Summary
治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。
Abstract
癒すために傷ついた細胞の能力は、基本的な細胞プロセスですが、治癒損傷細胞に関与する細胞および分子メカニズムはほとんどわかっていない。ここでアッセイは、局所的な損傷後の培養細胞の治癒能力および速度を監視するために記載されている。第一のプロトコルは、同時に数百の細胞の細胞膜修復能を評価するためのエンドポイントベースの手法を記載している。第二のプロトコルは、パルスレーザによる局所的な損傷後の個々の細胞における細胞膜修復の動態をモニターするリアルタイム画像化のアプローチを記載する。治癒負傷した細胞が損傷部位に特異的なタンパク質と細胞内コンパートメントの輸送を伴うように、第3のプロトコルが同時に負傷した細胞の何百ものそのような人身売買のイベント（リソソームエキソサイトーシス）を評価するには、上記のエンドポイントベースのアプローチを使用し、最後のプロトコルについて説明TIRFのミクロスと共にパルスレーザー傷害の使用を記載高い空間分解能と時間分解能で負傷した細胞では、個々の細胞内コンパートメントのダイナミクスを監視するためのコピー。ここプロトコルは、培養筋細胞における細胞膜の修復およびリソソームのエキソサイトーシスの間のリンクを調べるため、これらのアプローチの使用を記載しているが、それらは、他の接着性の培養細胞と、選択した細胞内コンパートメントにそのまま適用することができる。
Introduction
細胞膜は、細胞と細胞外環境との間の障壁を提供することで、細胞の完全性を維持します。正常な生理的しきい値だけでなく、侵入する病原体の存在を超えて、化学的、電気的、または機械的刺激は、細胞膜への傷害におけるそれぞれの結果とは、この傷害を修復するために、その後の細胞応答を誘発することができます。細胞膜へのこれらの損傷に耐えるために、細胞を修復するための効率的なメカニズムを有する。このメカニズムは、カルシウム依存性であり、他の中のようなアネキシンやMG53のようなタンパク質の細胞内輸送だけでなく、このような怪我を細胞膜1-7エンドソーム、リソソーム、ゴルジ派生小胞やミトコンドリアなどの細胞内区画を必要とする。しかし、損傷した細胞膜の修復に関与する分子および細胞内イベントのシーケンスの詳細はよくわかっていないままです。
細胞の修復応答は、耳の中に分離され得るLY及び後期応答。分の時間スケールに数秒以内に起こる初期の応答は、成功した細胞修復または細胞死に至る後期応答の性質を決定するのに途方もなく重要である。バルク生化学的および細胞分析に基づいて、エンドポイントアッセイは、修理中の分子や細胞プロセスの関与を確立に貢献している。しかし、原因細胞修復応答の不均一性及び迅速性のために、エンドポイントアッセイは、修理に至る一連の事象の運動および空間の詳細を提供することができない。細胞膜の制御された傷害を有効にして、細胞膜の修復と高い空間分解能と時間分解能で、関連する細胞内応答を監視できるようなアプローチは、理想的には、そのような研究に適しています。ここで、そのようなアプローチが提示されている。プロトコルの二つは、細胞膜修復のリアルタイム動態およびレーザinjの次の生細胞における修復過程に関連付けられている細胞内応答をモニターするためのアプローチを記載ユリィ。これらの生細胞イメージングに基づくアッセイを補完するものとして、エンドポイントアッセイはまた、個々の細胞および関連する細胞内応答のモニタリング修復のための集団ベースの測定を提供するが記載されている。これらのアプローチは、細胞膜の損傷に応答して輸送およびリソソームのエキソサイトーシスをモニターするために使用されているそれらの有用性を実証する。
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Protocol
1。バルクを用いた撮像細胞膜修復（ガラスビーズ）創傷は
このプロトコルは、別々に負傷した細胞や治癒できないものをマークすることができます。 1：細胞のこれらの集団を定量化するには、次の3つの条件を使用する必要があります。試験（C1） -細胞のCa 2 +、2の存在下で修復させる。対照1（無損傷C2） -細胞のCa 2 +の存在下でインキュベートしたが、負傷していない、および3ている。コントロール2（なし修復C3） -細胞をCa 2 +の非存在下で修復することが許可されます。
- 3無菌カバーガラス上で> 50％コンフルエンスまで細胞を成長させ、シリコンO-リング上で37℃、転送カバーグラスPBSで37℃、およびC3で、CIMで二度C1とC2を洗う。
- C1とC2またはC3の上のPBS中のCIMにおける予め温めFITCデキストラン溶液100μlを加える。
- 手動でバックカバースリップを傾けることによって穏やかに室温で、カバースリップ上に40mgのガラスビーズをロールC1およびC3上の形質膜を傷つけると30°の角度で前後6-8回。
注意：軽度の負傷のために、このように繰り返しの傷害を最小限に抑え、ガラスビーズが均一に分散していることを確認してください。サンプル間の損傷の再現性を向上させるために、同時に比較すべき異なるサンプルのガラスビーズ傷害を行う。 - ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO 2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。
- ビーズが転動させることなく、37℃でCIM（C1及びC2）又はPBS（C3）で洗浄することによりガラスビーズおよびFITCデキストランを除去する
- 場所は、Oリングに戻ってカバースリップ、c3のC1とC2またはPBS中、CIM内の予め温めリジン固定可能TRITCデキストラン溶液100μlを加える。
- 周囲CO 2で5分間37℃でインキュベートする。
- あらかじめ温めておいたCIMで二度カバースリップを洗浄し、室温で10分間、4％PFAで固定します。
- PBSで2回洗浄し、ヘキスト染料での室温で2分間インキュベートする。
- ウォッシュSAMPLエス回PBSで、落射蛍光顕微鏡を用いて実装培地および画像セルを用いてスライド上にマウントする。
- 背景の赤と緑の染色強度を決定し、全ての試料（C1-C3）用の閾値赤と緑のチャンネルにこの値を使用するC2由来の細胞を使用する。
- A）グリーン（負傷し、修復さ）とb）の赤または赤と緑（負傷者の両方が、が、C1とC3のサンプルで）修復に失敗している細胞の総数を獲得。
- カウント> 100緑の各条件や負傷者のすべてのセル（緑と赤）のパーセントとして、修復に失敗した細胞の割合を発現している細胞。
2。レーザー損傷後の細胞膜修復の動態のライブイメージング
- あらかじめ温めておいCIMで細胞を洗浄した後、FM色素で、CIMにカバースリップを置く。
- 37℃に維持し、ステージトップインキュベーターでホルダーにカバースリップを配置
- 細胞膜1-2 mm 2の地域を選択し、のために照射<;パルスレーザーで10ミリ秒。ピーク電力の40〜50％のソフトウェアを介してレーザパワーを減衰させる。最適な電力は、一貫性のことができますが、非致死傷害、これが使用されている個々の楽器や細胞株について、試行錯誤によって決定されなければならない。
- 損傷前に開始し、エピ蛍光と明視野での修理、画像ごとに10秒を監視し、損傷後3〜5分間続行します。
注意：修理の制御のために、リピートをPBSで負傷した細胞は、FM色素を含有して2.1から2.4を繰り返します。 - 修復の動態を定量するために、セルラFM色素の蛍光を測定し、画像化の過程強度（ΔF/F0）の変化をプロットする。このデータは、各条件で10年以上の細胞について平均し、必要に応じて、平均化したり、個々のセルの値としてプロットされるべきである。
3。イメージング·バルク（ガラスビーズ）傷害誘導リソソームエキソサイトーシス
サンプルは、> 50％まで成長し、次の細胞が含まれる合流点：1。試験（C1） -のCa 2 +、2の存在下で修復させた細胞。対照1（C2、ノー損傷） - 細胞怪我もなく、一次抗体とインキュベートし、そして3もない。コントロール2（C;なし修復） - Ca 2 +の非存在下で修復することができた細胞。
- 洗浄は37℃でPBSを用いて37℃およびC3でCIMで二回C1及びC2をカバースリップシリコーンO-リング上に転送する。
- C3の上でC1とC2上のCIMにおける予め温めリジン固定可能TRITCデキストランのPBS中に100μlを加える。
- ステップ1.3のようにC1とC3に、細胞膜を傷つける。
- ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO 2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。
- 再び細胞にガラスビーズのないローリングを確保していない、冷たい増殖培地中でカバーグラスを洗浄することにより、ガラスビーズおよびTRITCデキストランを削除します。
- 冷たい成長培地で2回カバースリップをすすぎ、Oリングに転送します。
- C1およびC3へコールド完全増殖培地中のラット抗マウスLAMP1抗体を100μlを加え、C2に寒さ、完全な増殖培地を追加します。
- 抗体は4℃で30分間インキュベートしたカバーガラスを結合できるようにするには
- 冷たいCIMでカバーグラスを3回洗浄し、室温で10分間、4％PFAですべてカバースリップを修正して、CIMで3回すすいでください。
- RTで15分間溶液を遮断する100μlのすべてカバースリップをインキュベートする
- 4℃でアレクサフルーア100μlの15分間488抗ラット抗体をすべてカバースリップをインキュベート
- PBSで2回洗浄し、ヘキストでの室温で2分間インキュベートする。
- PBSで2回細胞を洗浄、エピ蛍光顕微鏡を用いた実装メディアやイメージを使用して、スライド上にマウントします。
- C2細胞の画像を用いて、赤色（TRITCデキストラン）で非特異的バックグラウンド染色を決定し、緑（アレクサフルーア488抗体）チャネルおよびスレッシュホールドに全てのサンプル（C1-C3）用の赤と緑のチャネルを、これらのバックグラウンド染色値を使用する。</李>
- 負傷した細胞中のLAMP1染色（緑）の強度を測定するために、C1とC3から> 100赤の標識された細胞を使用してください。成功した実験にはC3のセル内のランプ1染色はC1からの細胞よりも有意に低くなります。
4。細胞膜損傷のライブイメージングは、細胞内の人身売買をトリガ
- 蛍光標識 （リソソーム8用など CD63-GFP）または蛍光色素9を使用して、適切なレポーターをトランスフェクトすることにより、目的のコンパートメント。
- 蛍光色素で標識リソソームについては、FITC-デキストランを含有する増殖培地中で50％コンフルエンスまで増殖させた細胞をインキュベート
- CO 2インキュベーター中（目的の細胞株によるデキストランとの十分なエンドソーム標識に必要な以上）デキストランは2時間エンドサイトーシスすることができます。
- 許可するように温めておいた増殖培地で細胞を洗浄して、CO 2インキュベーター内で2時間、その中に培養するすべてのリソソームに蓄積したデキストランをエンドサイトーシス。
- イメージングの前に、予め温め、CIM内のカバーガラスを洗浄し、37℃で、ステージトップインキュベーターにカバースリップホルダーに取り付ける
- （細胞全体に動きのため）広視野またはTIRF（細胞表面およびエキソサイトーシスでの移動）イメージングを実施 - FITCデキストランラベルリソソームが混雑していない細胞は、個々のリソソームの動きとエキソサイトーシスを画像化するために理想的です。
- イメージング顕微鏡用TIRFレーザーを揃える：使用60Xまたは> 1.45 NAの100X目標を。メーカーのアプローチを用いて入射全反射レーザー光に対する角度を設定します。
- 40〜50％の減衰でパルスレーザで、<100ミリ秒のための小さい（1-2 mm 2）で領域を照射することにより、細胞膜を傷つける。
- 目的の細胞におけるエキソサイトーシスの動態に応じて、少なくとも2分以上4-6フレーム/秒で負傷、画像セルをセルにリソソームの応答をモニターする。
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Representative Results
単一細胞イメージングのためにここで説明するプロトコルは、細胞膜修復（プロトコール1及び2）、修復中のリソソームの細胞内輸送および融合（プロトコル3および4）の能力および速度を監視することである。
プロトコル1は、すべての傷ついた細胞をマークし、修復に失敗したものが負傷細胞を同定することができますバルクアッセイを示す。無傷細胞（ 図1A）は、非標識のままで、図1で示す結果は、FITCデキストランの存在下でガラスビーズにより損傷した細胞（ 図1Bおよび1C）緑色に標識される。細胞はCa 2 +を負傷した（緑色）のほとんどの存在下で修復させると細胞が修復するために管理し、TRITCデキストラン（ 図1B）によって（赤）マークされていません。細胞を、Ca 2 +の非存在下で修復させると、損傷した細胞の多くはまた、TRITCデキストラン（Fi様赤色標識されるグレ1C）。怪我をされなかった細胞はTRITCデキストランを持つ任意のラベルを示していない。従って、二重（赤、緑）標識細胞の数が失敗したセルの測定を提供する定量化する間だけ標識緑色ガラスビーズにより負傷及び修復された細胞の測定を提供する細胞の数を定量化する任意の所与の試料中の負傷から修復します。
プロトコル2は、セル内のFM色素のエントリを監視することによって細胞膜修復の動態を評価することが記載されている。 FM色素でインキュベートした場合、無傷の細胞は、細胞膜染色（傷害WFパネルの前に、図2A）を示している。細胞膜の局在レーザー損傷後のFM色素は細胞に入り、FM色素の蛍光（ 図2B）の急激な増加を引き起こす内膜を、結合を開始する。以下のレーザー損傷を修復する細胞膜の容量は、Ca 2 +に依存しているように、のCa 2 +の存在下で負傷した細胞は、アルバータルは、FM色素エントリを引き起こす、修理（したがって、セルラー、FM色素の蛍光の増加）損傷後の分以内に停止する（ 図2A、上のパネル、 図2B、ブルーライン、およびビデオ1と図2アニメーション）する。逆に、のCa 2 +の非存在下で修復させた細胞は、修復するために失敗した、連続的な色素エントリをもたらすので、損傷後であっても4分（ 図2A、下部パネルFM色素の蛍光における連続的な増加、 図2B、その赤い線とアニメーションビデオ2および図2）。細胞膜修復の欠如がプラトーに失敗した連続的な色素エントリを引き起こしつつ、細胞膜の修復は、FM色素染色のプラトーをもたらす。
プロトコル3は、損傷に応答して、小胞およびタンパク質の細胞表面転位を監視するバルク（ガラスビーズ）傷害アプローチの使用を記載している。ここに目無傷の細胞は（ 図3A）、赤色標識されていないが、すべての細胞が損傷した（ 図3Bおよび3C）赤色に標識されている間にE細胞は、このようにしてTRITCデキストランの存在下で、負傷している。細胞表面LAMP1（ 図3Aの LAMP1パネル）のための一次抗体のショーバックグラウンドレベルのラベル付けで処理されていない無傷の細胞。細胞が損傷およびカルシウムの存在下で治癒させるしかし、リソソームのエキソサイトーシスを受け、したがって、負傷（赤ラベル）細胞（ 図3B）の表面上LAMP1染色の増加したレベルが存在する。細胞表面LAMP1標識の増加は、カルシウムの非存在下（ 図3C）で治癒させる細胞におけるはるかに低い。これは、カルシウム規制リソソームエキソサイトーシスの性質、従ってランプ1の表面外観を示しています。このように両方の、高い細胞表面LAMP1染色を有する細胞の数を定量ならびにレベルを測定すること個々の損傷細胞上の細胞表面LAMP1染色の、傷害を受ける細胞の能力のための措置はリソソームエキソサイトーシスを引き起こしています。
プロトコル4は、細胞膜の損傷に応答動態、性質、および個々リソソーム融合体の位置を直接監視するために使用することができます。細胞は、リソソーム、監視損傷は、個々の細胞内のリソソームのエキソサイトーシストリガー（ 図4Aおよびビデオ3アニメーション ）。 図4（a）は、により可視化（緑色の枠）セルを示すことができTIRFイメージングによって画像化されたパルスレーザーと、細胞表面で負傷している損傷の前に位相コントラスト撮影（左パネル）およびTIRF顕微鏡（中央パネル）によって、。右側のパネルには、損傷後の同じセル105秒の全反射像を示す。様々な損傷はリソソームの応答は図4B-Eに記載されている引き金となった。 図4Bは、マークされた（怪我がリソソームの動員を引き金示しエキソサイトーシス（アニメーションビデオ4および図4）に続いて、細胞膜に灰色の円）による。このリソソーム前（ 図4B：パネル-2.5秒）負傷TIRF画像に表示されないが、損傷後のリソソームは、細胞膜に到達した（ 図4B：パネル102.5 S）検出可能になる小胞がに近づくように、細胞膜は、それがTIRF照明によってより励起され、融合孔がリソソームのpHの中和を引き起こし、従って、FITCデキストランの蛍光（ 図4B：パネル104.8秒）の脱消光開いたときに、リソソームFITCデキストランの蛍光が最大値に達する。続いて、デキストランを徐々に（：107.1パネルの図4B）を減少させるために横方向に広がってFITC蛍光を生じる細胞の外側と小胞の蛍光に小胞から排出される。第二のカテゴリーでは、オレンジ色の丸でマークされたリソソームは（、 ヴィドアニメーションEO 5図4）（ 図4C傷害の前に存在している：小胞exocytosesまでパネル91秒）：パネル-2.5秒）、膜（ 図4Cに残っている。フュージョン（：94.5 S 図4C）は、次の小胞の一部のFITCデキストランを残して：ここにリソソームが部分的（パネル93の図4C）をエキソサイトーシス。小胞の第3および第4のカテゴリーは、膜に融合していない。 （青丸でマーク） を図4（d）に示すリソソームがにと離れて（ ビデオ6と図4アニメーション）細胞膜から軸方向に移動する。このリソソームけが（ 図4D：パネル-2.5 S）の前に、細胞膜に見えなくなりますが、損傷後の細胞膜に接近すると、それは全反射顕微鏡（ 図4D：パネル59.3 S）で見えるようになります。これは、細胞膜（図4D：パネル59.6秒）に最も近い達してから（図4D溶断せずに離れる：Pをパネル操63.7秒）。第四のカテゴリーのリソソームが膜に近い到着します。 図4E（パネル8.7 s）がリソソームの到着を示して水平に細胞膜（ ビデオ7と図4アニメーション図4Aの紫色のボックスでマークされた領域）に沿って移動する、次いで膜に沿って移動し、一連の画像において見ることができる損傷ポスト（ 図4E：パネル10.7、11.9、12.8、18.8秒）。各リソソームのFITCデキストランの蛍光強度の定量化上記の説明に基づいて- （ 図4E）を融合させた（ 図4Bおよび4C）を 、軸方向（ 図4D）を移動させるか、水平移動傷害に対するリソソームの応答を判断することができます。
図1。ガラスビーズによるバルク細胞膜損傷の画像（ヘキスト、左のパネル）、傷害（グリーン染色- FITCデキストラン）核染色を示しています。、未修復細胞（レッド染色- TRITCデキストラン）、および（マージ）の画像を統合しました。カルシウムの存在下で（A）非損傷細胞が、（B）カルシウムの非存在下で細胞をカルシウムの存在下で細胞を負傷、および（C）負傷。スケールバーは10μm。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。 （オレンジ色で概説）は、細胞のレーザー損傷に応答して細胞膜修復のリアルタイムイメージング（A）画像傷害[左のパネルの前に-明視野（BF）と損傷後のエピ（EPI）]、5秒、1分、4分。損傷部位は白い矢印で示されている。上部パネルは、カルシウムと下のパネルの存在で負傷セルは、カルシウム非存在下で負傷したセルを展覧。 （B）のグラフは、カルシウム（青）の存在下で、又はカルシウム（赤）の非存在下で損傷したパネルAの細胞のFM色素染色（ΔF/F0）の変化を示す。 FM色素は入射し、したがって蛍光標識が増加した領域は、蛍光強度の定量化のために使用した。スケールバー=10μm）を。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。バルク損傷に応答して撮像リソソームエキソサイトーシス。画像は核染色ヘキスト（青色）、細胞表面LAMP1染色（緑）、TRITCデキストラン（赤）表示し、一次抗体で標識されていない（A）無傷の細胞のすべてのチャンネル（オーバーレイ）のマージ、（B）負傷細胞が修復させカルシウムの存在下で、および（C）は、カルシウムの非存在下で修復するために負傷させた細胞。スケールバーは10μm。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。レーザー損傷に応答して、リソソームエキソサイトーシスのリアルタイムイメージング。FITCデキストランラベルリソソームを有する細胞は、カルシウムの存在下でのパルスレーザーによって負傷した。 （A）そのセルの境界負傷したが（緑色で）概説さ：左パネル - 明視野傷害の前に、中央のパネル - 怪我、右側のパネルの前に、TIRF - 損傷後のTIRF 105 S。損傷部位は、シアンボックスとBEのパネルに拡大している内に、白/紫ボックスや色付きの円で示されている代表的なエリアでマークされています。全細胞画像（グレー、オレンジ、青）での小胞の色は、個々のリソソームの画像をズームイン、色に対応しています。 （B）は左側のパネルには、損傷後に募集胞のFITC蛍光用ΔF/F0値のプロットを示す。右側のパネルには、傷害の前に小胞（-2.5秒）、融合前（102.5 S）、フュージョン（104.8 S）と融合後（107.1 S）のスナップショットを示しています。 （C）左側のパネルには、損傷前にドッキング小胞のFITC蛍光用ΔF/F0値のプロットを示す。右のパネルは、傷害の前に小胞（-2.5秒）、融合前（91秒）、フュージョン（93秒）と融合後（94.5秒）のスナップショットを示します。 （<強い> D）左側のパネル（）に向かって離れて細胞膜から軸方向に移動する小胞のFITC蛍光用ΔF/F0値のプロットを示す。右側のパネルには、損傷（-2.5秒）の前に小胞のスナップショットを示しており、59.3、59.6および63.7秒での膜の近くの別の位置での損傷後。 （8.7、10.7、11.9、12.8および18.8 s）で損傷（-2.5 S）の前と損傷後の様々な位置で水平細胞膜に沿って移動胞の（E）のスナップショット。スケールバー（A = 10程度、B、C、D、E = 1ミクロン）。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
アニメーション、ビデオ1、図2：カルシウムの存在下でのレーザー損傷に応答して細胞膜修復のリアルタイムイメージング 、パルスによって負傷した（オレンジ色で概説）セル内のFM色素エントリーカルシウムの存在下でのレーザー。映画は、すべての2秒を獲得した200のイメージを表しています。セルは、フレーム4の後に（シアン四角でマークされた領域）を負傷した。タイムスタンプは、時間単位の時間を示しています。分：秒：ミリ秒の形式。 =10μmのスケールバー。
アニメーションのビデオ2図2：カルシウム非存在下でのレーザー損傷に応答して細胞膜修復のリアルタイムイメージングカルシウムが存在しない場合にパルスレーザーによって負傷した（オレンジ色で概説）セル内のFM色素エントリー。映画は、すべての2秒を獲得した200のイメージを表しています。セルは、フレーム4の後に（シアン四角でマークされた領域）を負傷した。タイムスタンプは、時間単位の時間を示しています。分：秒：ミリ秒の形式。 =10μmのスケールバー。
アニメーションのビデオ3図4：リソソームexocytのリアルタイムイメージングレーザー損傷に応答したOSIS。細胞内のリソソームの異なる応答（ビデオ3、緑で概説）パルスレーザーにより負傷した。映画は/秒5コマの全反射顕微鏡で取得した連続的な時間経過の画像の2分を表しています。明視野画像は20秒ごとに取得した。セルは、このビデオに2秒で（シアンボックスで示される）が負傷した。色付きの円（グレー、オレンジ、青）と紫のボックスには、細胞傷害後の彼らの多様な運命を実証し、図4およびアニメーション化されたビデオ4-7に記載されてリソソームをマーク。タイムスタンプは、時間単位の時間を示しています。分：秒：ミリ秒の形式。 =10μmのスケールバー。
アニメーションのビデオ4図4は、傷害に反応して膜に動員されている灰色の丸でマークされたエキソサイトーシスリソソームを示しています。このビデオに7秒（5秒後損傷）でリソソームは、細胞膜にリクルートされますしてから1分47秒で、このサイトで融合する。 = 1ミリメートルスケールバー。
アニメーションのビデオ5図4は、前にこのサイト1分と35秒で負傷し、ヒューズに膜にドッキングされたオレンジ色の丸印でマークされたエキソサイトーシスリソソームを示しています。 = 1ミリメートルスケールバー。
アニメーションのビデオ6図4は青い丸印でマークされたリソソームが離れて細胞膜から、その後に向かって移動して表示されます。 = 1ミリメートルスケールバー。
アニメーションのビデオ7図4は、リソソーム（白丸）の損傷後1は、Alを動かすビデオ3に紫色のボックスでマークされたセルの領域を示している細胞膜オング。 = 1ミリメートルスケールバー。
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Discussion
インビボでの細胞膜傷害は、これらを模倣するために開発された生理学的ストレスおよびいくつかの実験的アプローチの種々発生する。これらの皿を、それらを掻き落としたり、狭い穴の注射器9,10を通じて継代することにより接着細胞の細胞膜を傷つけています。このような傷害後の細胞を懸濁液で治癒し、それらが正常組織中でそうであるように、細胞外マトリックスに接着されていない。このような生体力学的傷害5 に模倣されないように、コレステロールなどの脂質を抽出することにより、化学的には、ALTER細胞膜孔形成毒素の使用など、まだ他のもの。このように、細胞損傷のために使用される方法は、修復応答について学ぶことができるかに影響することがあります。これは、細胞傷害アッセイの選択だけでなく、注意を行使するだけでなく、より良好なインビボでの機械的傷害を模倣するアプローチを選択する必要がある。このようなアプローチは、細胞の単層が負傷しているスクラッチ損傷が含まれる（メスまたは針）とガラスビーズの損傷（損傷が付着した細胞寝返りガラスビーズによって引き起こされる）によって。これらのアプローチはよく一斉に細胞を損傷するのに適しますが、細胞膜修復過程のリアルタイムイメージングに適していないしている。衝撃点に局在し、十分に制御された負傷者を作成するには、マイクロニードルとパルスレーザーの使用は、 生体内で機械的および外傷性損傷を模倣し、修復応答のリアルタイムイメージングに適しているが、一度に1つのセルの修理への洞察を提供しています。なお、パルスレーザー傷害アプローチは、膜損傷が膜脂質、このようなphotoxidative光熱損傷のような非生理学的効果を誘導することが知られている局所的加熱によって引き起こされる非パルスレーザによる細胞膜の拡大照射の使用とは区別されることは注目に値するおよび細胞質の構成要素11。
ここで説明するプロトコルは、1 Oのポテンシャルを活用できるようにガラスビーズの使用に依存しており、能力、速度論およびマイクロメートルサイズの損傷後の細胞膜の修復に関与する細胞内輸送を監視するためのローカライズされた傷害のアプローチ（パルスレーザー）の1 F 一斉傷害アプローチ。これらのアプローチは、相互に相補的である - バルク損傷は修理能力と、それに関連する細胞内輸送において赤字を識別するために、細胞集団を使用して有効にします。個々の細胞内での修理のリアルタイム可視化を可能にすることにより、レーザー傷害アプローチは、細胞膜の修復と細胞内どのイベントが修理の赤字に関連付けられているどのようなステップを特定することができます。このアプローチは、哺乳動物および無脊椎動物の生物7,12,13細胞膜の修復をモニターするために使用されている。実験のニーズに基づいて、これら2つのアプローチのいずれかを単独で使用することができる。しかし、修復欠損の性質が知られているか、または細胞内機構がtに関与していないときこれらのアプローチの組み合わせを使用して、知られていない彼の方法は、有用である。
により、エンドポイントでのサンプル間傷ついた細胞の数の固有の変動に基づく細胞傷害アッセイには修復し、修復するために、失敗したために管理すること、独立して負傷しているすべてのセルを特定する必要がある。ここで説明したガラスビーズ傷害アプローチは、これらの細胞を同定することができる。負傷ガラスビーズを行う際には、自身が軽度で負傷損傷細胞の数を最大化するための努力をしながらその細胞が複数のヒットを受けていないことが重要です。繰り返さ傷害が（選択的修繕に弱いもの）細胞は死滅し、処置中にカバーガラスから切断されますので、これは重要です。これは、修復に失敗した細胞の過小評価につながる。これは、任意の新たな損傷を排除するためにカバースリップを処理し、洗浄中にガラスビーズのいずれ圧延を回避することも重要であるレッド染色（偽陽性細胞）になります。損傷に対するこのアプローチはまた、リソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）のためにここ実証されているように、関心対象のタンパク質の細胞表面転位のための細胞の集団をモニタリングを可能にする。免疫蛍光法によってのみ細胞表面局在するタンパク質を監視する際に重要な要件は、固定前に関心と免疫標識細胞のタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体を使用することである。これは、無傷の細胞又は細胞の異なる集団の間に損傷した細胞の細胞膜でのLAMP1レベルとを比較することができる。このプロトコルはLAMP1を用いて説明してきたが、それは、タンパク質の細胞外ドメインに特異的な抗体が存在するために選択される任意の他のタンパク質に適用することができる。傷害トリガリソソームのエキソサイトーシスは、リソソームのエキソサイトーシス（損傷によって引き起こさず）同様の基礎速度を有することが確立されていない2つの細胞株の間で比較する必要がある場合、無傷の細胞上の細胞表面LAMP1染色はまた、測定されるべきである。このために追加のサンプルは、ステップ9で細胞を一次抗体とインキュベートされるべきであることを除いて単なるサンプルC2として扱われます。これはリソソームエキソサイトーシスの基底速度の測定値を提供します。
レーザー傷害プロトコルのため細胞膜を高輝度単一光子NSECパルスレーザーによって負傷している。創傷は、蛍光増大の結合の際に細胞内膜（ 例えば、FM 1-43）、細胞透過性色素の存在下で行われる。このように細胞関連色素の蛍光を、次のことは時間のために3を癒すために、細胞が撮影した尺度を提供する。レーザー傷害は、FM色素の蛍光の増加をもたらす、細胞に侵入し、内膜に結合するFM色素を引き起こす。損傷を受けた細胞膜の修復は、細胞へのさらなる色素エントリを妨げる。従って、細胞のための染料を修復していないとしながら、修理、色素の蛍光は、プラトーに達したセルについて蛍光は継続的に増加します。
細胞膜修復に関与する個々の細胞内イベントのライブセルイメージングは対雑音比の高い信号で細胞膜を監視することが必要である。全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡雑音比14-16高い信号での撮像の細胞表面イベントによく適しアプローチである。そこにいくつかの市販のTIRFシステムがあり、生細胞イメージングと互換性のこれらの系のいずれも用いることが可能である。さらに、我々は他の場所で17,18自家製TIRF顕微鏡を設定するためのアプローチを説明しています。 TIRFの設定とは無関係の前に細胞内小胞の種々の運命をモニターし、損傷後の許可のアプローチを確立する必要がある。他の場所で私たちは、監視、自然、期間、および各リソソーム19の融合の程度を可能にするようなアプローチの議論を提供してきた。けがを監視するには、FITC-デキストランラベルlysosoのエキソサイトーシスを引き起こしたプロトコル4守るべき重要な機能を説明したMESが点滅している。 Flashが蛍光の水平展開、その結果、単一のステップで、個々のリソソームに含まれているのFITCデキストランの放出が含まれます。各フラッシュは、典型的には、単一のリソソームのエキソサイトーシス融合を示しているが、融合部位に存在するかを監視し、多くのリソソーム前およびフラッシュに従うことによって、これを確立することが重要である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、フランスの筋ジストロフィー協会（AFM）によるADに健康補助金AR055686とAR060836およびポスドクの国立研究所によってサポートされていました。本研究で利用される細胞イメージング施設は、健康補助金HD040677の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
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