Summary
Le transistor électrochimique organique est intégré avec des cellules vivantes et utilisé pour contrôler le flux d'ions à travers la barrière épithéliale gastro-intestinal. Dans cette étude, une augmentation du flux d'ions, lié à la perturbation des jonctions serrées, induite par la présence du chélateur de calcium EGTA (ethylene glycol-bis (éther bêta-amino-éthyl)-N, N, N ', acétique N'-tétra acide), est mesurée.
Abstract
Le tractus gastro-intestinal est un exemple de tissu de la barrière qui constitue une barrière physique contre l'entrée d'agents pathogènes et les toxines, tout en permettant le passage des ions et des molécules nécessaires. Une rupture de cette barrière peut être provoquée par une réduction de la concentration de calcium extracellulaire. Cette réduction de la concentration en calcium provoque un changement conformationnel dans les protéines impliquées dans la fermeture de la barrière, ce qui conduit à une augmentation du flux paracellulaire. Pour imiter cet effet, les chélateurs de calcium éthylène glycol-bis (éther bêta-amino-éthyl)-N, N, N ', N'-acide acétique tétra (EGTA) ont été utilisées sur une monocouche de cellules connues pour être représentatif de l'appareil gastro-intestinal. Différentes méthodes pour détecter la rupture de la barrière de tissu existent déjà, par exemple par immunofluorescence et les dosages perméabilité. Cependant, ces méthodes sont longues et coûteuses et ne conviennent pas à des mesures dynamiques ou à haut débit. Méthodes électroniques pour mesurer le tissu barrièreintégrité existent également pour la mesure de la résistance transepitheliale (TER), mais ceux-ci sont souvent coûteux et complexe. Le développement de méthodes rapides, bon marché, et sensibles est urgent que l'intégrité du tissu de la barrière est un paramètre clé dans la découverte de médicaments et le diagnostic des agents pathogènes / toxines. Le transistor électrochimique organique (OECT) intégré avec le tissu barrière formant des cellules a été présentée comme un nouvel appareil capable de contrôler dynamiquement l'intégrité des tissus de barrière. L'appareil est capable de mesurer les variations minute à flux ionique avec une résolution temporelle sans précédent et sensibilité, en temps réel, comme un indicateur de l'intégrité du tissu de la barrière. Cette nouvelle méthode est basée sur un dispositif simple qui peut être compatible avec les applications de criblage à haut débit et fabriqué à faible coût.
Introduction
L'épithélium gastro-intestinal est un exemple de tissu de la barrière, qui commande le passage de molécules entre les différents compartiments du corps. L'épithélium est constitué de cellules cylindriques allongées reliées entre elles par des complexes de protéines qui fournissent une barrière physique 1 contre les agents pathogènes et les toxines, tout en permettant le passage de l'eau et les éléments nutritifs nécessaires au maintien de l'organisme. Cette sélectivité est due à la polarisation des cellules epitheliales, ce qui crée deux domaines membranaires différentes: le côté apical des cellules exposées à la lumière et à la face basale des cellules ancrées sur les tissus sous-jacents 2,3. Les jonctions serrées (TJ) sont complexes de protéines présentes à la partie apicale des cellules épithéliales et font partie d'un grand complexe connu sous le nom de la jonction apicale 4. Flux d'ions à travers le tissu de la barrière peut soit passer par le transcellulaire (à travers la cellule) ou via un paracellulaire (entre deux cellules adjacentes) voie. La somme dele transport à travers les deux voies est connu que la résistance trans-épithéliale. La jonction apicale est responsable de la réglementation des ions et des molécules passant à travers la barrière de 5,6 par une ouverture spécifique et la fonction de fermeture. Un dysfonctionnement ou de perturbation de ces complexes protéiques est souvent liée à la maladie 7-11. En outre, de nombreux agents pathogènes entériques / toxines sont connues pour cibler spécifiquement ce complexe, entrant ainsi dans le corps et menant à la diarrhée, très probablement en raison de dérégulation massive des flux d'ions / de l'eau à travers la barrière 12 à 14. Barrière de tissu peut également être modifié en changeant le micro-environnement extracellulaire. Cadhérine est une protéine essentielle pour l'adhésion cellule-cellule, et est impliqué dans la formation de la jonction apical. Le calcium est nécessaire pour la conformation structurelle correcte de la cadhérine, et une diminution du calcium extracellulaire a été montré pour entraîner la destruction de la jonction cellule-cellule et une ouverture ultérieure de l'voie paracellulaire entre les cellules 15. Dans cette étude, l'EGTA (éthylèneglycol-bis (bêta-aminoéthyl éther)-N, N, N ', acide acétique N'-tétra), un agent de chélation du calcium spécifique, a été utilisé pour induire une rupture dans le tissu de la barrière, comme il l'a été montré pour avoir un effet rapide et drastique sur paracellulaire flux d'ions 16,17. Cet agent de chélation du calcium a été utilisé sur une monocouche confluente et différenciée de la lignée cellulaire Caco-2. En culture dans des inserts de culture de cellules, cette lignée cellulaire est connue pour développer les caractéristiques de l'appareil gastro-intestinal et est largement utilisé par l'industrie pharmaceutique pour tester l'absorption de médicaments 18,19.
Méthodes pour surveiller l'intégrité des tissus de barrière sont nombreux. Ces procédés sont souvent optique, en s'appuyant sur la coloration par immunofluorescence des protéines particulières connues pour être à la jonction 20 apical, ou s'appuyant sur la quantification d'une molécule de traceur fluorescent qui est normalement imperméable au tissu de la barrière21,22. Cependant, les méthodes sans étiquette (c'est à dire sans un fluorophore / chromophore) sont préférables car l'utilisation d'une étiquette peut entraîner des artefacts, et augmente souvent le coût et le temps de dosage. Électrique, la surveillance sans étiquette de tissu de la barrière a récemment émergé comme une méthode de suivi dynamique 23. Par exemple, les progrès technologiques récents dans la spectroscopie d'impédance électrique ont permis le développement d'un appareil de balayage disponible dans le commerce qui peuvent 24,25 mesurer la résistance transepitheliale (TER), une mesure de la conductance des ions à travers la couche de cellules.
L'électronique organique a créé une occasion unique de relier le monde de l'électronique et de la biologie 26,27 28,29 en utilisant des polymères conducteurs qui peuvent conduire les deux supports électroniques et ioniques. Une nouvelle technique pour détecter les infractions dans le tissu de la barrière en utilisant l'OECT 30-32 a été récemment introduit. Ce dispositif a été validé contre nous techniques existantesed pour évaluer l'intégrité de la barrière de tissu, y compris immunofluorescence, des dosages de perméabilité à l'aide de Lucifer jaune, et la spectroscopie d'impédance selon la Cellzscope. Dans le cas de tous les composés testés toxiques, la OECT a été trouvé pour fonctionner avec une sensibilité équivalente ou supérieure, et avec une résolution temporelle augmentée, par rapport aux techniques ci-dessus. Dans ce dispositif, PEDOT: PSS, un polymère conducteur qui a été montré pour être stable et biocompatible 33,34, est utilisé comme matériau actif dans le canal du transistor. L'OECT est composé d'électrodes de drain et de source de chaque côté d'un canal de polymère conducteur. Il est ensuite mis en contact avec un électrolyte, qui fait partie intégrante du dispositif. Une électrode de grille est immergée dans l'électrolyte (Figure 1), et quand une tension de grille positive est appliquée à la porte, les cations de l'électrolyte est forcé dans le canal, dédoper ainsi le polymère conducteur et résultant en un changement de la source-drain courant. Le dériphérique est donc très sensible aux variations de flux ionique minutes en raison de l'amplification par le transistor. Une couche de cellules cultivées sur un insert de culture de cellules a été placée entre l'électrode de grille et le canal de polymère conducteur. La présence d'une couche de cellules intactes agit en tant que barrière pour les cations entrant dans le polymère conducteur, par conséquent, en présence d'une monocouche intacte, le courant diminue d'évacuation (Figure 2: une région de transition de b). En présence d'un composé toxique, le tissu de la barrière va perdre progressivement son intégrité, laissant les cations entrent dans le film de polymère et d'augmenter le courant de drain (Figure 2: région c). Avec cette technique, la brèche dans le tissu de la barrière est vu par la modulation du courant de drain, correspondant à la modulation du flux à travers la monocouche. Cet appareil est capable de mesurer les infimes variations de flux ionique avec une résolution temporelle sans précédent et la sensibilité en temps réel. Cette wil de technologiel être d'intérêt dans le domaine de la toxicologie pour les essais de médicaments, le diagnostic de la maladie ou de la recherche de base comme le modèle de barrière peut être facilement adapté. Cette méthode permettra également de réduire l'expérimentation animale, car il permet la validation des modèles in vitro pour remplacer dans les essais in vivo.
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Protocol
Une. PEDOT: PSS Préparation de la solution
- Pour 50 ml de PEDOT: PSS, ajouter de l'éthylène glycol (augmente la conductivité) dans un rapport en volume de 1:4 (éthylène glycol à PEDOT: PSS), 0,5 ul / ml d'acide dodécylbenzènesulfonique (DBSA) comme agent tensio-actif, et de 10 mg / ml 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane (GOPS) comme un agent de réticulation pour favoriser l'adhérence du polymère conducteur à la lame de verre.
2. Fabrication OECT (Figure 3)
- Définir contacts source et drain thermique or évaporés par lift-off lithographie:
- Spin manteau résine photosensible sur une lame de verre propre normal à 3000 tours par minute pendant 30 secondes. Dimensions de verre sont 3 dans x 1 po
- Définir des motifs par photolithographie. Les dimensions peuvent être modifiées, mais les dimensions indiquées ici ont été présentés à conduire à la sensibilité optimale. Ensuite, utilisez un développeur.
- On évapore 5 nm et 100 nm de chrome et d'or, respectivement.
- Lift-off de la résine photosensible dans un acbain d'acétone pendant 1 heure, en laissant le substrat avec la source et le drain Au zone de contacts uniquement.
- La longueur désirée de la PEDOT: PSS canal est de 1 mm. Ce résultat est obtenu en formant un motif en utilisant un parylène-C (Pa-C) technique pelable:
- Chargez 3,5 g de Pa-C dans la configuration de revêtement. Uniformément évaporer 2 um de parylène-C sur le dessus du substrat avec Au-contacts.
- Motif du canal par photolithographie:
- Spin manteau résine photosensible à 3000 rpm pendant 30 secondes.
- Utilisez un masque pour éclairer canal et le contact d'or de 20 secondes aux UV, la résine photosensible exposée sera soluble dans le révélateur.
- Utilisez développeur pour ouvrir la zone de canal sur la résine photosensible.
- Graver le Pa-C dans la zone de canal par une étape de 15 min plasma (O 2 (50 sccm) et CHF 4 (3 sccm) de plasma à 160 W), afin d'ouvrir le canal et le contact de l'or.
- Déposer le PEDOT: PSS solution de mélange par spin coating à500 tours par minute pendant 45 sec. Cuire au four pendant 30 secondes à 110 ° C.
- Peel-off de la Pa-C pour révéler le PEDOT: PSS canal du substrat en dessous. Cette chaîne devrait légèrement se chevaucher avec les contacts établis Au protocole n ° 1.
- Échantillons Cuire pendant 1 heure à 140 ° C dans des conditions atmosphériques.
3. Assemblée de l'appareil
- Faire PDMS par mélange de deux solutions (généralement fournis ensemble dans un kit) en un rapport de 1:10 de solution dans une solution de base et le durcissement. Cuire pendant 1 heure à 120 ° C.
- Concevoir et en utilisant une perforatrice et découper un carré autour de la zone souhaitée.
- Coller un PDMS bien au-dessus du canal, pour aboutir à une zone de canal d'environ 6 mm 2. Veiller à ce que les contacts de source et de drain sont pas couverts.
- Assurez un support en plastique avec un trou dedans (vous pouvez utiliser le support de l'insert de culture cellulaire), puis le coller sur le dessus du PDMS. Laissez sécher pendant la nuit.
- Testez le bien de la fuite par le pré-remplissage avec water.
- Souder les fils électriques sur le contact de source et le drain avec de l'étain.
4. Culture cellulaire
- Préparer un milieu de culture cellulaire de la façon suivante:
- Dans du DMEM, ajouter 1% de glutamine, 10% de sérum bovin fœtal, 0,5% de pénicilline-streptomycine, et 0,1% de gentamicine.
- Stériliser les milieux de culture de cellules en utilisant un dispositif de filtration stérile.
- Maintenir les cellules Caco-2 entre le passage 49 et 68 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2, dans des milieux de culture cellulaire.
- Diviser les cellules une fois par semaine à l'aide de la trypsine et de semences à 1,5 x 10 4 cellules / insert.
- Changer milieux de culture cellulaire deux fois par semaine pendant 3 semaines.
5. Mesures avec OECT
- Connecter un fil d'Ag / AgCl pour un SourceMeter pour l'utilisation comme électrode de grille. Immerger l'embout dans des milieux de culture cellulaire, qui est utilisé comme l'électrolyte, comme illustré sur la figure 1a.
- Raccorder les fils de la source et le drain à til SourceMeter (configuration double canal).
- Appliquer une impulsion tension positive carré (V GS) entre la grille et la source (utilisé comme électrode de référence: sol). Une tension négative constante entre le drain et la source (V DS) est appliquée et du courant correspondant (I DS) est mesurée.
- Utilisez une collecte de données de programme en cours de l'ordinateur. Paramètres OECT inscrits dans un programme d'acquisition sur mesure devraient être comme suit: V DS = -0,2 V, V GS = 0,3 V, V GS à temps = 2 secondes, hors temps = 28 sec.
- Lisez courant source-drain (I DS) et le courant de grille (I GS). Réaliser la mesure pendant plusieurs minutes pour assurer un signal de ligne de base stable.
6. L'intégration des cellules avec OECT pour la mesure
Remarque: Avant l'expérience, l'intégrité de la couche de cellules peut être vérifiée par la mesure de TER avec un dispositif de spectroscopie d'impédance. TER de chaque ancienne 3 semaines cellulaire Caco-2 insécuritért devrait être au-dessus de 400 Ω. cm 2.
- En dehors du temps de mesure OECT: Retirer l'électrode de grille de l'électrolyte, incorporer l'insert de culture cellulaire, et remplacer l'électrode de grille à l'intérieur de l'insert de culture cellulaire.
- Effectuer une mesure de référence avec les cellules pendant plusieurs minutes pour assurer un signal stable. Cette référence sera utilisée que pour le calcul de la valeur normalisée correspondant à une monocouche intacte (0).
7. Préparation et introduction du composé toxique
- Préparer une solution à 1 M d'EGTA dans de l'eau DI, en ajustant d'abord le pH de la solution à 7,4 avec du Tris base.
- Ajouter la solution d'EGTA dans le volume approprié pour obtenir la concentration désirée (par exemple entre 5 mM et 100 mM) en tenant compte du volume. L'EGTA doit être ajouté dans la chambre de base pendant le temps d'arrêt.
- Mesurer en continu pendant 90 min comme dans le protocole 5. Si la mesure est being effectuée à la température ambiante, la stabilité des cellules ne reste pas constant après 90 min.
- A la fin de la course, gratter la couche de cellules d'entraîner une destruction complète de la couche barrière et la mesure de 15 min, ce point peut être fait en retirant le filtre et l'immersion de l'électrode de grille dans le support. Cette référence sera utilisée que pour le calcul de la valeur normalisée correspondant à une monocouche détruit.
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Representative Results
Au cours de la première étape de mesure, le courant de drain peut varier quelque peu, mais dans la plupart des cas, il doit rester stable (figure 2, partie a). Si le signal n'est pas stable, le transistor doit être jeté et remplacé. Ce contrôle de stabilité assure également que les pertes initiales de la conductivité du dispositif n'affectent pas la mesure suivante. Après plusieurs minutes de mesure, l'insert avec des cellules formant un tissu formant barrière est placée sur le dessus du canal. Le courant de drain doit immédiatement diminuer (figure 2, section b.). Si le courant de drain ne diminue pas, cela pourrait impliquer que les cellules ne sont pas correctement formé une barrière, ou ont été endommagés lors de la manipulation, et le filtre doivent être jetés et remplacés. En ajoutant un composé toxique pour le tissu de la barrière, la modulation du courant de drain doit augmenter progressivement ou immédiatement, en fonction du composé utilisé et de la concentration (figure 2,section c.).
Les données ont été recueillies à l'aide d'un SourceMeter et un programme d'acquisition personnalisés. A partir de ce programme des paramètres différents ont été obtenus, qui sont exécutés dans un programme d'analyse de données pour obtenir le milieu de modulation correspondant à chaque impulsion de déclenchement. Le milieu de modulation correspond à la valeur du courant au milieu du sommet (figure 4). Les valeurs milieu de modulation obtenus lors de la détection d'une monocouche intacte ont été normalisées à 0 tandis que le milieu de modulation obtenu après le scratch ont été normalisés à 1. Résultats normalisés sont utilisés pour comparer les données provenant de différents dispositifs (figure 5). De ces données, la réponse à la dose des concentrations de différence de composé toxique au cours du temps peut être vu.
Figure 1. Schéma d'un électrochimique Transistor organique intégré avec insert de culture cellulaire a) à partir d'une vue de côté. B) Vue de dessus de la voie (gris) et le contact (jaune) dimensions sur une lame de verre d'une longueur de canal de 6 mm et une largeur de canal de 1 mm . Ce chiffre a été modifié depuis Jimison 30.
.. Figure 2 Vue d'ensemble de la mesure in situ de la fuite réponse actuelle à porte carrés impulsions dans le temps les conditions de mesure sont les suivantes: V DS = -0,2 V, V GS = 0,3 V, V GS à temps = 2 secondes, hors temps = 28 sec. A) Correspond à l'OECT exploité avant l'intégration avec les cellules, assurant la stabilité de l'appareil. B) correspond à l'intégritération du tissu de la barrière formant des cellules, assurant à nouveau un signal stable avant de commencer l'essai du composé toxique. c) correspond à l'addition d'EGTA pour les cellules du tissu de la barrière, noter l'évolution du signal dans le temps.
Figure 3. Des processus de fabrication de l'OECT. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. OECT drainer réponse actuelle à une seule impulsion de grille carrée. Mesurer ment les conditions sont les suivantes: V DS = -0,2 V, V GS = 0,3 V, V GS sur le temps = 2 secondes, hors temps = cellules 28 sec. Une) réponse transitoire OECT avant (ligne en pointillés) et après (ligne bleue) l'ajout de tissu formant barrière cultivées sur un filtre. b) OECT réponse transitoire après l'addition du composé toxique sur un tissu de la barrière (ligne orange) et sans tissu de la barrière (ligne en pointillés).
Figure 5. Résultat typique normalisé De l'OECT. L'réponse normalisée de l'OECT sur l'introduction du dispositif (cercle vide), couche de cellules (croix noire), 5 mM EGTA (cercle bleu foncé) et 10 mM d'EGTA (cercle cyan) a présenté à t = 0, on a mesuré sur une période de 50 min.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Cette technique fournit une nouvelle méthode pour intégrer un transistor électrochimique organique avec des cellules vivantes pour mesurer l'intégrité des tissus de barrière. Les principaux avantages de cette technique sont la rapidité et la sensibilité, mais également le faible coût du dispositif de contrôle dynamique d'un tissu de la barrière.
Comme cette méthode utilise des cellules vivantes, un point critique est d'être sûr d'utiliser une monocouche, ce qui représente une couche barrière intacte. Les paramètres de la barrière doivent être définis au cours de la caractérisation de la lignée cellulaire. Il est donc crucial de ne pas endommager la couche de cellules lors de l'électrode de grille est immergée dans l'électrolyte au-dessus de la couche de cellules.
Un autre point important est la fabrication de l'appareil, aucune fuite ne doit se produire entre le bord du PDMS et le support en plastique pour éviter la variation de volume de liquide. Afin d'obtenir des résultats reproductibles, il convient également donnée à la soudure du fil, en tant quela gravure de l'électrode d'or va entraîner une mauvaise / pas de contact avec la chaîne de polymère conducteur et si pauvre / absence de signal.
Pour faciliter l'analyse et à obtenir de meilleurs résultats quelques minutes de délai entre chaque étape de l'expérience devrait être autorisé pour le dispositif se stabilise entre les étapes. En tant que variation du signal à partir du dispositif de périphérique est observée, la normalisation des résultats est nécessaire pour être en mesure de comparer les résultats de chaque expérience. Cependant, à l'avenir la production à plus grande échelle du dispositif permettra une plus grande reproductibilité dispositif périphérique.
La principale limitation de la technique est le format, comme pour le moment qu'un seul échantillon peut être mesurée. Ce sera bientôt résolu par la mise au point d'un capteur de multiacquisition et dans l'avenir de la création d'un format de plaque à 96 puits. Cela va ouvrir la voie à cette technique pour une utilisation dans le criblage à haut débit de tissu de la barrière. En parallèle, des dispositifs planaires sont également en cours de développement to permettre des mesures optiques et électroniques simultanées.
En résumé, un nouveau dispositif qui peut être fabriquée à faible coût qui est capable de surveiller sans marquage de tissu de la barrière a été développé. Ce dispositif montre une plus grande sensibilité et une résolution temporelle plus élevée que les méthodes existantes. L'intégration de modèles in vitro avec des dispositifs tels que l'OECT peut être une excellente alternative à l'expérimentation animale pour découvrir la drogue et de la toxicologie.
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Disclosures
Ce projet est soutenu par FP7-People-2009-RG, projet Marie Curie n ° 256367 (CELLTOX) et la proposition du Conseil européen de la recherche ERC-2010-StG Non 258966 (IONOSENSE), ainsi que d'une subvention conjointe du Conseil régional de Provence-Alpes-Côte d'Azur et CDL Pharma pour ST. Nous remercions George Malliaras pour des discussions utiles relatives à la conception et la fonction OECT.
Acknowledgments
Les auteurs de ce document ne sont pas des intérêts financiers concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clevios pH 1000 | Heraus Clevios | ||
| AZ9260 resin | Cipec Specialties | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique Dutscher | 51705 | |
| 24-well Cell culture plate BD Falcon | Dominique Dutscher | 51705 | |
| Stericup-GPT PES 0.22 μM | Dominique Dutscher | 51246 | |
| Advanced DMEM Marque GIBCO | Fisher Scientific | E3434T | |
| FBS Heat Inact. | Fisher Scientific | E3387M | |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | E3470C | |
| GlutaMAX | Fisher Scientific | E3524T | |
| Trypsin 0.05% EDTA | Fisher Scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%, | Sigma Aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | Harvard Apparatus | ||
| Photoresist | Cipec Specialties |
References
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