det, kan effektor anerkendelse føre til phosphorylering af accessoriske proteiner, der interagerer direkte med NB-LRR proteiner 41. Nogle eksempler kan nævnes RIN4 (Arabidopsis thaliana) og PTO (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner, der interagerer med NB-LRR proteiner RPM1 42, 43 og Prf 44, hhv. Under infektion med Pseudomonas syringae bakterier effektor-proteinet AvrB inducerer RIN4 phosphorylering, sandsynligvis af receptor-lignende kinase RIPK 45
Disse eksempler viser, at identifikationen af immun komplekse komponenter og deres potentielle PTMS på effektor anerkendelse kan føre til en bedre forståelse af, hvordan signaler transduceres fra effektor opfattelse til downstream mål. Her beskriver vi en proteinoprensning fremgangsmåde til NB-LRR-interagerende proteiner og den efterfølgende identifikation af deres PTMS. Vi bruger Nicotiana benthamiana og tomat Prf / Pto komplekst som en model, men den samme protokol kan nemt anvendes på RLKs fra N. benthamiana og A. thaliana 53 med små ændringer, som vi beskriver i protokollen.
Protocol
Bemærk: alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1.. Fremstilling af plantematerialer og Buffere
- For N. benthamiana
- Grow Agrobacterium tumefaciens stammer af interesse for transient ekspression (i dette eksempel Prf-FLAG, Prf-3xHA, PTO-FLAG og tom vektor som en kontrol) ved at ryste (200 rpm) i flydende kultur (L medium med passende antibiotika) ved 28 ° C, indtil stationær fase.
- Indsamle og pillefyr agrobakterier ved centrifugering (3.000 x g i 5 min). Kasser supernatanten og resuspender pelleterede agrobakterier i infiltration buffer.
- Måle mængden af agrobakterier ved at opnå den optiske densitet (OD) værdi ved en absorbans på 600 nm (Abs 600 nm). Juster OD af bakterier til 0,1-0,8.
- Infiltrere 4 uger gammel N. benthamiana anlæg (22 ° C, 16 timer lys) med agrobakterier af Hand (med en 1 ml injektionssprøjte uden nål) eller ved vakuum (tilføje 0,02% v / v overfladeaktivt middel).
Bemærk: Brug den første næsten fuldt udbygget blad, og de to umiddelbart ældre blade for mest effektive protein udtryk. Til påvisning af ubiquitinerede eller acetylerede proteiner infiltrere blade med 100 nM MG-132 eller 100 ng / ml Trichostatin A henholdsvis ved 1 og 2 dage efter infiltrering. - Høste infiltrerede blade 2-5 dage post-infiltration og fryse i flydende nitrogen. Opbevar prøverne i en -80 ° C fryser.
Bemærk: Bestem det bedste niveau for ekspression af proteinet af interesse på forhånd ved at tage prøver i løbet af en tid løbet af 5 dage og opdage protein niveauer ved immunoblotting.
- For A. thaliana stabile transgene linier
- Grow A. thaliana frø i 6-brønds plader suppleret med 5 ml flydende MS-medium (1% w / v sucrose) per brønd. Sæt 04:57 frø (steriliseret og lagdelte) af transgene linjeaf interesse, eller den ikke-transformerede kontrol linje pr godt. Ryst ved 200 rpm i to dage før overførsel pladen til en vækst rum og orlov til 2 uger (22 ° C, 10 timers lys).
- Harvest prøver og fryse i flydende nitrogen.
Bemærk: Du kan bruge som en kontrol en transgen linje udtrykke en uafhængig protein med samme tag som proteinet af interesse.
- Buffere
- Forbered puffer A. De-gas bufferen i 1-2 timer (for RLKs andre membranbundne proteiner og nukleare proteiner, tilsættes 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
Bemærk: Du kan holde Buffer A ved 4 ° C på ubestemt tid. Du kan bruge 1% v / v Triton stedet for IGEPAL CA-360. - Forbered 80 ml kold puffer B mindst 1-2 hr før ekstraktion.
Bemærk: Den ideelle forhold mellem væv versus ekstraktionspuffer er 01:04 (w / v).
- Forbered puffer A. De-gas bufferen i 1-2 timer (for RLKs andre membranbundne proteiner og nukleare proteiner, tilsættes 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
2. Protein Extraction
- Lige før ekstraktion forberede 80 ml kold buffer C.
- Grind 20 g N. benthamiana væv (ca. 15 blade) eller A. thaliana planter (2-4 g pr 6-brønds plade) i flydende nitrogen ved hjælp af en morter og støder.
- Tilsættes 80 ml kold puffer C til 20 g jord væv, bland godt, og tø på is.
Bemærk: Grind alle prøver på samme tid (protein af interesse og kontrol). - Homogeniseres med 3 byger af 10 sekunder hver med fuld fart og en vævshomogenisator (forud afkølet ved 4 ° C). Der filtreres gennem et 22-25 um væv og centrifugeres ved 30.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Alternativt kan homogeniseres med en frisk forafkølet morter og støder. - For de blokerende og vasketrin af affinitetsmatrix forberede 20 ml buffer D.
- Blok 100 ml egnet affinitetsmatrix anvendelse af 500 ml kold puffer D indeholdende 1% BSA i 5 min ved 4 ° C.
Bemærk: Preferred AFFinity matricer omfatter anti-FLAG-M2-agarose, streptavidin-agarose, GFP-Trap_A og anti-HA-agarose. - Vask 3x med 1 ml kold buffer D.
- Fjern supernatanten af blade ekstrakt og filtreres gennem et 0,45 um sprøjtefilter ind i et nyt rør på is.
Bemærk: Den ekstrakt farve skal være grøn eller gul, hvis prøven er blevet brune, kassere og starte forfra. - Tag en portion af den rå ekstrakt for immunoblot, tilføje 5x SDS-PAGE påføringsbuffer vortex og denaturere ved kogning prøver til 10 min ved 80-100 ° C i en varmeblok.
3. Protein Immunpræcipitation
- Split proteinekstrakten i to 50 ml rør, og der tilsættes 50 ul af affinitetsmatrix suspenderes i buffer D til hvert rør. Inkuberes med forsigtig rotation i 2 timer ved 4 ° C.
Bemærk: Længere inkubationer er ikke blevet fundet at øge udbyttet. - Forbered 600 pi (6x perlevolumen affinitetsmatrix) elueringsbuffer ved tilsætning tilBuffer D (slutkoncentrationer): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG peptid (for anti-FLAG M2 agarose) eller 10 mM D-biotin (for streptavidin-agarose).
Bemærk: Eluering ikke anbefales i tilfælde af GFP-Trap_A og anti-HA-matricer, så gå direkte til kogning i 1x SDS-PAGE loadingpuffer, trin 3.11. - Præcipitere affinitetsmatrix ved centrifugering ved 4 ° C (5 min ved 1000 xg).
- Tag en portion af det ubundne ekstrakt immunblot, kasseres resten af supernatanten, hvilket efterlader omkring 500 gl i bunden af røret.
- Resuspendere slamopløsningen med en bred-boring spids.
- Overfør den blandede opslæmning løsning fra begge rør til en enkelt 1,5 ml rør.
Bemærk: Fra nu af, skal du bruge 1,5 ml med lav proteinbinding mikrocentrifugerør. - Pulse 3x 5 sek under anvendelse af en bordcentrifuge for at udfælde affinitetsmatrix og fjern supernatanten.
- Vask 3-5x med 1 ml kold buffer D. mellem hver vask udfældes affinitet Matrix som tidligere beskrevet, og supernatanten. I den sidste vask fjerne overskydende buffer D med nålen i en sprøjte.
Bemærk: En endelig vask ved hjælp af puffer D med 0,1% IGEPAL kan anvendes til yderligere at reducere ikke-specifik binding. - Elueres med 200 pi den passende elueringsbuffer (for anti-FLAG M2 eller Streptavidin agarose Se trin 3.2) 3 x, 5 min hver gang med konstant rystning.
- Samle 3 eluater i et enkelt rør. Koncentrer proteinerne ved hjælp af 30 pi absorption harpiks. Vortex Lad det stå i 5 minutter, og udfældning af harpiks (2 minutter ved 10.000 xg). Supernatanten.
Bemærk: GFP-Trap_A og anti-HA agarose, springe trin 3.9 og 3.10. - Der tilsættes 50 pi 1x SDS-PAGE loading buffer til den udfældede affinitetsmatrix eller absorption harpiks. Vortex og kog i 10 minutter ved 80-100 ° C i en varmeblok.
- Centrifuger kogt affinitetsmatrix eller harpiks i 2 minutter ved 10.000 x g. Alikvot 5 ul af supernatant immunoblot og køre med andre fraktioner på en ~ 10 cm lang SDS-PAGE-gel (figur 2).
- Til separation og identifikation af fosforylerede proteiner ved massespektrometri, indlæse de resterende 45 pi på en ~ 19 cm lang SDS-PAGE-gel, hvis ekstra adskillelse er nødvendig (figur 2).
Bemærk: En blank bane kan indgå mellem alle prøver at reducere kontaminering af prøverne.
4.. Protein Digestion
- Farv SDS-PAGE gel med kolloid Coomassie Brilliant Blue (CCBB) pletten.
Bemærk: Minimer håndtering af gelen til at reducere forureningen med keratiner. Sørg for, at ingen af udstyr eller værktøjer er blevet anvendt til immunoblotting eller andre aktiviteter, der kunne have efterladt restprotein forurening. - Affarves gelen med rigelige vask i vand, fortrinsvis O / N. Skær båndet af interesse fra gelen med en ren barberblad.
Bemærk: Juster gel med immunblottet hvis necessaRy for at finde det korrekte område. Phosphorylering kan forsinke migrering af proteiner på SDS-PAGE sender området umiddelbart over og under båndet af interesse. - Skær gelskiven i terninger på 2-4 mm (dette sikrer, at gelen vil blive dækket af løsninger i røret uden at blokere pipettespidser). Placer i en tube.
- Vurdere forpligtet til at holde gelen godt neddykket volumen. Brug dette beløb til derivatisering, inkubation med protease og peptid udvinding, og derefter bruge dobbelt til tredobbelt mængder til vask.
Bemærk: I et typisk fordøje med cirka 100 ul af de afskårne gelstykkerne bruge 500 pi løsning til vask, 2 x 180 pi for dehydrering, 150 pi for reduktion, 120 pi for alkylering, og 120 pi for fordøjelsen. - Vask gelstykkerne 2 x 20 minutter (eller indtil affarvet) ved tilsætning af 50% acetonitril (i 50 mM ammoniumbicarbonat, ABC). Pipette off løsningen pas på ikke at fjerne gelstykker.
- Dehydrere med 100% acetonitril i 5 minutter og fjerne væske.
Bemærk: Gelen skal vises indskrumpet og hvid. Hvis den blå farve vedvarer, inkuberes længere i acetonitril / ABC og / eller ved forhøjet temperatur (45-55 ° C). - Reducer protein disulfidbindinger ved tilsætning af 10 mM DTT i vand og inkuberes i 30-45 minutter ved 56 ° C med omrystning. Fjern væske.
- Alkylerede cysteinrester ved tilsætning af 55 mM chloracetamid (i 50 mM ABC) i 20-30 min (stuetemperatur mørke). Fjern væske.
- Vask gelstykker 2 x 10 min med 50% acetonitril (i 50 mM ABC). Fjern væske.
- Dehydrere gelstykker med 100% acetonitril i 5 minutter og fjerne væske.
- For tryptiske fordøje, tilsættes 40 pi trypsin arbejdsopløsning (100 ng trypsin i fordøjelsen buffer: 50 mM ABC, 5% acetonitril for en gennemsnitlig Coomassie-farvede bånd). Tillad gelstykker at rehydrere i 10 min. Tilføj nok af spaltningsbuffer dække gelstykker hvis nødvendigt. Der inkuberes ved 37 º CO / N.
- For at stoppe fordøjelsen og udtrække peptider fra gelstykkerne tilsættes 5% myresyre (i 50% acetonitril) (tilføj samme volumen som fordøjelsen volumen). Sonikeres i 5-10 min. Supernatanten overføres til nye rør. Gentag udvinding 3x.
- Tør peptider ved frysetørring (foretrukket) eller et vakuum koncentrator (såsom Speed-Vac eller Savant). Opbevar ved -20 º C.
- Indsend din prøve for massespektrometri.
Bemærk: Vi forelagde vores prøven til massespektrometri facilitet på Sainsbury Laboratory (Norwich, Storbritannien). Protokoller ved massespektrometri faciliteter varierer betydeligt, men typisk peptider vil blive opløst i 0,2% trifluoreddikesyre med 2% acetonitril før de anbringes på et væskekromatografisystem koblet til elektro-spray tandem massespektrometri.
Representative Results
Vi beskriver her en protokol til oprensning af mærkede proteiner fra stabil transgene A. thaliana linjer eller efter forbigående ekspression af proteiner i N. benthamiana. Som illustreret i figur 1 oprensningen af målrettet protein koblet med massespektrometri for at muliggøre identifikation af interagerende proteiner og PTMS af målrettet protein. Protokollen er designet til oprensning af proteiner involveret i plante immunitet og identifikation af deres PTMS men kan anvendes til rensning af enhver mærkede planteprotein.
Som et eksempel bruger vi rensning af Prf / Pto kompleks fra N. benthamiana. Det transgene N. benthamiana linie 38-12 54, udtrykker 35S: Pto blev forbigående transformeret med 35S: Prf-FLAG og komplekset blev immunpræcipiteret med anti-FLAG M2 agarose (figur 2A). Immunoblots (IB) i figur 2Aviser, at størstedelen af den protein (Prf) blev immunpræcipiteret. Pto og interagerende effektor-proteinet AvrPtoB blev renset sammen med Prf og detekteres under anvendelse af antistoffer og massespektrometri-analyse (figur 2A og 2B). Vi fandt, at Pto der renset sammen med Prf migrerede langsommere på SDS-PAGE gel, når coudtrykt med effektorkonstruktioner 35S: AvrPto og 35S: AvrPtoB (figur 2A). Begge effektor proteiner induceret langsommere migrering af Prf-interagerende Pto (figur 2A). Denne effektor anerkendelse afhængige langsom migration af Pto tidligere blev tilskrevet fosforylering, som det kunne fjernes ved behandling med phosphatase 44.. At påvise phosphoryleringssteder bidrager til den langsomme migration af Pto, vi udsat Prf copurifying Pto til massespektrometri analyse. På trods af den høj ekspression af Pto og dens let detektion med immunoblots kunne vi hente peptider covering kun 57% af Pto sekvens og undlod vi at identificere eventuelle phosphoryleringssteder (figur 2B).
Efterfølgende skiftede vi strategier for at målrette den Pto protein med anti-FLAG. N. benthamiana WT planter blev transient transformeret med 35S: Prf-3HA og 35S: PTO-FLAG, med eller uden 35S: AvrPto og 35S:. AvrPtoB Den samlede mængde Pto protein, der både omfatter den Prf i kompleks og de frie former, immunopræcipiteret med anti-FLAG M2 agarose og underkastet SDS-PAGE fraktionering i gel tryptisk fordøjelse og massespektrometrisk analyse (figur 2C). Med denne fremgangsmåde identificerede vi Pto peptider der spænder over omtrent 80% af dets sekvens og en ukendt 100 kDa interagerende protein. Vi identificerede et sæt af enkelt og dobbelt phosphoryleringssteder til PTO-peptider 187-202 og 188-202 (tabel 1). Ser-198 og Thr-199 var de fremherskende phosphoryleringssteder men andre phosphorylation sites blev også påvist (tabel 1). Vigtigst dobbelt phosphorylering på Ser-198 og Thr-199 blev kun identificeret i tilstedeværelse af en effektor protein (tabel 1). Vi har for nylig identificerede et lignende sæt Pto phosphoryleringssteder og illustreret betydningen af den dobbelte phosphorylering begivenhed for signalering 47.. Følge protokollen beskrevet her var vi i stand til at identificere dynamiske ændringer i phosphoryleringstilstanden af målproteinet.
Figur 1. Generelle eksperimentelle design. Målproteinet for immunoprecipitation (IP) er mærket og udtrykkes i planta, forbigående i Nicotiana benthamiana eller stabilt i Arabidopsis thaliana. Efter protein ekstraktionmålproteinet immunpræcipiteret med en affinitetsmatrix. Proteinerne adskilles på en acrylamidgel ved elektroforese. Gelbånd udskæres. Proteiner ekstraheres fra gelbånd og underkastes massespektrometri. Phosphoryleringssteder og interagerende proteiner identificeres. Klik her for at se større billede.
Figur 2.. Prf og Pto immunudfældning. A). Konstruktionen 35S: Prf-FLAG blev udtrykt transient i 38-12 linie (35S: PTO) sammen med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dage efter infiltration Prf blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-FLAG affinitetsmatrix. Immunoblots (IB) for Prf, AvrPtoB og Pto blev udført. Som påpeget af pile i bunden af Pto immunoblot panel, AvrPto og AvrPtoB fremkalde en langsommere migration af Pto. B). Konstruktionen 35S: Prf-FLAG blev udtrykt transient i 38-12 linie (35S: PTO) sammen med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dage efter infiltration Prf blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-FLAG agarose og separeret på SDS-PAGE. Gelen blev farvet med kolloidt Coomassie Brilliant Blue (CCBB) og synlige Prf blev Pto og AvrPtoB proteiner bånd udskåret fra gelen og analyseret ved massespektrometri. Den procentvise peptid dækning af PTO og PRF-sekvenser identificeret ved massespektrometri er angivet. C). Konstruktionerne 35S: Prf-3xHA og 35S: PTO-FLAG blev transient udtrykt sammen med 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto eller tom vektor (EV) i N. benthamiana. Tre dage efter infiltration den samlede mængde afPTO-FLAG blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-FLAG agarose og opløst på SDS-PAGE. Den synlige Pto og Pto-interagerende proteinbånd blev udskåret fra gelen og analyseret ved massespektrometri. Pto og 100 kDa Pto-interagerende protein band er klart synlige på kolloid Coomassie Brilliant Blue (CCBB) farvet gel, mens Prf er lidt mindre synlige (som angivet med pile). IP: Immunfældning, IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant Blue farvning, CCBB: kolloid Coomassie Brilliant Blue farvning. Klik her for at se større billede.
| Prf | |||
| EV | AvrPto | AvrPtoB | |
| Pto peptid 188-202 | |||
| GTELDQ [p T 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [p S 198] TVVK | 10 | 7 | 5. |
| GTELDQTHLS [p T 199] VVK | 8. | 3 | 4. |
| G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 8. | 4. |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| Pto peptid 187-202 | |||
| KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [p S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4. | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 7 | 5. |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| Peptider 187-202 og 188-202 | 83 | 88 | 50 |
| Procentdel af peptider med to fosforylering begivenheder | 0% | 26,9% | 11,2% |
| Pto Sequence Dækning | 78% | 79% | 82% |
Tabel 1 Dobbelt phosphorylering af en Pto peptid ved aktivering af signalering 35S:.. Prf-3xHA og 35S: PTO-FLAG blev transient udtrykt sammen med empty vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB i N. benthamiana. Tre dage efter infiltration den samlede mængde Pto-FLAG-proteinet blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-FLAG affinitetsmatrix og opløst på SDS-PAGE. De synlige bånd af Pto på kolloid Coomassie brilliant blå farvede gel blev skåret ud og analyseret med massespektrometri. Antallet af Pto peptider identificeret med 0, 1 og 2 fosforylering hændelser er angivet.
| Tabel af buffere | ||
| L medium | Trypton | 10 g / l |
| Gærekstrakt | 5 g / L | |
| NaCl | 5 g / L | |
| D-glucose | 1 g / L | |
| Agro-infiltration buffer | MgCl2 | 10 mM |
| MES </ Td> | 10 mM | |
| Juster til pH 5,5 | ||
| Acetosyringon (valgfrit) | 150 uM | |
| Buffer A | Tris-HCI, pH 7,5 | 150 mM |
| NaCl | 150 mM | |
| EDTA | 5 mM | |
| EGTA | 2 mM | |
| Glycerol | 5% (v / v) | |
| Puffer B | Buffer A | |
| PVPP | 2% (w / v) | |
| Puffer C | Puffer B | |
| Dithiothreitol (DTT) | 10 mM | |
| Plant Protease Inhibitor Cocktail | 1% (v / v) | |
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | 0,5 mM | |
| Calyculin A | 50 nM | |
| Natriumfluorid (NaF) | 50 mM | |
| Natriummolybdat (Na 2 Moo 4) | 10 mM | |
| Natriumorthovanadat | 1 mM | |
| Okadasyre | 100 nM | |
| Buffer D | Buffer C uden PVPP | |
| 5x SDS-PAGE loadingbuffer | Tris-HCI pH 6,8 | 60 mM |
| SDS | 2% | |
| Glycerol | 0,15% | |
| Bromphenolblåt | 0,10% | |
| DTT (tilføj lige før brug) | 50 mM |
Tabel 2. Buffer og medier opskrifter.
Discussion
Belyse den mekanisme af receptor-aktivering ved PAMPs og effektorer høj grad kan bidrage til vores forståelse af plante immunitet. I de sidste 20 år har genetiske og gær to-hybrid-skærme været medvirkende til opdagelsen af PRRs og NB-LRR proteiner. Mere for nylig er blevet etableret massespektrometri-baserede protokoller til identifikation af proteiner reguleres differentielt i immun signalering 55-58, deres PTMS 11,33,59,60, sammensætningen af immunkomplekser 61 og effektor målretter 62. Her beskriver vi en enkel protokol til identifikation af PTMS regulerer aktiveringen af immunkomplekser.
I sammenligning med tidligere beskrevne protokoller, denne protokol tillader detaljeret identifikation af dynamiske ændringer i PTMS. Protokoller af store proteomics tilgange kan identificere PTMS af proteiner, men er ikke i stand til at afsløre stedet plasticitet PTMS grund til at begrænseed mængder af protein. I tilfælde af protein-phosphorylering, store proteomics metoder typisk kun identificere de fremherskende phosphoryleringssteder 11,33,59. Den detaljerede karakterisering af et protein phosphorylering status kræver en betydelig mængde af protein, som kan frembringes ved delvis oprensning af målproteinet 47. Protokollen beskrevet her par en proteinoprensning fremgangsmåde, der giver en betydelig mængde af målproteinet med massespektrometri-analyse af det oprensede protein. Efter denne protokol blev den eneste fosforylering tilfælde af Pto tilskrives overvejende Ser-198 som tidligere beskrevet 52, men nogle massespektrometri spektre støttede også en enkelt fosforylering begivenhed på Thr-195 eller Thr-199. Når dobbelt phosphorylerings begivenhederne i Pto blev observeret, den dominerende kombination af fosforylaterede aminosyrer var Ser-198 og Thr-199, selv om kombinationer på andre sites også blev observeret (Tabel 1). Disse resultater viser klart phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser og evnen af den beskrevne protokol til at karakterisere i detaljer alle mulige phosphoryleringssteder.
De mest kritiske trin i denne protokol er: 1) tilstrækkelig udvinding af proteiner, 2) beskyttelse af PTMS og 3) tilstrækkelig mængde af target protein. Først tilstrækkelig ekstraktion af proteiner, er det vigtigt at formale væv i flydende nitrogen og derefter at anvende en vævshomogenisator, som beskrevet i protokollen. Hvis en vævshomogenisator ikke er tilgængelig, kan anvendes en morter og støder. Det er også vigtigt at anvende et forhold på én til tre (eller fire) gram væv mængde ekstraktionsbuffer. Dette væv til buffer-forholdet og den høje styrke buffer, som vi foreslår, vil sikre, at pH vil forblive neutral under udpakningen. Vi fandt, at det er af særlig betydning for A. thaliana og tomat ekstraORANSTALTNINGER 52.. Beskyttelse af PTMS kan opnås ved i alle buffere passende inhibitorer af enzymer, der kan fjerne PTMS. Det er også afgørende at udføre alle trin ved 4 ° C og at prechill buffere og instrumenter. Højere udbytter af målproteinet kan opnås ved hjælp af planter, som udtrykker proteinet i tilstrækkelige mængder og ved anvendelse af høje mængder af væv (ca. 20 g). Det mest afgørende skridt for at opnå tilstrækkelige mængder af target protein er at koncentrere målproteinet ved direkte immunudfældning. Betydningen af dette trin er fremhævet af vores manglende evne til at identificere PTMS PTO efter en Prf immunoprecipitation på grund af den begrænsede mængde coimmunoprecipitated Pto (figur 2B). I modsætning hertil direkte immunopræcipitation Pto gav væsentligt mere målbare peptider (figur 2C), der fører til 80% dækning af proteinsekvensen og identifikation af PTMS (tabel 1). Vi har også strongly anbefale brug af epitop-tags for protein immunoprecipitation. I sammenligning med antistoffer mod native proteiner epitop-tags affinitetsmatrix kan give højere mængder af delvist oprenset protein. Ved hjælp af et antistof mod native Pto protein 51 (figur 2A) for immunudfældning, var vi i stand til at identificere eneste single fosforylering af de to fremherskende phosphoryleringssteder i Pto.
Denne protokol er primært udviklet til delvis oprensning af N. benthamiana cytoplasmatisk protein og efterfølgende identifikation af deres phosphoryleringssteder. Men ved hjælp af de ændringer, der er beskrevet heri, denne protokol kan nemt tilpasses til A. thaliana proteiner og membran-bundne proteiner. Hovedformålet med denne protokol er at give tilstrækkelige mængder af målproteinet til identifikation af PTMS og ikke for at opnå den højeste renhed af komplekset. Hvis højere renhedaf komplekset kræves et andet trin af oprensningen kan føjes til denne protokol 52.. I dette tilfælde vil i første omgang give eluering af målproteinet fra affinitetsmatricen uden anvendelse af høje salte eller syre og det efterfølgende trin kan medføre en matrix, som kræver hårde elueringsbetingelser. Det er vigtigt at understrege, at vi kun har testet denne protokol til identifikation af phosphoryleringssteder og at vi tester i øjeblikket sin evne til detaljeret identifikation af yderligere PTMS.
Vores repræsentative resultater viser klart phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser og evnen af den beskrevne protokol til at karakterisere phosphoryleringssteder. Vigtigst er det, de fremhæver, at identifikation af phosphoryleringssteder afhængige i lav mængde af proteiner ved massespektrometri og ved en enkelt punktmutationer af auto-phosphoryleringssteder kan give forvirrende resultater. Vi viser her, og de tidligere 47 47,63 vist, at en enkelt punktmutationer i Ser-198 og Thr-199 til alanin, som forhindrer fosforylering på disse sider, er i stand til at signalere tyder på, at phosphorylering af disse websteder er ikke en forudsætning for kompleks aktivering . Disse resultater kan forklares nu ved phosphorylering af den sekundære side Thr-195. Tilsvarende indsigt i phosphoryleringssite plasticitet andet protein kinase kan opnås efter denne protokol. Desuden er en kombineret metode phosphoryleringssteder punktmutationer, proteiner, der kan hæmme specifikke kinaser (effektorer) kombineret med protein immunfældning og massespektrometri-analyse vil føre til en bedre forståelse af den evolutionære betydning phosphoryleringssted plasticitet proteinkinaser.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser (økonomiske eller andre).
Acknowledgments
VN er støttet af Royal Society. JPR er en Australian Research Council Future Fellow (FT0992129). Vi takker Dr. Miriam Gifford for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
References
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
