Summary
Här illustrerar vi det protokoll för avbildning med tvåfärgad Sted nanoskopi den cytotoxiska immun synapsen av NK-celler rekapituleras på glas. Med denna metod får vi sub-100 nm upplösning på synapsproteiner och cytoskelettet.
Abstract
Naturliga mördarceller bildar hårt reglerade, finstämda immunologiska synapser (IS) för att lysera virusinfekterade eller tumörframkallande celler. Dynamisk aktin omorganisationen är kritisk för funktionen av NK-celler och bildandet av IS. Imaging av F-aktin i synapsen har traditionellt utnyttjat konfokalmikroskopi dock diffraktionsgränsen av ljuset begränsar upplösningen av fluorescensmikroskopi, inklusive konfokal, cirka 200 nm. Senaste framstegen inom bild teknik har möjliggjort utvecklingen av subdiffraction begränsade super upplösning avbildning. För att visualisera F-aktin arkitektur på IS rekapitulera vi NK cell cytotoxiska synapsen genom att följa NK-celler för att aktivera receptorn på glas. Vi sedan bild proteiner av intresse genom att använda två färger stimulerad utarmning utsläpp mikroskopi (Sted). Detta resulterar i <80 nm upplösning i synapsen. Häri beskriver vi de steg av provpreparering och förvärvet av bilder med hjälp av dubbla coleller STED nanoskopi att visualisera F-aktin vid NK IS. Vi belyser även optimering av prov förvärv använda Leica SP8 programvara och tids gated Sted. Slutligen använder vi Huygens mjukvara för efterbearbetning deconvolution av bilder.
Introduction
Den immunologiska synaps är en komplex miljö av signalproteiner och cytoskelettala element. Den cytolytiska synaps ursprungligen beskrivs ha en "bulls-eye" liknande struktur med en ring av aktin och adhesionsmolekyler som omger en central sekretorisk domän 1-4. Men vi vet nu att det består av mikroskopiska områden av aktiv signalering som kräver kontinuerliga dynamiska cytoskelettala omorganisation för funktion 5-11. Mycket av den information som vi nu har om synapsen har hämtats från mikroskopi, och immunologer har varit tidiga användare av avancerad bildteknik.
En sådan ny teknik är super-resolution mikroskopi. Konventionell Ijusmikroskopi är spatialt begränsad av diffraktion barriären av ljus, som anger den lägre gränsen för upplösning för alla fluorescensmikroskopi, inklusive konfokala, vid ca 200 nm. Under senare år har flera tekniker varit developed som tillåter upplösning nedanför diffraktion barriären. Dessa inkluderar stimulering emissions utarmning mikroskopi (Sted), strukturerad belysning mikroskopi (SIM), stokastiskt löst mikroskopi (STORM), och fotoaktiverbart ljusmikroskop (PALM). Dessa tekniker har granskats i detalj på annan plats 12-15, men beskrivs nedan. Subdiffraction begränsad upplösning genereras på ett unikt sätt i varje system. Valet av en super-resolution teknik därför bör styras av experimentet och experimentsystem av intresse.
Sted superupplösning uppnås med hjälp av en hög intensitet toroid utarmning stråle som selektivt "tystnader" fluorescens runt varje fluoroforen av intresse efter excitation, vilket resulterar i subdiffraction begränsad fluorescensmikroskopi 16-18. En fördel med STED är att bilden förvärvet är snabb och kräver relativt lite efterbearbetning. Medan färgämne val dikteras av spectral position för uttömning stråle, som i det kommersiellt tillgängliga systemet är beläget på 592 nm, flera kommersiellt tillgängliga färgämnen är tillgängliga som gör kombinationer av två fluoroforer möjligt. Dessutom kan vanligen använda fluorescerande reportrar såsom GFP skall avbildas, vilket gör levande cellförsök möjligt 19,20.
Vi har tidigare använt Sted att identifiera och kvantifiera regioner av F-aktin hypodensity som används av NK-celler för degranulering 21,22. Vi föreslår att Sted är ett bra val för avbildning immun synapsen på grund av dess relativt flexibel tillgång på fluoroforer och överlägsen förbättring i upplösning i xy-axeln. Dessutom, på kommersiellt tillgängliga Sted-system utnyttjas för dessa experiment, användandet av en hög hastighet (12.000 Hz) resonans möjliggör snabb förvärv av bilder med minimal skada på prov. Begränsad flexibilitet i färg valet anses vara en nackdel med Sted 12,Men tvåfärgade Sted är relativt enkelt med flera kommersiellt tillgängliga fluoroforer. Integrationen av Sted med en laserskanning konfokalmikroskop möjliggör också ytterligare konfokal avbildning i kombination med Sted, så medan Sted är begränsat till två kanaler, kan ytterligare strukturer avbildas i konfokal med upplösning på ca 200 nm (E. Mace, opublicerade observationer ). Medan vi beskriver användningen av STED för avbildning av immunceller, används denna teknik tillämpas på en mängd olika celltyper, inklusive neurala celler, och för att visualisera en mängd olika cellstrukturer 23-26.
SIM använder en annan metod för att generera subdiffraction begränsade bilder. Genom att visualisera kända periodisk excitation mönster, kan informationen då erhållas om okänd struktur som studeras efter matematisk transformation 27. Detta ger en ökning av upplösningen till ~ 100 nm i sidled 28,29. Fördelen med SIM är att det jagar kompatibel med alla vanliga konfokala färgämnen och sonder, men nackdelen är att det är mycket långsammare att få bilder och dessa kräver långa efterbearbetning 12. Detta begränsar också dess användning för levande cell imaging.
Slutligen kan super-upplösning genereras genom stokastisk foto-växling av fluoroforer. Detta tillvägagångssätt utnyttjas i fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (Palm) och stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). Genom att skanna flera kameraramar och lokalisera slumpmässigt aktiverade molekyler som vänds "på" och "off" med tiden, är bilder med 20-30 nm upplösning genereras från ackumulerade ramar 30-32. Den kompromiss för denna resolution är den tid som krävs för att få bilder.
Här visar vi, i detalj, protokollet för att förbereda och avbildning dubbla färgprover i Sted. I detta system är excitering med en pulsad, avstämbara, vitt ljus laser. På grund av karaktärenav den pulsade excitationsstrålen, är tids gating för detektion möjlig och ytterligare ökningar upplösning. Dessutom är systemet utrustat med gadolinium-hybrid (HYD) detektorer, vilka är känsligare än konventionella fotomultiplikatorrör, vilket möjliggör lägre lasereffektkrav. Den utarmning beam för Sted appliceras kontinuerligt och är inställd på 592 nm, som kommer att diktera valet av färgämnen som två färger Sted. Vanligen använda färgämneskombinationer inkluderar vanligen en hetsiga med 488 nm (t.ex. Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grönt eller Chromeo 488) och en lättretad med 458 nm (t.ex. Pacific Orange eller Horizon V500). Således, medan detektering av de två färgämnena kommer att vara i ungefär samma intervall (och båda är tillgängliga med utarmningslaser), kommer excitering inträffa med olika våglängder. Med ett justerbart vitt ljus laser och avstämbara detektorer, är att maximera signal samtidigt som man eliminerar spektral överlappning görs ganska lätt. Som sådan har vi haft god framgång med combinatjoner på kommersiellt tillgängliga färgämnen, såsom Pacific Orange och Alexa Fluor 488 (används här). Vår protokoll är skräddarsytt för och beskriver utvärderingen av humana NK-celler som representerar den historiska fokus för vårt laboratorium. Vi är speciellt utnyttjar NK92 cellinjen i detta exempel eftersom det är en som vi har regelbundet tillämpas i vår experimentella arbetet 21,33.
Protocol
1. Coat Täck med Antibody
- Förvärm (vid 37 ° C) 30 ml av RPMI-10% FCS-media och 1 ml BD Cytofix / Cytoperm.
- Bered en lösning av 5 | ig / ml av renad antikropp i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). För aktivering av NK92 cellinje, användning av anti-CD18 och anti-NKp30 rekommenderas.
- Markera en ungefär dime storlek cirkel för varje tillstånd på en # 1,5 täckglas med hjälp av en PAP penna. För en dubbel färgexperiment, bör det finnas fyra villkor: ofärgade, dubbla färgade och två enkla färgade villkor. Dispensera 200 | il av antikropplösningen i varje region och inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Tvätta täckglas genom att försiktigt sänka ner var och en i 50 ml PBS i ett 50 ml koniskt rör vid rumstemperatur. Tvättning bör ske omedelbart före tillsatsen av celler och försiktighet bör iakttas för att undvika antikropps torkning på täckglas.
2. Aktivera NK-celler på Coverympkvistar; Fix och permeabilize
- Isolera 5 x 10 5 NK92 celler per tillstånd. Centrifugera och dekantera supernatanten. Tvätta en gång med 10 ml förvärmda media från steg 1.1. Centrifugera och dekantera supernatanten.
- Slamma upp cellerna i förvärmda media från steg 1.1 vid en koncentration av 2,5 x 10 6 / ml.
- Häll försiktigt 200 jul till mitten av regionen skapas i avsnitt 1.2.1. Inkubera vid 37 ° C under 20 min vid 5% CO2. (OBS: den här gången kan utökas eller minskas beroende på den biologiska funktionen av intresse för NK cell granulat polarisering, är 20 minuter räcker.).
- Efter inkubation av celler, försiktigt tvätta täckglas genom att sänka ner respektive i 50 ml rumstemperatur PBS i en 50 ml koniska rör.
- Tillsätt 1 l av Triton X-100 till 1 ml av förvärmd Fix / Perm-lösning från steg 1,1 och skaka ordentligt. Fix och permeabilize genom att tillsätta 200 pl Fix / Perm buffert (steg 2,3) till cellerna. Inkubera under 10 min i mörker vid rumstemperatur.
3. Fläck Celler
- Förbered färgningsbuffert: Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1% BSA, 0,1% saponin.
- Bered lösning av primär antikropp i 200 | il färgningsbuffert (se steg 3.1). (OBS: antikropp ska titreras före användning). Undvik att använda primär antikropp som är uppvuxen i samma art som används för att belägga täckglas (steg 1,2). Undvik också Strepatividin-biotin kopplingar för Sted avbildning.
- Efter avsnitt 2.3.1, försiktigt tvätta täckglas i 50 ml färgning buffert. Badda kanter PAP-penna region med bomullspinne för att avlägsna överskottsbuffert. Applicera antikroppslösningen skapas i avsnitt 3.1.1. Inkubera 30 minuter i mörker vid rumstemperatur. (Rekommenderas: inkubera täckglas i skjutlåda med en fuktig pappershandduk för att bibehålla fuktigheten).
- Bered lösning av sekundär antikropp i 200 | il färgningbuffert. Rekommenderade fluoroforer är Alexa Fluor 488, Pacific Orange, och V500. I allmänhet är en 1:200 utspädning lämplig för STED avbildning.
- Tvätta försiktigt täckglas i 50 ml färgning buffert. Badda kanter PAP-penna region med bomullspinne för att avlägsna överskottsbuffert. Applicera sekundär antikroppslösning. Inkubera 30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Upprepa tvättning och färgning för ytterligare proteiner av intresse. Om detektering av F-aktin med Phalloidin kan detta inkluderas med sekundär antikropp, i allmänhet vid en 1:200 spädning.
4. Mount Täck på Slides
- Förbered monteringsmedel. Anm: Förläng eller Förläng Gold är att föredra. Vectashield måste undvikas, eftersom det inte är förenligt med Sted. 2,2-thiodioethanol måste undvikas om Phalloidin används. Mowiol är acceptabel.
- Placera ca 10-20 pl monteringsmedium på en bild. Uteslut täckglas (cell-nedåt) och montera täckglas försiktigt, var noga med attundvika att införa luftbubblor. Inkubera objektglasen i 24 timmar (täckglas upp) före avbildning.
- Täta kanterna på täckglas med nagellack.
5. Experimentuppställning
- Initiera nödvändiga laser och programvara. Initiera Sted utarmning laser vid 100% effekt. Rikta Sted laser, vilket i fallet med kommersiella system är ofta ett automatiserat förfarande.
- Fokusera provet, med början med enstaka färgade kontroll på mikroskopet med okular.
6. Optimering av inställningar
- Skanna den första kanalen och optimera lasereffekt, excitationsstrålen position och detektorområde. Undvik om möjligt en vinst på> 100. Fånga bilden i konfokala att optimera inställningarna. Line och / eller ram medelvärdes ökar upplösningen. Kontrollera om pixel mättnad. OBS: Vissa mättnad är acceptabelt i konfokal som tillämpning av Sted kommer att minska intensiteten i utsläppen. För Sted, kommer en optimal pixelstorlek vara under 30 nm hurallt bättre upplösning uppnås med mindre storlekar pixel. Storleken på regionen av intresse som avbildas kommer att diktera den nedre gränsen för pixelstorlek. Mindre storlekar pixel kan öka fotoblekning.
- Applicera Sted utarmning beam och fånga bilden, med början med 50% utarmning lasereffekt. Om en förbättring i upplösning ses, kan mer utarmning lasereffekt tillämpas. I detta skede kan det bli nödvändigt att justera excitation laser makt, linje genomsnitt, och / eller vinst.
- Applicera tid gating för att minska bakgrunds (minst 0,3 ns). Justera inställningarna tills en förbättring i upplösning över konfokal syns. Upplösning kan approximeras genom att uppskatta fullt bredd halv max (FWHM). Detta representerar avståndet vid halv maximal intensitet av en Gauss topp skapas genom att dra en linje profil för strukturen av intresse, och är en allmänt använd metod för uppskattning upplösning.
- När den första kanalen är tillfredsställande, initiera en andra sekvens för sigföljdmässig avsökning. I allmänhet är det bäst att skanna längre våglängd fluorofor först. Upprepa steg 6.1 på andra kanalen.
- Bekräfta brist på spektral överlappning genom att avbilda enskilda färgade kontroller med både skannings sekvenser. Mild spektral överlappning kan korrigeras med hjälp av spektrala un-blandnings funktioner i mjukvaran, men bör undvikas om möjligt.
7. Image Acquisition
- Hämta bilder. För kvantitativ avbildning, rekommenderas att få minst 20 bilder / skick. Det exakta antalet, dock bör fastställas i enlighet med den experimentella frågan i samförstånd med en statistisk metod, t.ex. stickprovsstorlek beräkning. Spara experimentet.
8. Deconvolution
- Öppna filen med deconvolution programvara eller batch-processor. Kontrollera parametrar för varje kanal med hjälp av programvara. Bekräfta varje kanals excitation och emissionsspektra, Sted utarmning utsläpp, och bildhantering riktningning (upp eller ner, om bilden är 3-dimensionella) i synnerhet.
- Deconvolve hjälp av avfaltning guiden. Standardinställningar är i allmänhet tillräckliga, men signal-brus-förhållande (SNTR) varierar från fluoroforen till fluoroforen och måste bestämmas för varje kanal och varje experiment för sig.
Representative Results
Det är uppenbart att ett primärt mål av super-resolution imaging vara en förbättring jämfört med konventionell konfokalmikroskopi. Men det finns några vanliga fallgropar som kan leda till suboptimal upplösning. Dessa kräver att varje experiment optimeras individuellt. I vår representativt experiment, vi avbildning F-aktin nätverket i en NK-cell aktiveras av antikropp bunden till glaset. Vanliga orsaker till (och korrigeringar) brist på förbättrad upplösning på Sted över konfokal är följande:
- Under-provtagning (Figur 1a). Kan detta leda till kornighet och förlust av information pixel, vilket framgår av dålig upplösning av F-aktin filament. Ökad linje eller ram medelvärdes kan ofta korrigera detta.
- Blekning och / eller översampling (Figur 1b). Detta kan orsakas av långvarig pixel uppehållstid till följd av för hög ingående medelvärdes. Alternativt kan det vara ett resultat av överskanning av bilden före förvärvet, inklusive över-användning avutarmnings laser. Detta resulterar vanligtvis i disiga eller suddiga bilder. Detta kan korrigeras genom att skanna intresseområde endast minimalt innan förvärva eller, om möjligt, öka laserskanningshastighet. Om problemet kvarstår, kan utarmning lasereffekten minskas.
Genom att uppnå rätt balans mellan pixel uppehållstid, excitation lasereffekt, och utarmning lasereffekt, en bild med bättre upplösning och tillräcklig information kan genereras (figur 1c). Upplösning kan förbättras ytterligare genom att använda deconvolution (figur 1d). När förvärvet är optimerad, kommer deconvolution förbättra upplösningen både kvalitativt och kvantitativt och sub-100 nm upplösning bör vara rutinmässigt uppnås.
Figur 1. Optimering av förvärv och vanliga fallgropar för Sted avbildning. NK92 celler aktiverades på anti-CD18 och-NKp30 belagt glas för 20 minuter sedan fast, permeabilized och färgas för F-aktin med Phalloidin Alexa Fluor 488. A) Ett exempel på förlust av bildinformation på grund av undersampling. b) Ett exempel på förlust av upplösning på grund av blekning / översampling c) villkor optimerad d) optimerade förhållanden leder till större förbättring av upplösningen med deconvolution. Scale bar = 5 | im.
Discussion
Förbättringen i upplösning över konfokal blir något beroende av faktorer som inte kan kontrolleras. Dessa faktorer inkluderar smärre avvikelser i täckglastjocklek och inkonsekvenser i monteringsmedier. Det är viktigt att hålla temperaturen och fuktigheten i avbildningsrummet så enhetlig som möjligt och STED trålen bör uträtad ungefär var 60 min. Som nämnts i procedurer, måste användningen av Vectashield monteringsmedium undvikas, eftersom detta inte är förenligt med Sted. Förutom som man bör alltid använda # 1,5 täckglas, och om möjligt, använder de som har verifierats till en specifik tjocklek.
En modifiering av den metod som beskrivs här är att bilden ytterligare kanaler i konfokal, använda fluoroforer som släpper vid en längre våglängd än Sted balken. På detta sätt, man kan bilden upp till fyra kanaler (två i konfokal, två i Sted). Om du tar detta synsätt, men kanalerna med fluoroforer ererna sänder sin ovanför STED utarmning lasern måste avbildas först, eftersom tillämpningen av STED trålen kommer bryter fotoner i dessa kanaler. En fördel med denna teknik är att tillämpa tidsslussning, vilket också kommer att förbättra upplösningen i konfokal genom att eliminera utsläpp av fotoner med korta livstider 34. I synnerhet kommer att använda tiden slussning, tidpunkten för emissionsdetektorer för att motsvara med pulsad excitation Sted, minskar bakgrundsfluorescens från reflektion av täckglaset när avbildning nära den. Även i ett experiment som inte lämpar sig för Sted, om du använder en pulsad exciteringskälla, kan tidsgrind vara ett användbart verktyg för att förbättra upplösningen i konfokal.
Det finns olika modifieringar som kan utnyttjas för att förbättra upplösningen i Sted. Ett är att minska storleken på nålhålet från standard en Airy enhet, även om detta kommer också att minska mängden ljus som når provet. Detta kan kompenseras genom att öka laser makt eller vinning. En annan är att öka linjegenomsnitt, vilket kommer att öka den mängd information som samlats för varje foton, förbättrad upplösning. Även här kan dock detta vara på bekostnad av fotoblekning av provet, så en balans måste uppnås mellan upplösning och blekning. På samma sätt kommer användningen av fluorescerande proteiner såsom GFP kräver noggrann optimering för att undvika blekning. Detta kan åstadkommas genom minskning STED lasereffekt om nödvändigt. Längre tidpunkter kommer även att möjliggöra större foton återhämtning och minska blekning. Korrigering för fotoblekning bör redovisas vid analys av levande Sted.
Naturligtvis är avbildning i tre dimensioner i STED också möjligt, och kommer också att ge en förbättring jämfört med konventionell konfokal avbildning. Detta gäller särskilt om den görs i kombination med avfaltning, även om försiktighet bör iakttas för att korrigera för drift som sker under avbildning flera plan i z-axeln. Om du använder Huygens programvaraatt deconvolve Korrigeringen erhålls genom att använda "stabilisera bild"-funktionen. Med användning av detta tillvägagångssätt kommer upplösningen i z-axeln förbättras. Detta är en stor förbättring jämfört med konventionell konfokal avbildning, som har dålig axiell upplösning och till och med över bara sted sig själv, som också har relativt dålig z-axel-upplösning. Medan förvärva flera högar i Sted, måste man vara försiktig för att undvika blekning av provet, och vid behov kan man minska linje utjämning eller lasereffekt intensitet för att kunna göra detta. Återigen bör det noteras att om bildåtergivning andra fluoroforer som inte är lämpliga för STED, skulle tillämpningen av utarmnings strålen i den första sekventiell avsökning förhindra emission från dessa kanaler. Därför, en blandad Sted / konfokal strategi (vid användning av konfokal scanning i kanaler som släpper vid en våglängd som överstiger 592 nm) kommer tyvärr inte att vara lämplig för 3D.
För att summera, har vi valt STED som en metod på grund av dess relativa lätthet av APPskriften och förbättring i upplösning över standard konfokal avbildning. För avbildning immun synapsen, har det visat sig vara ett effektivt och värdefull teknik som tillåter oss att se detaljer i F-aktin arkitektur inte möjligt upplösning över 200 nm. Även om många av dessa uppgifter verkar subtila, de kan ha en djupgående effekt på NK cellernas funktion. Därför tillämpar vi den senaste nanoskopiska bildteknik för att hämta uppgifter som är avgörande för att upprätthålla människors hälsa.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Partiell publicering kostnaden för denna artikel har bekostas av Leica Microsystems, Inc.
Acknowledgments
Vi tackar Geoff Daniels för att få hjälp. Detta arbete har finansierats av R01 AI067946 till JSO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 cover slips | VWR | 48393-172 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554722 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Cotton tipped applicator | Fisher Scientific | S450941 | |
| Falcon centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 352070 | |
| Fetal calf serum (FCS) (500 ml) | Atlantic Biologicals | S11050 | |
| Goat anti-rabbit Pacific Orange | Life Technologies | P31584 | |
| Laboratory tissue wipers | VWR | 82003-820 | |
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| NK-92 cells | ATCC | CRL-2407 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A12379 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14190250 | |
| Prolong anti-fade reagent | Life Technologies | P7481 | |
| Purified anti-CD18 | Biolegend | 301202 | |
| Purified anti-NKp30 | Biolegend | 325202 | |
| Purified anti-perforin | Biolegend | 308102 | |
| RPMI 1640 medium (500 ml) | Life Technologies | 11875-093 | |
| Saponin from Quillaja bark | Sigma | S4521 | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 008899 | |
| Triton X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22142 | |
| Huygens deconvolution software | SVI | Contact company | |
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica Microsystems | contact company |
References
- Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
- Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
- Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
- Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
- Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
- Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
- Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
- Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
- Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
