Visualisering av den immunologiske Synapse av Dual Color Time-gated Stimulert Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Abstract

Naturlige drepeceller dannes tett regulert, finstemt immunologiske synapser (IS) for å lysere virusinfiserte eller tumorigene celler. Dynamisk aktin omstilling er kritisk for funksjonen av NK-celler og dannelsen av IS. Imaging of F-aktin ved synapse har tradisjonelt benyttet konfokal mikroskopi, men diffraksjon grensen av lys begrenser oppløsning av fluorescensmikroskopi, inklusive konfokal, til ca 200 nm. Nylige fremskritt innen bildeteknologi har muliggjort utvikling av subdiffraction super-oppløsning bildebehandling begrenset. For å visualisere F-aktin-arkitektur ved IS rekapitulere vi NK-celle cytotoksisk synapse ved å følge NK-celler til å aktivere reseptoren på glass. Vi deretter bilde proteiner av interesse å bruke to farger stimulert emisjon uttømming mikroskopi (STED). Dette resulterer i <80 nm oppløsning ved synapse. Heri vi beskrive fremgangsmåten for prøvepreparering og oppkjøpet av bilder ved hjelp av dual coleller STED nanoscopy å visualisere F-aktin på NK IS. Vi belyser også optimalisering av prøven innsamlingen med Leica SP8 programvare og tid-gated STED. Til slutt, vi utnytte Huygens programvare for etterbehandling dekonvolusjon av bilder.

Introduction

Den immunologiske synapse er et komplekst miljø av signalanlegg proteiner og cytoskeletal elementer. Den cytolytiske synapse ble opprinnelig beskrevet som å ha en "blinken" som struktur med en ring av aktin og adhesjonsmolekyler rundt en sentral sekretorisk domene ^1-4. Men nå vet vi at den består av mikroskopiske domener av aktiv signal som krever kontinuerlig dynamisk cytoskeletal omorganisering for funksjon ^5-11. Mye av den informasjonen som vi nå har om synapse er avledet fra mikroskopi, og immunologer har vært tidlige brukere av cutting-edge bildeteknologi.

En slik roman teknologi er super-oppløsning mikroskopi. Konvensjonell lysmikroskopi er romlig begrenset av diffraksjon av lys hindring, som angir den nedre grense for oppløsning for all fluorescens mikroskopi, inklusive konfokal, ved omtrent 200 nm. I de senere årene har flere teknikker vært utvid som tillater oppløsning under diffraksjon barriere. Disse inkluderer stimulering utslipp uttømming mikroskopi (STED), strukturert belysning mikroskopi (SIM), stokastisk løst mikroskopi (STORM), og photoactivatable lysmikroskopi (PALM). Disse teknikkene har blitt gjennomgått i detalj andre steder ^12-15, men er beskrevet nedenfor. Subdiffraction begrenset oppløsning er generert på unike måter i hvert system. Valget av en super-oppløsning teknikk burde derfor være diktert av eksperimentet og eksperimentelt system av interesse.

STED super oppløsning oppnås ved hjelp av en høy intensitet torroidal uttømming stråle som selektivt "stillhet" fluorescens rundt hver Fluoroforen av interesse etter eksitasjon, noe som resulterer i subdiffraction begrenset fluorescens mikros ^16-18. En fordel med STED er at bildet oppkjøpet er rask og krever relativt lite etterbehandling. Mens fargestoff valg er diktert av spectral stilling for uttømming strålen, som i det kommersielt tilgjengelige system ligger ved 592 nm, flere kommersielt tilgjengelige fargestoffer som er tilgjengelige som gjør kombinasjoner av to fluoroforer mulig. I tillegg kan vanligvis brukes fluorescerende reportere som GFP bli fotografert, noe som gjør levende celle eksperimenter mulig ^19,20.

Vi har tidligere brukt STED å identifisere og kvantifisere regioner av F-aktin hypodensity som benyttes av NK-celler for degranulation ^21,22. Vi foreslår at STED er et godt valg for imaging immun synapse på grunn av sin relativt fleksibel tilgjengelighet av fluoroforene og overlegen forbedring i oppløsning i xy-aksen. I tillegg, på den kommersielt tilgjengelige STED system benyttes for disse forsøkene, tillater bruken av en høyhastighets-(12.000 Hz) resonans-scanner for rask anskaffelse av bilder med minimal skade på prøvene. Begrenset fleksibilitet i fargestoff utvalget er ansett som en ulempe av STED ^12,men dobbel farge STED er relativt enkelt med flere kommersielt tilgjengelige fluorophores. Integreringen av STED med en laserskanning confocal mikroskop gir også mulighet for ytterligere confocal bildebehandling i kombinasjon med STED, så mens STED er begrenset til to kanaler, kan flere strukturer avbildes i confocal med oppløsning på ca 200 nm (E. Mace, upubliserte observasjoner ). Mens vi beskriver bruken av STED for avbilding av immunceller, er denne teknologien anvendes på en rekke celletyper, inkludert nerveceller, og for å visualisere en rekke cellekonstruksjoner ^23-26.

SIM bruker en annen tilnærming til å generere subdiffraction begrenset bilder. Ved å visualisere kjente periodisk eksitasjon mønstre, kan informasjonen da bli innhentet om det ukjente strukturen blir studert etter matematisk transformasjon ^27. Dette gir en økning i oppløsningen til ~ 100 nm lateralt ^28,29. Fordelen med SIM er at det jegs kompatibel med alle standard confocal fargestoffer og sonder, men ulempen er at det er mye tregere å hente bilder og disse krever langvarig etterbehandling ^12. Dette begrenser også bruken for live cell imaging.

Endelig kan super-oppløsning bli generert av stokastiske foto-bytting av fluorophores. Denne tilnærmingen er utnyttet i foto aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastisk optisk gjenoppbygging mikroskopi (STORM). Ved å skanne flere kamera rammer og lokalisere tilfeldig aktivert molekyler som er slått "på" og "off" over tid, er bilder med 20-30 nm oppløsning generert fra akkumulert rammer ^30-32. The trade-off for denne resolusjonen er den tiden det tar å hente bilder.

Her viser vi, i detalj, protokollen for å forberede og bildebehandling doble fargeprøver i STED. I dette systemet, er eksitasjon med en pulset, avstembar, hvitt lys, laser. På grunn av naturenav den pulserende eksitasjon bjelke, er tid gating av deteksjon gjort mulig og ytterligere økninger oppløsning. I tillegg er systemet utstyrt med gadolinium hybrid (HYD) detektorer, som er mer følsom enn konvensjonelle fotomultiplikatorrør, noe som tillater en lavere krav til lasereffekt. Uttømming strålen for STED brukes kontinuerlig, og er innstilt på 592 nm, noe som vil diktere valg av fargestoffer som er tilgjengelige for to farger STED. Vanlig brukte fargestoff kombinasjoner inkluderer generelt en nervøs av 488 nm (som Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grønne, eller Chromeo 488) og en nervøs av 458 nm (for eksempel Pacific Orange eller Horizon V500). Således, mens deteksjon av de to fargestoffer vil være i et lignende område (og begge er tilgjengelig ved uttømming laser), vil magnetisering oppstå med forskjellige bølgelengder. Med et hvitt lys laser og tunbare detektorer, er å maksimere signal mens eliminere spektral overlapping gjøres ganske enkelt. Som sådan, har vi hatt god suksess med combinationer av kommersielt tilgjengelige fargestoffer, slik som Pacific Orange og Alexa Fluor 488 (benyttet her). Vår protokollen er tilpasset mot, og beskriver evalueringen av humane NK-celler så som representerer historisk fokus i vårt laboratorium. Vi har spesielt anvendelse av NK92 cellelinje i dette eksempel som den som er en vi har ofte anvendt i vårt eksperimentelle arbeid ^21,33.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 cover slips	VWR	48393-172
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554722
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Cotton tipped applicator	Fisher Scientific	S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml)	VWR	352070
Fetal calf serum (FCS) (500 ml)	Atlantic Biologicals	S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange	Life Technologies	P31584
Laboratory tissue wipers	VWR	82003-820
Nail polish	VWR	100491-940
NK-92 cells	ATCC	CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488	Life Technologies	A12379
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14190250
Prolong anti-fade reagent	Life Technologies	P7481
Purified anti-CD18	Biolegend	301202
Purified anti-NKp30	Biolegend	325202
Purified anti-perforin	Biolegend	308102
RPMI 1640 medium (500 ml)	Life Technologies	11875-093
Saponin from Quillaja bark	Sigma	S4521
Super PAP pen	Life Technologies	008899
Triton X-100	Electron Microscopy Sciences	22142
Huygens deconvolution software	SVI	Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope	Leica Microsystems	contact company