ومثلي الأشكال ورم أرومي نموذج الفأر القيود الحفاظ على الدماغ متني البدنية ومناسبة لحيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري

Summary

أنشأنا القشرية نموذج ورم أرومي دبقي مثلي في الفئران لحيوي داخلي المجهر ثنائي الفوتون الذي يلخص القيود الفيزيائية الحيوية عادة في اللعب أثناء نمو الورم. نافذة الزجاج المزمنة استبدال الجمجمة فوق الورم يمكن متابعة تطور الورم على مر الزمن من قبل اثنين من الفوتون المجهري.

Abstract

ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) هو الشكل الأكثر عدوانية من أورام الدماغ مع عدم وجود العلاجات العلاجية المتاحة حتى الآن.

نماذج الفئران من هذه الأمراض تعتمد على حقن تعليق الخلايا دبقي في الدماغ حمة التالية من شق الجافية-الأم. في حين أن الخلايا لديها ليتم حقنه سطحيا لتكون في متناول حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري، فشل الحقن السطحي لألخص الظروف physiopathological. في الواقع، الهروب عن طريق الجهاز الأكثر حقن الخلايا السرطانية تصل إلى الفضاء خارج الجافية حيث التوسع السريع بشكل غير طبيعي في غياب القيود الميكانيكية من لحمة.

تحسينات لدينا تتكون ليس فقط في زرع الوزراء البريطانى كروي دبقي بدلا من حقن الخلايا دبقي تعليق في الطبقات السطحية للقشرة الدماغ ولكن أيضا في انسداد موقع الحقن من قبل عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة التي يتم لصقها على surrounقرع حمة ومختومة إلى الجافية-الأم مع فورية الغراء. تماما هذه التدابير فرض التوسع الفسيولوجية وتسلل الخلايا السرطانية داخل لحمة الدماغ. تم إغلاق حج القحف أخيرا مع نافذة زجاجية رسخ في الجمجمة للسماح التصوير المزمن على مدى أسابيع في غياب التنمية ندبا.

الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا الفلورسنت المطعمة مع الخلايا السرطانية الفلورسنت أظهرنا أن ديناميات التفاعلات التي تحدث بين الخلايا دبقي، الخلايا العصبية (مثل Thy1-CFP الفئران) والأوعية الدموية (التي أبرزتها حقنة في الوريد من صبغة الفلورسنت) يمكن تصور من قبل حيوي داخلي المجهر ثنائي الفوتون أثناء تطور المرض.

إمكانية وجود ورم في صورة قرار المجهرية في بيئة الدماغي للخطر الحد الأدنى يمثل تحسنا من النماذج الحالية الحيوان الخليج للحاسبات الآلية التي ينبغي أن تستفيد مجال علم الأورام العصبية واختبار المخدرات.

Introduction

يظهر ورم أرومي دبقي الأشكال باعتبارها الشكل الأكثر عدوانية من ورم في المخ في البالغين مع بقاء متوسط ​​12 شهرا و 5 سنوات معدل البقاء على قيد الحياة من 5٪. يعتمد التدبير العلاجي السريري على الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي غالبا ما تستخدم في تركيبة. ومع ذلك، فإن آثار هذه العلاجات الملطفة تبقى ^1-3.

حتى الآن، فإن معظم الدراسات العصبية الأورام تعتمد على التقنيات التي هي الوحيدة القادرة على تقديم وجهة نظر ثابتة والتي أجريت على الأفواج الكبيرة من الورم الحيوانات تحمل التضحية في مختلف نقاط الوقت (انظر على سبيل المثال ^4،5). التطورات الأخيرة في طرق المتابعة على أساس intravital التصوير يسمح بدراسة نمو دبقي والتفاعلات بين الخلايا السرطانية والمكروية المرضية في جسم المريض على نفس الحيوان مع مرور الوقت. هذا يفتح الطريق أمام قطعة حصرية من المعلومات التي كانت غير قابلة للتحقيق حتى الان ^6. الحيوانات المعدلة وراثيا معربا به نيون في خلايا الفائدة قد يكون استخدامد لدراسة التفاعلات محددة بين الخلايا السرطانية والخلايا العصبية على سبيل المثال في هذه الورقة.

على مدى العقد الماضي، حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري ⁷ أصبح معيار الذهب في الدراسات العصبية الأورام الأساسية والتجارب قبل السريرية ^8،9 لقدرته على أداء الملاحظة حيوي داخلي عميق من مخ الفأر (> 500 ميكرون تحت الجافية-ماتر) مع قرار المكانية المصغر ^10. باستخدام حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري مع النماذج الحيوانية orthotopical مزروع مع نافذة الجمجمة المزمن ^11، فمن الممكن لمتابعة تطور الورم على مر الزمن على نفس الماوس ^9،12.

واحدة من العوائق الرئيسية من هذه النماذج الحيوانية نشرت سابقا هو بيد أنها لا تحاكي القيود المادية التي تحكم نمو الورم كما هو لا مختومة الجافية-الأم بعد حقن تعليق خلية ^9،13،14. الخلايا دبقي قد تسرب فيالفضاء الجافية تحويل نموذج دبقي مثلي في احد منتبذ.

نموذج حيواني المقدمة هنا يتمثل في حقن كروي الخلايا دبقي الفلورسنت في القشرة المخية على عمق 200 ميكرون تليها ختم الجافية-الأم مع ربط عبر ديكستران هلام نصفي حبة والغراء histo متوافقة . ثم يتم تقييد نمو الورم إلى الدماغ حمة التي تحافظ على القيود المادية المرضية في جسم المريض. نافذة الزجاج المزمنة مزروع فوق الورم يسمح الوصول السهل البصرية لحيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا به نيون في خلايا الفائدة فمن الممكن لإجراء متابعة نمو دبقي مع مرور الوقت ودراسة تفاعلها مع المكروية لها (هنا مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية مع أبرز dextrans الفلورسنت).

Protocol

تم تنفيذ كافة الإجراءات التجريبية وفقا للتشريعات الفرنسية وامتثالا لتوجيهات مجلس الجماعة الأوروبية من 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وأذن البحوث على الحيوانات من قبل اتجاه DÉPARTEMENTALE قصر خدمات بيطريون قصر بوش دو رون (رخصة D-13-055-21) والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية بروفانس كوت دازور رقم 14 (مشروع 87-04122012) .

1. إعداد الأجسام الشبه الكروية

1. إعداد أطباق بتري المغلفة الاغاروز
   1. مزيج 1 غرام من الاغاروز مع 100 مل من مستنبت الخلية لا تستكمل مع مصل بقري جنيني. استخدام المايكرويف (850 واط لمدة 40 ثانية، ثم 3 × 15 ثانية؛ تحريك الحل في كل دورة بين الميكروويف) لغلي حل وتذوب تماما في الاغاروز. الأوتوكلاف هذا الحل الاغاروز 1٪ لمدة 20 دقيقة على 120 درجة مئوية لضمان STERI. lity ملاحظة: احرص على إذابة تماما قبل الاغاروز بروتوكول الأوتوكلاف. التجانس قد تعرض للخطر تشكيل الأجسام الشبه الكروية.
   2. مرة واحدة استردادها من الأوتوكلاف، صب 10 مل من محلول 1٪ الاغاروز في 100 × 20 مم أطباق بتري. مغادرة بيتري أطباق 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح الحل الاغاروز 1٪ ليصلب.
   3. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني فوق الاغاروز للحفاظ على الرطوبة. ختم غطاء أطباق بتري المغلفة الاغاروز بواسطة التفاف عليها مع parafilm لتجنب التبخر. ويمكن تخزين أطباق بتري لمدة تصل إلى 2 أشهر في 4 درجات مئوية إذا مرطب بشكل صحيح من قبل طبقة برنامج تلفزيوني.
2. ثقافة كروي
   1. في 75 سم ² قارورة والثقافة الخلايا دبقي في المتوسط ​​على النحو الموصى به من أحادي الطبقة.
   2. استبدال برنامج تلفزيوني من واحدة من 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري بنسبة 1.5 مل من "متوسطة شروطا مسبقة" التي تم جمعها من القارورة التي تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا دبقي 2Dق.
   3. إزالة المتوسطة من القارورة التي تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا دبقي 2D.
   4. شطف بلطف أحادي الطبقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
   5. إضافة 2 مل من 0.05٪ من حل التربسين / EDTA واحتضان دقيقة قارورة 4 عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: قد تختلف فترة حضانة وفقا لخط الخلية المستخدمة.
   6. إضافة 8 مل من مستنبت لوقف عمل التربسين، طرد بلطف تعليق الخلية ملاحظة: الحرص على عدم طرد الهواء في تعليق خلية لأنها تزيد موت الخلية.
   7. وضع 6 مل من تعليق خلية في قارورة معقمة.
   8. أجهزة الطرد المركزي القارورة 4 دقائق عند 800 دورة في الدقيقة.
   9. إزالة طاف وبلطف تعليق الرواسب خلية في 3 مل من مستنبت.
   10. البذور تعليق خلية في مغلف الاغاروز استعداد طبق بيتري.
   11. وضع طبق بتري عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي لمدة 2 إلى 3 أيام حتى يتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من القطر المطلوب.
2. كروي ونافذة زرع
1. إعداد نظام حقن
   1. الشعيرات الدموية زجاجي نظيف (1 مليمتر في القطر) بواسطة sonicating في الايثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة. شطف مرتين مع وضع قبل المياه داخل حاضنة حتى تجف.
   2. سحب العديد من الشعيرات الدموية الزجاج تنظيفها مع مجتذب ماصة من أجل إعداد الأسهم الصغيرة.
   3. كسر غيض من الشعرية سحبت من قبل الخدش أقصى على قطعة من المناديل الورقية للحصول على أقصى مشطوف من الحجم المطلوب: عادة ما يكون قطرها الخارجي من 300-350 ميكرون وقطرها الداخلي من 250-300 ميكرون. أثناء هذه العملية تشكيل، والسيطرة على قطر الشعيرات الدموية باستخدام macroscope الذين مجهزة ميرا تخرج العين.
   4. ربط الطرف غير مشطوف من شعري لمشعب 3 طريقة باستخدام قطعة من الأنابيب البلاستيكية الذي يناسب القطر الخارجي للالشعرية القطر الداخلي.
   5. باستخدام توبين البلاستيكز، ربط اثنين من الطرق الأخرى لمشعب ل 25 ميكرولتر ميكروليتر حقنة وحقنة 1 مل محملة-histo متوافق الزيوت المعدنية.
   6. ضبط محدد متعددة لإنشاء ممر بين حقنة ميكروليتر وحقنة 1ML. نزع المكبس من المحاقن وحقن ميكروليتر الزيوت المعدنية الى الوراء في حقنة ميكروليتر حتى تتسرب عن طريق دفع المكبس من المحاقن 1ML. استبدال المكبس من المحاقن ميكروليتر مع الحرص على عدم ترك فقاعات الهواء في الأنبوب.
   7. ضبط محدد متعددة لإنشاء ممر بين الشعرية وحقنة 1 مل. ملء الشعرية مع الزيوت المعدنية حتى تتسرب من غيض مع الحرص على عدم ترك فقاعات الهواء في الأنبوب.
   8. ضبط محدد متعددة لتأسيس اتصال بين حقنة ميكروليتر والشعرية. طرد حوالي 10 ميكرولتر من الزيوت المعدنية.
   9. تراجع غيض الشعرية في حل PBSوباستخدام مقياس من حقنة ميكروليتر، وتمتص في 5μl من برنامج تلفزيوني في شعري. لاحظ أن الغضروف المفصلي بين النفط وPBS هي واضحة للعيان.
   10. إصلاح الشعرية على micromanipulator 3 محور المناسب تحت macroscope الجراحة. سيتم استخدام هذا النظام لاستهداف الشعرية إلى موقع الحقن تحت المراقبة البصرية.
2. زرع كروي
   1. بخفة رزين الماوس عن طريق استنشاق isoflurane وفي غرفة الاستقراء (1.5٪ في الهواء أثناء 1-1،5 دقيقة).
   2. تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين / زيلازين (120 ملغ / كغ و 12 ملغم / كغم). نلاحظ أن التخدير غالبا ما يقلل من درجة حرارة جسم الحيوان. فمن المستحسن المضي قدما في عملية جراحية في غرفة في 26 ° C وللحفاظ على الحارة الحيوان مع الكامنة thermocontrolled سادة التدفئة.
   3. تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العينين.
   4. يحلق فروة الرأس من الحيوان.
   5. مكانالحيوان في إطار المجسم باستخدام قضبان الأذن والمعبرة.
   6. تنظيف البشرة مع اليود البوفيدون (الصابون 3٪، ثم حل 10٪).
   7. إجراء شق طولي 1 سم طويلة في منتصف فروة الرأس مع مشرط. باستخدام مقص قطع وإزالة الجلد فوق العظام الجداري.
   8. بشفرة مشرط وإزالة بلطف والسمحاق فوق الجمجمة. تنطبق بسخاء فورية الغراء على الجزء العلوي من عظم لتوليد سطح خشن لتمسك الأسمنت في وقت لاحق.
   9. حفر العظم الجداري تحت macroscope الجراحية لتوليد حج القحف من 4 مم. إضافة بسخاء الجليد الباردة PBS تحتوي على Pencillin (1،000 U / مل) وStreptomicin (1 ملغ / مل) أثناء الإجراء بأكمله لمنع التدفئة. إزالة شظايا العظام الصغيرة مع ملقط وشاش معقم الرطب. رعاية لحفر ما لا يقل عن 1MM بعيدا عن الجداري الجمجمة الغرز لتجنب النزيف.
   10. رقيقة العظم في حدود حج القحف حيث سيتم اغلاق نافذة زجاجية. الهدف من ذلك هو البريدnsure في وقت لاحق لتحديد المواقع مستو من نافذة زجاجية مع سطح الاتصال القصوى بين الدماغ والزجاج. إزالة ببطء العظام باستخدام ملقط وتنظيف يتعرض الجافية-الأم مع الحل برنامج تلفزيوني.
   11. تأخذ 5 مم الجولة الزجاج ساترة، تنظيفه مع الكحول وجففها مع المناديل الورقية. محاولة استخدام ساترة بمثابة غطاء لحج القحف وتأكيد أن سطح مستو كبير من الدماغ يحصل في اتصال مع الزجاج. إذا لزم الأمر إزالة ساترة لمزيد رقيقة العظام الجانب. المضي قدما حتى الدماغ يمكن الحصول على تقلص مسطح إذا تطبيق الضغط بلطف على ساترة مرة واحدة في المكان.
   12. تنظيف مرة أخرى ساترة مع الكحول، وجففه مع المناديل الورقية، وحفظه بعيدا.
   13. مع إبرة قياس 26 جعل ​​ثقب في الجافيه المحيط في مركز حج القحف بعد تجنب الأوعية الدموية الرئيسية. تأكد من عدم تلف الدماغ حمة حيث إن الغرض من هذه الخطوة هو مجرد لفتح الجافية-الأم.
   14. بلطف تنظيف واي الجافيه المحيطال PBS الحل لإزالة النزفية الدم. تغطية مع قطعة من المناديل الورقية أثناء إعداد حقن كروي.
   15. مع نظام حقن كروي أعدت في الخطوة 2.1، تمتص كروي الجولة المناسب القطر الداخلي الشعرية (حوالي 200-250 ميكرون) من طبق بيتري أعدت في الخطوة 1.2. كروي يجب أن تأتي جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 5 ميكرولتر مستنبت. يجب أن تسقط لغيض من الشعرية تحت ثقلها.
   16. إزالة المناديل الورقية الرطبة تستخدم لتغطية حج القحف ووضع الحيوان تحت نظام حقن.
   17. خفض ماصة الحقن حتى يلمس ثقب المحرز في الجافيه المحيط. ثم، وانخفاض مرة أخرى بنسبة 250 ميكرون. انتظر 30 ثانية.
   18. حقن ببطء كروي باستخدام المكبس من المحاقن ميكروليتر (2-3 ميكرولتر)، في حين ضخ السائل الزائد مع قطعة رقيقة من المناديل الورقية. انتظر 30 ثانية ثم رفع بلطف ماصة الحقن بنسبة 50 ميكرون نحو السطح. الانتظار مرة أخرى 30 ثانية وrepeaر الإجراء رفع بخطوات من 50 ميكرون حتى السطح. فترات الانتظار يتجنب استخراج كروي التي من شأنها أن التمسك ماصة.
   19. تأكيد وجود كروي في الدماغ باستخدام macroscope مضان.
   20. مزيج 100-300 ميكرون قطر عبر ربط هلام حبات ديكستران مع حل PBS في طبق بتري. الانتظار 1min الأسماك وبعض حبات رطب. وضعها على العظام المجاورة للحج القحف.
   21. تحت السيطرة العيانية، واختيار حبة واحدة يبلغ قطرها مماثل لحجم الفتحة الجافيه المحيط. قطع عبر ربط ديكستران هلام حبة إلى نصفين باستخدام ملقط.
   22. بلطف وضعت عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة في حفرة حقن الوجه مع محدب نحو كروي. والحرص على عدم إزالة كروي واضغط برفق نحو الانخفاض حتى الحدود من مقعر الحصول على اتصال مع الجافية المحيطة-الأم.
   23. وضع قطرة من الغراء cyanoacrylate على شريحة زجاجية؛ تراجع غيض من المسواك في دروp لتأخذ كمية صغيرة من الغراء. ختم بسرعة حواف عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة لالمتاخمة الجافيه المحيط بواسطة الغراء ختم حولها. الحرص على أداء حركات سريعة ودقيقة من أجل تجنب الإلتصاق عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة إلى مسواك. تجنب الزائد من الغراء التي يمكن أن تنتشر وتعرقل إن لم يكن منع التصوير مرة واحدة المجففة. الانتظار 2 دقيقة للالغراء لتجف ومن ثم تنظيف حج القحف والعظام المحيطة بها مع الحل برنامج تلفزيوني.
3. نافذة زرع
   1. وضع 5 مم الجولة ساترة فوق حج القحف (انظر 2.2.12). يجب أن تكون حواف ساترة على الجمجمة ضعيفة في الجزء الخارجي من حج القحف. يجب أن تكون ساترة في اتصال مع الجافية-الأم والعظام ضعيفة على الحواف. من المهم جدا أن يكون الاتصال المباشر بين الأم الجافية، وساترة الزجاج وإلا ندبا قد تعيق تطوير وضوح بصري.
   2. بمنديل، واستيعاب برنامج تلفزيوني على الحواف البريد ساترة بحيث الحل لا يغطي تماما حج القحف عند تطبيق ضغط صغيرة في وسط ساترة. وسوف يضمن هذا العظم والزجاج والدماغ يتم لصقها معا على جانب المنطقة من الفائدة.
   3. الحفاظ على ضغط صغيرة في وسط ساترة مع ملقط أثناء تطبيق بلطف فورية الغراء على الحدود بين العظام وساترة. سوف تنتشر الغراء عفويا حتى واجهة مع الحل برنامج تلفزيوني. والحل يكون بمثابة حاجز نظرا لللا مائية من الغراء. يجب أن يكون الختم فعالة في أقل من دقيقة ولكن اتخاذ الحذر الشديد بعدم نقل ساترة حتى يتم إصلاح ذلك. هذا من شأنه أن يؤدي خلاف ذلك في تسرب فورية الغراء على الجافيه المحيط وبالتالي يؤدي إلى فشل الجراحة.
   4. في حالة الغراء قد انتشر على رأس من الزجاج، إزالته باستخدام شفرة مشرط الصغيرة عن طريق القيام الحركات دوامة كما أنها قد تقلل خلاف ذلك الوضوح البصري. احترس لا لكسر الزجاج ساترة الزيتوز الإجراء بسبب الضغط المفرط.
   5. توطيد تثبيت الزجاج عن طريق تطبيق الاسمنت الأسنان على حواف ساترة نحو الجمجمة المجاورة. تأكد لتغطية الجمجمة يتعرض كله حتى فروة الرأس. باستخدام الاسمنت إضافية، وبناء الجدران الجانبية حول ساترة لخلق تجمع اللازمة لغمر الهدف. سوف الاسمنت الأسنان علاج في أقل من 10 دقيقة.

3. العناية والتحضير لمرحلة ما بعد التصوير المنطوق

1. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
   1. إزالة الماوس من إطار المجسم، وضخ Dexamethazon (0.2 ملغ / كلغ) وRimadyl (5 ملغ / كلغ) الشوري فوق منطقة الحوض ووضع لها في قفص مع دافئة الأنسجة العش.
   2. مراقبة الحيوان حتى اختفت آثار التخدير. بصفة عامة 2-3 ساعة بعد الجراحة، والفئران هي النقالة بشكل كامل. تأكد من أن الحيوانات لديها سهولة الوصول إلى الغذاء والماء. توفر الحيوان مع الاغاروز التي تحتوي على الجلوكوز (الاغاروز3٪، الجلوكوز 3٪).
   3. مراقبة وزن الحيوان كل يوم وحقن Dexamethazon (0.2 ملغ / كلغ) وRimadyl (5 ملغ / كلغ) الشوري لأول 10D بعد الجراحة. لاعتبارات أخلاقية، الموت ببطء الفئران عندما يتجاوز خسارة 15٪ من وزنه الأصلي. يزيد الضغط داخل القحف مع حجم الورم مما يؤدي إلى ضعف المحرك للحيوان. هذا هو الورم خط الخلية التابعة ويحدث في مختلف التأخير بعد الجراحة. وينبغي إيلاء عناية خاصة لتوصيف نقطة نهاية التجربة مع خط الخلية المستخدمة.
2. التحضير للتصوير
   1. بخفة رزين الماوس عن طريق استنشاق isoflurane وفي غرفة الاستقراء (1.5٪ في الهواء لمدة 1-1،5 دقيقة).
   2. تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم). مثل هذا التخدير يسمح عادة 45 دقيقة من المراقبة. لتنفيذ جلسات التصوير لفترة أطول، يتم وضع الماوس تحت الاستنشاق المستمر للisoflurane وفيالهواء (0،25-0،75٪).
   3. تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العينين.
   4. وضع الحيوان على إطار المجسم ومنع الجمجمة مع earbars.
   5. لتصور الأوعية الدموية، صبغة الفلورسنت يمكن حقنه عن طريق الوريد.
   6. إذا يظهر إطار القذرة، ويمكن تنظيفها عن طريق إزالة بلطف الحطام بشفرة رقيقة وركن من الأنسجة. لا تستخدم الكحول لتنظيف النافذة كما أنها ليست دائما متوافقة مع الاسمنت الأسنان ويمكن أن يبرد الدماغ تحت النافذة.

Representative Results

مرة واحدة يتم تنفيذ البروتوكول الجراحية (الشكل 1)، والحيوانات يمكن ملاحظتها من خلال المجهر الفلورسنت أكثر من أسابيع حتى التضحية. ويمكن ملاحظة تفاعل التهابي بعد الجراحة التي يختفي في غضون أسبوع أو أسبوعين. ويمكن ملاحظة نمو الورم عن طريق تقنيات مختلفة بما في ذلك الفحص المجهري الفحص العياني الفلورسنت واثنين من الفوتون المجهري (الشكل 2). تحققت مثل الصور صورت هنا على macroscope مضان المجهر واثنين من الفوتون إلى جانب الفيمتو ثانية ليزر الأشعة تحت الحمراء نابض الانضباطي والسماح المواقع الحيوان تحت الماء الغمر 20X الهدف (1.0NA) المعدلة المنزل.

قدرت تطور الورم على مر الزمن باستخدام macroscope مضان الجمع بين الإضاءة مائلة لحقل التصوير مشرق الانعكاس والانبعاثات epifluorescence (أرقام 2A-2C). مستوى العتبة من مضان يعطي بسهولة الوصول إلى منطقة الورم بينما superficial الأوعية الدموية فصل هياكل الظلام للخروج من خلفية بيضاء للصورة الضوء المرئي. من جهة أخرى حيوي داخلي يد اثنين من الفوتون المجهري يسمح ض باجتزاء وإعادة البناء متعامد من حقول واسعة من الرأي مع قرار التحت خلوية (انظر التشعبات في الشكل 2D). استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في الخلايا من الفائدة (على سبيل المثال، الفئران Thy1-CFP التي تعبر عن بروتين سماوي نيون في الخلايا العصبية، والأخضر الزائفة اللون في الشكل 2D) فمن الممكن لمراقبة تطور الورم في الخلايا العصبية البيئة الصغرى لها. ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن كثافة الخلايا السرطانية يمكن أن تحد من عمق الاختراق الفوتون فضلا عن الكشف الفوتون المنبعث نتيجة لزيادة الانتشار. هذا هو واضحة للعيان في الشكل 2D كما يبدأ القرار المكانية لخفض في 200 ميكرون تحت الجافية-المسألة في الورم ولكن ليس في لحمة الدماغ بصحة جيدة. وعلاوة على ذلك، في إشارة الجيل الثاني التوافقي الناشئة جيئة وذهابانظمت م أنماط من جزيئات غير centrosymetric مثل النوع الأول والثالث الكولاجين يوفر توقيع الجافية-ماتر (سماوي اللون شبه في الشكل 2D والسهام). يجب الإشارة إلى أنه مع بروتوكول الجراحية لدينا، وينمو الورم تحت الجافية-الأم في لحمة الدماغ حيث يخضع تطورها بسبب القيود المادية من الدماغ. وختم الجافية-الأم مع ربط عبر ديكستران هلام نصفي حبة يمنع هروب الخلايا دبقي في الفضاء خارج الجافية.

عندما تليها حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري يمكن مقارنة تطور الورم بين مختلف نقاط وقت من الأوقات على قرار الخلوية. تصوير نفس المنطقة في D16 D27 وبعد الجراحة (الشكل 3A) وجدنا بعض الأوعية الدموية كما هو أبرزتها السهام التي كانت مستقرة على مدى فترة 11 يوما؛ من ناحية أخرى تسللت الجبهة الورم بوضوح في لحمة صحية خلال نفس الفترة. لتقييم تطور الورم، يا أماه لوقد ورد rgin وحظ في D27 مع خط منقط الأصفر ومضافين على الصورة التي اتخذت في D16. ولوحظ وجود تحول 520 ميكرون من الحافة الأمامية باستمرار مع ملف التكاثري ذكرت من طراز GL261 دبقي ^15. كانت أنماط من شبكة الأوعية الدموية داخل الورم مختلفة جدا على D16 D27 وتشير إلى أن إعادة عرض كبيرة الأوعية الدموية يحدث في المناطق المرضية (الشكل 3A). على هامش الورم، وجدنا أيضا حالات من الخلايا دبقي فصل من صميم الورم كما هو متوقع من ورم الغازية. أظهرت القرار المجهرية من الصور لدينا ليس فقط أن هذه الخلايا تطلق نتوءات حشوية لاستشعار البيئة ولكن أيضا التي يمكن استخدامها الأوعية الدموية في شكل مصفوفة لتقدمهم (النصال و z-إعادة الإعمار في الشكل 3B). وبالتالي اثنين من الفوتون المجهري يسمح لدراسة التفاعلات الخلوية في سياق الفسيولوجية حقا. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا حيث كل السكان خلية من الفائدةالتي حددها مراسلها الخاصة الفلورسنت يصبح من الممكن للبحث عن وجود التفاعلات الجسدية بين الخلايا السرطانية وبيئتهم كما المنظمين الرئيسيين من تطور المرض (الشكل 3B، يمين).

الشكل 1. نظرة عامة على الجراحة. يتم تنفيذ حج القحف على العظم الجداري الأيسر (A). وترد حدود العظم الجداري الأيسر مع خط منقط وشغل الجزء الذي تمت إزالته باللون الأصفر (B). مرة واحدة حج القحف القيام بها، يتعرض القشرة الجدارية (C)، يتم تحديد المنطقة لحقن كروي مع الحرص على تجنب الأوعية الدموية الرئيسية (سهم في D) ويتم استخدام إبرة قياس 26 لفتح الجافية-ماتر ( سهم في E). كروي هوحقن وانسداد الثقب في الجافيه المحيط بها عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة مختومة مع الغراء فورية الغراء (سهم في F). يتم لصقها ساترة الزجاج حتى العظم مع الحفاظ على الاتصال مع الدماغ. وعزز ساترة أخرى لالجمجمة تعرضت لضمان مرفق الصلبة على المدى الطويل من النافذة في الجمجمة لملاحظات المزمن (GI). وschematized بروتوكول كامل لفترة وجيزة في J. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الشكل 2. يقتصر نمو الورم إلى الدماغ حمة ويمكن رصدها على مر الزمن. AC. ويلاحظ نمو الورم (خط الخلية GL261 معربا عن DsRed2) بواسطة macroscopy في يوم الجراحة (DO، A) وعلى أيام 21 (ب) و 27 (C). رأس السهم في C يسلط الضوء على قطرة من الاسمنت الأسنان التي لم يتم ازالتها خلال الخطوة 2.3.5. د. إعادة البناء متعامد تم الحصول عليها من حقل 3 × 3 المكتسبة 0-300 ميكرون تحت الجافية-الأم في الماوس Thy1-CFP تحمل الورم GL261 من قبل اثنين من الفوتون المجهري في D20 ما بعد الجراحة. الورم (الحمراء)، الجافية، الأم التي لاحظها الجيل الثاني التوافقي (الأسهم، سماوي) والخلايا العصبية (الخضراء). لاحظ أن الورم ينمو تحت الجافية-الأم في لحمة الدماغ. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3. فايمكن رصد scular إعادة عرض وغزو الخلايا السرطانية مع مرور الوقت مع القرار المكانية الخلوية بواسطة حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري. لاحظ A. الورم GL261 (الحمراء) في D16 D27 وبعد الجراحة بعد الحقن في الوريد من تتالي ديكستران الأزرق 70 كيلو دالتون لتسليط الضوء على الأوعية الدموية. خط منقط: الهامش الورم في D27؛ السهام: مثال على الأوعية الدموية التي يمكن أن تستخدم لحصر المعالم نفس المنطقة في D16 D27 وباء. الخلايا السرطانية الفردية (الحمراء) غزو لحمة صحية المخ (الخلايا العصبية، أخضر) باستخدام الأوعية الدموية في شكل مصفوفة لغزو (السهام). وقد أخذت صور على عمق يتراوح 100-150 ميكرون تحت الجافية-المسألة. خط منقط: المنطقة التي نشأ فيها أدرك إعادة الإعمار متعامد يصور في لوحة مركز أسفل اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

هذا النهج يتيح استخدام أساليب التصوير الضوئي لرصد خلال الأيام والأسابيع نمو دبقي وهو مزروع orthotopically. في وقت لاحق يمكن أن تخضع لنفس الحيوان تقريبا أي طريقة تصوير الدماغ خلال علم الأمراض؛ بعد إعداد محددة اثنين من الفوتون المجهري يوفر فرصة فريدة لتحقيق قرار التحت خلوية داخل الدماغ من الحيوانات الحية. يقدم بروتوكول لدينا ميزة لفرض نمو الورم الدماغي في لحمة وليس خارج durally كما يحدث إذا الخلايا دبقي يمكن أن تترك الجهاز العصبي المركزي من خلال الجافية التالفة. في غياب القيود الجسدي من قبل البيئة الدماغ المبذولة، يمكن أن الخلايا السرطانية تتكاثر في الواقع أسرع لأنها لا تحتاج إلى التسلل لحمة ^16. لم الأساليب المنشورة سابقا لا محاولة لاغلاق الأم الجافية بعد التطعيم الذي كان جميع أكثر إشكالية مما حقن تعليق الخلايا بدلا من الأجسام الشبه الكروية^9،13،14. تعليق الخلايا من المستحيل تطبيق الوزراء البريطانى كما هي المصنفة الخلايا الفردية بصورة منهجية على طول الجهاز حقن عندما سحب ماصة من عمق لالجافية-ماتر الواقع.

البروتوكول الحالي يمكن تطبيقها على سلالات الفئران المعدلة وراثيا بما في ذلك مختلف والحيوانات كبت المناعة. مختلف خطوط الخلايا دبقي يمكن المطعمة وتصور، بما في ذلك الخلايا المشتقة مباشرة من الخزعات الإنسان طالما أنها و transfected للتعبير ثابت مراسل التطعيم قبل الفلورسنت. بروتوكول الجراحية يمكن عادة يؤديها في 1 ساعة ويمكن الحصول عليها بسرعة أفواج من الحيوانات. يمكن بالتالي هذا النهج أن تستخدم لدراسة إعادة تشكيل الأوعية الدموية، وآثار العلاجات الدوائية على الأوعية الدموية ونمو الورم، فضلا عن تجنيد الخلايا المناعية داخل الورم. عند الحاجة دبقي الهجرة الخلية والتفاعلات الدينامية بين الخلايا دبقي والمكروية يمكن ملاحظتها في الوقت الحقيقي لعدة هوىروبية.

كما يمكن أن يتم التصوير على عمق 500 ميكرون فمن الممكن لتغطية معظم حجم الورم المزروع في البداية 200 ميكرومتر تحت الجافية-الأم. يجب اتخاذها لضمان رعاية خاصة عمق التصوير القصوى أثناء الجراحة لخلق الاتصال الجسدي بين الأم الجافية، وساترة الزجاج. في الواقع هذا يقلل من تشكيل ندبا قد تضر إلا الوضوح البصري. وينبغي أيضا أن يلاحظ العقم المطلق للبيئة الجراحية للحد من الالتهاب بعد الجراحة أن يطمس عابر النافذة. على أي حال نحن ننصح أن تنتظر 15 يوما بين الجراحة والدورة الملاحظة الأولى للحصول على ظروف التصوير المثلى. بعد ذلك، تم العثور على النافذة لتبقى واضحة حتى سنة واحدة بعد الجراحة على صورية تعمل الحيوانات التي خضعت لبروتوكول كله ما عدا حقن الورم كروي.

في الختام، بروتوكول الموصوفة هنا يمثل تحسنا من أورت القائمةotopic نموذج دبقي الماوس مخصصة لالمزمنة حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري. حقن سطحية من الورم كروي، وانسداد حقن تتبع مع ربط عبر ديكستران هلام نصفي حبة وختم الأم الجافية، فرض تطور الورم في بيئة الدماغ الذي يلخص حقا القيود المادية التي تنظم عادة تطور المرض. ليس فقط هذه الطريقة سوف تخدم الدراسات الأساسية على دبقي الفيزيولوجيا المرضية ولكنها ستكون أيضا تحسين أهمية النتائج الدوائية خلال التجارب قبل السريرية.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر بحرارة الدكتور KK Fenrich الدكتور MC. أمووريوإكس، P. ويبر وA. JAOUEN لإجراء مناقشات مفيدة؛ M. حسين، C. منير، M. متولي، S. Bensemmane، J. Bonnardel، وموظفي مرفق الحيوانية في IBDML وموظفي منصة التصوير PicSIL في IBDML للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (إنكا-DGOS-INSERM6038) إلى GR، الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR JCJC PathoVisu3Dyn)، الاتحاد من أجل لا بحوث سور لو Cerveau (FRC) لFD، من خلال المنح الدراسية من الاتحاد دي لا بحوث ميديكال وCancéropole PACA إلى CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

الطب، العدد 86، ورم أرومي دبقي الأشكال، حيوي داخلي التصوير ثنائي الفوتون، نموذج حيواني، نافذة الجمجمة المزمن، وأورام الدماغ، والأورام العصبية.