Summary
Aqui, ilustramos o protocolo para a imagiologia por duas cores STED Nanoscopia citotóxica sinapse imune das células NK retomados em vidro. Usando este método, obtemos resolução nm sub-100 de proteínas de sinapses e do citoesqueleto.
Abstract
Células assassinas naturais formam fortemente regulamentados, sinapses imunológicas afinado (SI), a fim de lisar células infectadas por vírus ou tumorais. Reorganização da actina dinâmica é crítico para a função das células NK e a formação do IS. Imagiologia de actina F na sinapse, tradicionalmente utilizada microscopia confocal, no entanto, o limite de difracção da luz limita resolução de microscopia de fluorescência, incluindo confocal, de aproximadamente 200 nm. Os recentes avanços na tecnologia de imagem permitiram o desenvolvimento de subdiffraction limitada super-resolução de imagem. Para visualizar arquitetura F-actina no IS que recapitular o NK citotóxicas célula sinapse aderindo células NK para ativar receptor em vidro. Em seguida, as proteínas de interesse imagem usando duas cores esgotamento emissão estimulada de microscopia (STED). Isto resulta em <80 nm resolução na sinapse. Aqui nós descrevemos as etapas de preparação da amostra e da aquisição de imagens usando dupla colou STED Nanoscopia visualizar F-actina no NK IS. Também ilustram otimização de aquisição de amostra usando o software Leica SP8 e STED fechado a tempo. Finalmente, nós utilizamos software de Huygens para deconvolução de pós-processamento de imagens.
Introduction
A sinapse imunológica é um meio complexo de proteínas de sinalização e de elementos do citoesqueleto. A sinapse citolítica foi originalmente descrito como tendo um "bulls-eye" como a estrutura com um anel de actina e moléculas de adesão em torno de um domínio central secretor 1-4. No entanto, agora sabemos que ele é composto de domínios microscópicos de sinalização ativa que requerem contínua reorganização do citoesqueleto dinâmico para a função 5-11. Grande parte da informação que temos agora sobre a sinapse foi derivado de microscopia e imunologistas foram os primeiros a adotar a tecnologia de imagem de última geração.
Uma novela tal tecnologia é a microscopia de super-resolução. A microscopia de luz convencional é espacialmente limitado pela difracção de barreira de luz, que define o limite inferior de resolução de todos microscopia de fluorescência, incluindo confocal, a cerca de 200 nm. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido developed que permitem resolução abaixo da barreira de difração. Estes incluem emissão microscopia estimulação exaustão (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM), microscopia estocasticamente resolvido (STORM) e microscopia de luz fotoactivável (PALM). Estas técnicas foram analisados em detalhe em outro lugar 12-15, mas são descritos abaixo. Subdiffraction resolução limitada é gerada de maneira única em cada sistema. A selecção de uma técnica de super-resolução, por conseguinte, deverá ser ditada pela experiência e sistema experimental de interesse.
STED super-resolução é conseguido usando uma alta intensidade torroidal esgotamento trave que seletivamente "silêncios" de fluorescência em torno de cada fluoróforo de juros após excitação, resultando em microscopia de fluorescência limitada subdiffraction 16-18. Uma das vantagens de STED é que a aquisição da imagem é rápida e exige relativamente pouco pós-processamento. Enquanto selecção corante é ditada pela especificaçãotral posição do feixe de esgotamento, o qual no sistema comercialmente disponível está situado em 592 nm, vários corantes disponíveis comercialmente estão disponíveis que fazer combinações de dois fluoróforos possível. Além disso, repórteres fluorescentes vulgarmente utilizados, tais como a GFP pode ser trabalhada, fazendo experiências com células vivas possível 19,20.
Nós já usou STED para identificar e quantificar as regiões do hipodensidade F-actina que são utilizados por células NK para degranulação 21,22. Propomos que STED é uma boa escolha para a imagem da sinapse imunológica devido à sua disponibilidade relativamente flexível de fluoróforos e melhora superior na resolução no eixo xy. Além disso, no sistema STED disponível comercialmente utilizada para estas experiências, o uso de um scanner de ressonância de alta velocidade (12.000 Hz) permite a rápida aquisição de imagens com o mínimo de danos às amostras. Flexibilidade limitada na selecção de corante é considerado uma desvantagem dos STED 12,Contudo cor dupla STED é relativamente simples com vários fluoróforos disponíveis comercialmente. A integração de STED com um microscópio confocal de varredura a laser também permite a imagem confocal adicional em combinação com STED, por isso, enquanto STED é limitada a dois canais, estruturas adicionais podem ser visualizados em confocal com resolução de cerca de 200 nm (E. Mace, observações não publicadas ). Enquanto que descrevem a utilização de STED para imagiologia de células imunitárias, esta tecnologia é aplicada a uma variedade de tipos de células, incluindo células neuronais, e para visualização de uma variedade de estruturas celulares 23-26.
SIM usa uma abordagem diferente para gerar imagens limitam-subdiffraction. Ao visualizar conhecidos padrões de excitação periódica, a informação pode, então, ser obtida sobre a estrutura desconhecida a ser estudada após transformação matemática 27. Isso gera um aumento na resolução de ~ 100 nm lateralmente 28,29. A vantagem de SIM é que is compatível com todos os corantes confocal padrão e sondas, no entanto, a desvantagem é que é muito mais lento a aquisição de imagens e estas requerem longos pós-processamento 12. Isso também limita o seu uso para imagens de células vivas.
Finalmente, as imagens de super-resolução pode ser gerado por foto-estocástico comutação de fluoróforos. Esta abordagem é explorada em microscopia de localização ativado por foto (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástica (STORM). Ao digitalizar vários quadros de câmeras e localização de moléculas ativadas aleatoriamente que estão em "ON" e "off" ao longo do tempo, imagens com resolução de 20-30 nm são gerados a partir de quadros acumulados 30-32. O trade-off para esta resolução é o tempo necessário para adquirir imagens.
Aqui nós mostramos, em detalhes, o protocolo para a preparação e imagem amostras de cores duplas em STED. Neste sistema, a excitação é com um pulsada, sintonizável, laser de luz branca. Devido à naturezado feixe de excitação por impulsos, gating tempo de detecção é tornada possível e resolução mais aumentos. Além disso, o sistema é equipado com gadolínio híbrido (HYD) detectores, que são mais sensíveis do que os tubos fotomultiplicadores convencionais, permitindo assim menores requisitos de potência de laser. O feixe de esgotamento para STED é aplicado de forma contínua e é ajustado para 592 nm, o que vai ditar a escolha de tintas disponíveis para duas cores STED. Combinações de corantes mais usados geralmente incluem um excitável por 488 nm (como Alexa Fluor 488, Oregon Verde, DyLights verdes, ou Chromeo 488) e um excitável por 458 nm (como Pacific laranja ou Horizon V500). Assim, enquanto que a detecção dos dois corantes estará numa gama semelhante (e ambos são acessíveis pelo laser de exaustão), a excitação vai ocorrer com diferentes comprimentos de onda. Com um laser de luz ajustáveis e ajustáveis detectores de brancos, maximizando sinal, eliminando sobreposição espectral é feito bastante fácil. Como tal, temos tido um bom sucesso com combinatíons de corantes disponíveis comercialmente, como a Pacific Laranja e Alexa Fluor 488 (usado aqui). O protocolo é adaptado para e descreve a avaliação de células NK humanas, como que representa o foco histórico do nosso laboratório. Estamos a utilizar especificamente a linha de células NK92, neste exemplo, como é que um foi aplicado regularmente no nosso trabalho experimental 21,33.
Protocol
1. Lamelas Brasão com anticorpo
- Pré-aquecer (a 37 ° C) de 30 ml de RPMI 10% de meio FCS e 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm.
- Prepara-se uma solução de 5 ng / ml de anticorpo purificado em tampão fosfato salino (PBS). Para a activação da linha de células NK92, uso de anti-CD18 e anti-NKp30 é recomendada.
- Mark um círculo de aproximadamente centavo porte para cada condição em uma lamela # 1.5 usando uma caneta PAP. Para uma experiência de duas cores, deve haver quatro condições: sem mácula, dupla manchadas, e duas individuais condições manchadas. Dispensar a 200 ul de solução de anticorpo em cada região e incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Lavar as lamelas imergindo suavemente cada um em 50 ml de PBS num tubo de 50 ml à temperatura ambiente. Lavagem deve ocorrer imediatamente antes da adição de células deve ser tomado cuidado para evitar e secagem anticorpo na lamela.
2. Ativar as células NK em Tampadeslizamentos; Fix e permeabilizar
- Isolar 5 x 10 5 NK92 células por condição. Centrífuga e decantar o sobrenadante. Lavar uma vez com 10 ml de meio pré-aquecida do passo 1.1. Centrífuga e decantar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em meio de pré-aquecida do passo 1.1, a uma concentração de 2,5 x 10 6 / ml.
- Suavemente decantar 200 ul para o centro da região criada na secção 1.2.1. Incubar a 37 ° C durante 20 min a 5% de CO 2. (Nota: este tempo pode ser estendido ou reduzido, dependendo da função biológica de interesse para NK grânulo célula de polarização, 20 min é suficiente.).
- Após a incubação de células, lavar cuidadosamente lamelas imergindo cada em 50 ml de PBS à temperatura ambiente, em um tubo de 50 ml.
- Adicionar 1 ml de Triton X-100 a 1 ml de solução de pré-aquecida Fix / Perm do passo 1.1 e vórtice completamente. Fix e permeabilizar através da adição de 200 ul de tampão Fix / Perm (passo 2.3) para as células. Incubar por 10 mem no escuro à temperatura ambiente.
3. Células Stain
- Preparar tampão de coloração: Solução tampão de fosfato (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponina.
- Preparar uma solução de anticorpo primário em 200 ul tampão de coloração (veja o passo 3.1). (Nota: o anticorpo deve ser titulada antes de usar). Evite o uso de anticorpo primário que é gerado nas mesmas espécies utilizadas para revestir a lamela (passo 1.2). Além disso, evite ligações Strepatividin com biotina para STED imagem.
- Após a seção 2.3.1, lavar cuidadosamente lamelas em 50 ml de coloração buffer. Umedeça as bordas da região PAP-caneta com cotonete para remover o excesso de buffer. Aplicar a solução anticorpo criado na seção 3.1.1. Incubar 30 min no escuro à temperatura ambiente. (Recomendado: incubar lamelas na caixa de slides com uma toalha de papel úmido para manter a umidade).
- Preparar a solução de anticorpo secundário 200 ul coloraçãotampão. Fluoróforos recomendados são Alexa Fluor 488, Pacific Laranja, e V500. Geralmente, uma diluição 1:200 é adequado para STED imagiologia.
- Delicadamente, lave lamelas em 50 ml de coloração buffer. Umedeça as bordas da região PAP-caneta com cotonete para remover o excesso de buffer. Aplicar a solução de anticorpo secundário. Incubar 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Repita a lavagem e coloração para proteínas adicionais de interesse. Se a detecção de F-actina com faloidina, este pode ser incluído com o anticorpo secundário, em geral, a uma diluição de 1:200.
4. Monte Lamelas em Slides
- Prepare meio de montagem. Nota: Prolong ou prolongar Ouro são preferíveis. Vectashield deve ser evitada, uma vez que não é compatível com STED. 2,2-thiodioethanol deve ser evitada se for utilizado faloidina. Mowiol é aceitável.
- Coloque cerca de 10-20 mL de meio de montagem em um slide. Lamela Invert (célula de cabeça para baixo) e montar lamela suavemente, tomando cuidado paraevitar a introdução de bolhas de ar. Incubar as lâminas durante 24 horas (lamela up) antes da imagem.
- Selar bordas da lamela com unha polonês.
5. Instalação Experimental
- Iniciado lasers e software necessários. Iniciado STED a laser esgotamento a 100% de potência. Alinhar STED laser, que no caso de sistemas comerciais é geralmente um procedimento automatizado.
- Concentre-se a amostra, começando com controle manchado único, no microscópio usando oculares.
6. Otimização das configurações
- Faça a leitura do primeiro canal e otimizar a potência do laser, a posição de feixe de excitação e variedade detector. Se possível, evitar um ganho de> 100. Capturar a imagem em confocal para otimizar as configurações. Linha e / ou quadro de média irá aumentar a resolução. Verifique se há saturação pixel. Nota: Alguns saturação é aceitável em confocal como aplicação de STED irá reduzir a intensidade de emissão. Para STED, um tamanho ideal pixel será inferior a 30 nm comocada vez melhor resolução será obtida com tamanhos de pixel menores. O tamanho da região de interesse a ser trabalhada ditará o limite inferior do tamanho do pixel. Tamanhos de pixel menores podem aumentar a fotodegradação.
- Aplicar imagem de captura STED feixe de exaustão e, começando com 50% de esgotamento de energia laser. Se uma melhoria na resolução é visto, mais potência do laser depleção pode ser aplicado. Nesta fase, pode ser necessário ajustar a potência de excitação de laser, linha média, e / ou de ganho.
- Aplicar gating tempo para reduzir o fundo (no mínimo 0,3 ns). Ajuste as configurações até que uma melhoria na resolução sobre confocal pode ser visto. A resolução pode ser aproximada por estimativa completa metade de largura máxima (FWHM). Isto representa a distância na metade de máxima intensidade de um pico de Gauss criado pelo desenho de um perfil de linha ao longo da estrutura de interesse, e é um método amplamente utilizado para estimar resolução.
- Uma vez que o primeiro canal é satisfatória, iniciar uma segunda sequência para siciais de digitalização. Em geral, é melhor para digitalizar o fluoróforo de comprimento de onda mais longo em primeiro lugar. Repita o passo 6.1 em segundo canal.
- Confirme falta de sobreposição espectral pela imagem controles manchadas único com as duas seqüências de digitalização. Sobreposição espectral suave pode ser corrigido utilizando recursos de mixagem un espectrais no software, no entanto, deve ser evitado sempre que possível.
7. Aquisição de Imagem
- Adquirir imagens. No caso da imagiologia quantitativa, recomenda-se obter, pelo menos, 20 imagens / condição. O número exato, no entanto, deve ser definida de acordo com a questão experimental em conjunto com uma abordagem estatística, tais como o cálculo do tamanho da amostra. Salve experimento.
8. Deconvolution
- Abra o arquivo com o software de deconvolução ou processador de lote. Verifique os parâmetros de cada canal usando software. Confirme excitação e emissão espectros de cada canal, a emissão de esgotamento STED, e direção de imagemção (para cima ou para baixo, se a imagem é 3-dimensional), em particular.
- Deconvolve usando o assistente de deconvolução. As configurações padrão são geralmente adequada, no entanto relação sinal-ruído (SNTR) irá variar de fluoróforo para fluoróforo e terá de ser determinado para cada canal e cada experimento individualmente.
Representative Results
Claramente, o objetivo principal de super-resolução de imagem será uma melhoria em relação a microscopia confocal convencional. No entanto, existem algumas armadilhas comuns que podem levar à resolução de qualidade inferior. Estes exigem que cada experimento ser otimizados individualmente. Na nossa experiência representativa, estamos a imagiologia da rede de F-actina em células NK activadas por anticorpo ligado ao vidro. As causas mais comuns de (e correcções para) uma falta de resolução melhorada de STED sobre confocal são como se segue:
- Sub-amostragem (Figura 1a). Isto pode conduzir a granulação e a perda de informação de pixel, como demonstrado pela falta de resolução de filamentos F-actina. O aumento da linha média ou quadro muitas vezes pode corrigir isso.
- O branqueamento e / ou sobre-amostragem (Figura 1b). Isto pode ser causado por longo tempo de permanência de pixel, como uma consequência da linha média excessiva. Alternativamente, pode ser um resultado de um excesso de varrimento da imagem antes da aquisição, incluindo o uso excessivo deo laser de depleção. Isso geralmente resulta em imagens nebulosas ou difusos. Isso pode ser corrigido fazendo a varredura do campo de interesse apenas minimamente antes de adquirir ou, se possível, aumentando a velocidade de varredura a laser. Se o problema persistir, o poder do laser de depleção pode ser reduzido.
Ao atingir o equilíbrio correto de tempo de permanência de pixels, potência do laser de excitação, e potência do laser de depleção, uma imagem com melhor resolução e informações suficientes podem ser gerados (Figura 1c). A resolução pode ser ainda melhorada pela utilização de desconvolução (Figura 1d). Quando a aquisição é otimizado, desconvolução irá melhorar a resolução de forma qualitativa e quantitativa e sub-100 nm resolução deve ser rotineiramente atingível.
Figura 1. Otimização de aquisição e armadilhas comuns de imagem STED. NK92 células foram ativadas no anti-CD18 e-NKp30 vidro revestido por 20 min, em seguida, fixa, permeabilizadas e coradas para F-actina com Faloidina Alexa Fluor 488. A) Um exemplo de perda de informações de imagem devido a sub-amostragem. b) Um exemplo de perda de resolução devido ao branqueamento / sobre-amostragem c) as condições d optimized) condições otimizadas levam a maior melhoria na resolução com deconvolução. Barra de escala = 5 um.
Discussion
A melhoria na resolução sobre confocal estará um pouco dependente de factores que não podem ser controladas. Esses fatores incluem aberrações menores de espessura lamínula e inconsistências nos meios de montagem. É importante para manter a temperatura e umidade na sala de imagem o mais consistente possível, ea trave STED devem ser realinhados aproximadamente a cada 60 min. Como mencionado em procedimentos, uso de Vectashield meio de montagem deve ser evitado, pois isso não é compatível com STED. Além de que, deve-se sempre usar # 1.5 lamínulas, e se possível, use aqueles que foram verificados para uma espessura específica.
Uma modificação do método descrito aqui é a imagem canais adicionais na confocal, utilizando fluoróforos que emitem a um comprimento de onda maior do que o feixe STED. Desta forma, uma imagem pode até quatro canais (dois no confocal, dois em STED). Se esta abordagem, no entanto, os canais com fluoróforos emitting acima do laser de depleção STED terá de ser trabalhada primeiro, como a aplicação do feixe de STED irão esgotar fotões nestes canais. Uma vantagem desta técnica é a aplicação de gating tempo, o que também vai melhorar a resolução em confocal por eliminação de emissão de fotões com vidas curtas 34. Em particular, o uso de gating tempo, o momento de detectores de emissões para corresponder com excitação pulsada STED, vai diminuir a fluorescência de fundo da reflexão off vidro lamela quando imagiologia próximo a ele. Mesmo em um experimento não é adequado para STED, se estiver usando uma fonte de excitação pulsada, gating tempo pode ser uma ferramenta útil para melhorar a resolução em confocal.
Há diversas modificações que podem ser utilizadas para melhorar a resolução em STED. Uma é o de diminuir o tamanho do orifício da unidade 1 Airy padrão, embora este também irá diminuir a quantidade de luz que atinge a amostra. Isso pode ser compensado pelo aumento da laspoder er ou ganho. Outra é aumentar a média de linha, o que irá aumentar a quantidade de informação recolhida para cada fóton, melhorando a resolução. Mais uma vez, no entanto, isto pode ser a um custo de fotobranqueamento da amostra, para que um equilíbrio terá de ser atingido entre a resolução e de branqueamento. Da mesma forma, a utilização de proteínas fluorescentes como GFP exigirá optimização cuidadosa para evitar o branqueamento. Isto pode ser conseguido através da redução de potência do laser STED se necessário. Pontos de tempo mais longos, também permitirá uma maior recuperação de fótons e reduzir branqueamento. Correção para fotodegradação devem ser contabilizados na análise ao vivo STED.
Claro, a imagiologia em 3 dimensões num STED também é possível, e também vai dar uma melhoria em relação de imagem confocal convencional. Isto é particularmente verdadeiro se for feito em combinação com desconvolução, embora se deva tomar cuidado para corrigir o desvio que ocorre durante a imagiologia em múltiplos planos do eixo z. Se estiver usando software Huygenspara deconvolve, essa correção é obtida usando o recurso de "estabilizar imagem". Usando esta abordagem, a resolução do eixo z será melhorada. Esta é uma grande melhoria em relação imagem confocal convencional, que tem baixa resolução axial, e até mesmo em apenas STED si, que também tem relativamente baixa resolução eixo z. Ao adquirir várias pilhas em STED, cuidados devem ser tomados para evitar o branqueamento da amostra, e se necessário pode reduzir linha de média intensidade ou potência do laser, a fim de fazê-lo. Novamente, deve-se notar que se a imagiologia outros fluoróforos que não são adequados para STED, a aplicação do feixe de esgotamento na primeira exploração sequencial iria evitar a emissão de estes canais. Portanto, uma abordagem STED / confocal mista (quando se utiliza confocal em canais que emitem a um comprimento de onda superior a 592 nm) que, infelizmente, não ser adequado para 3D.
Para resumir, nós escolhemos STED como uma abordagem, devido à sua relativa facilidade de aplicaçãocação e melhoria na resolução sobre imagem confocal padrão. Para geração de imagens da sinapse imunológica, que tem provado uma técnica eficaz e valiosa que nos permite ver detalhes na arquitetura, não é possível F-actina em resolução superior a 200 nm. Enquanto muitos destes detalhes parecem subtil, que pode ter um efeito profundo sobre a função das células NK. Assim, estamos aplicando a mais recente tecnologia de imagem nanoscopic para derivar a informação que é fundamental para a manutenção da saúde humana.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Custo publicação parcial deste artigo foi custeada pela Leica Microsystems, Inc.
Acknowledgments
Agradecemos Geoff Daniels para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por R01 AI067946 para JSO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 cover slips | VWR | 48393-172 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554722 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Cotton tipped applicator | Fisher Scientific | S450941 | |
| Falcon centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 352070 | |
| Fetal calf serum (FCS) (500 ml) | Atlantic Biologicals | S11050 | |
| Goat anti-rabbit Pacific Orange | Life Technologies | P31584 | |
| Laboratory tissue wipers | VWR | 82003-820 | |
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| NK-92 cells | ATCC | CRL-2407 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A12379 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14190250 | |
| Prolong anti-fade reagent | Life Technologies | P7481 | |
| Purified anti-CD18 | Biolegend | 301202 | |
| Purified anti-NKp30 | Biolegend | 325202 | |
| Purified anti-perforin | Biolegend | 308102 | |
| RPMI 1640 medium (500 ml) | Life Technologies | 11875-093 | |
| Saponin from Quillaja bark | Sigma | S4521 | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 008899 | |
| Triton X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22142 | |
| Huygens deconvolution software | SVI | Contact company | |
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica Microsystems | contact company |
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