Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Summary

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die aggressivste Form von Hirntumoren ohne heilende Behandlungen zur Verfügung zu halten.

Murine Modelle dieser Pathologie beruhen auf der Injektion einer Suspension von Gliomzellen in das Hirnparenchym nach Inzision der Dura mater. Während die Zellen oberflächlich injiziert zugänglich Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie zu sein, oberflächliche Injektionen nicht den pathophysiologischen Bedingungen zu rekapitulieren. In der Tat, auf der Flucht durch die Einspritztrakt meisten Tumorzellen zu erreichen, die extra-duralen Raum, wo sie in Abwesenheit von mechanischen Einschränkungen von Parenchym ungewöhnlich schnell zu erweitern.

Unsere Verbesserungen bestehen nicht nur in der fokal Implantieren eines Gliom Sphäroid anstatt Injizieren einer Suspension von Gliomzellen in den oberflächlichen Schichten der Hirnrinde, sondern auch ein Verstopfen der Injektionsstelle von einem vernetzten Dextran-Gel, halb Wulst, die zu der Umge geklebtding Parenchym und Dura mater mit Sekundenkleber verschlossen. Insgesamt sind diese Maßnahmen durchzusetzen, die physiologische Ausdehnung und Infiltration der Tumorzellen innerhalb der Hirnparenchym. Kraniotomie wurde schließlich geschlossen mit ein Glasfenster zementiert auf den Schädel, um chronische Bildgebung über Wochen in Abwesenheit von Narbengewebe Entwicklung zu ermöglichen.

Unter Ausnutzung der Fluoreszenz-transgene Tiere mit fluoreszierenden Tumorzellen haben wir gezeigt, dass die Dynamik der Wechselwirkungen zwischen Gliomzellen, Neuronen (z. B. Thy1-GFP-Mäuse) und Gefäßen (durch eine intravenöse Injektion eines fluoreszierenden Farbstoff markiert) auftreten, können durch intravitalen visualisiert gepfropften Zwei-Photonen-Mikroskopie während des Fortschreitens der Erkrankung.

Die Möglichkeit, Bild ein Tumor in mikroskopischer Auflösung in einem minimal beeinträchtigt Hirn Umwelt stellt eine Verbesserung der derzeitigen GBM Tiermodellen, die den Bereich der Neuro-Onkologie-und Drogentests profitieren sollte.

Introduction

Glioblastoma multiforme erscheint als die aggressivste Form von Hirntumoren bei Erwachsenen mit einer medianen Überlebens von 12 Monaten und einer 5-Jahres-Überlebensrate von 5%. Clinical Management setzt auf Operation, Bestrahlung und Chemotherapie häufig in Kombination verwendet. Die Wirkungen dieser Behandlungen bleiben jedoch palliative ^1-3.

Bis heute basieren die meisten neuro onkologischen Studien über Verfahren, die nur in der Lage sind, ein statisches Bild vermittelt und auf großen Kohorten von Tumor-tragenden Tieren durchgeführt geopfert zu verschiedenen Zeitpunkten (siehe beispielsweise ^4,5). Die jüngste Entwicklung der Folgeverfahren, die auf intravitalen Bildgebung ermöglicht das Studium Gliom Wachstum und die Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung pathophysiologischen auf demselben Tier im Laufe der Zeit. Dies eröffnet den Weg zu exklusiven Stück von Informationen, die bisher unerreichbar war ^6. Transgene Tiere ausdrücken fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse sein können aufd die spezifische Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und zB Neuronen in diesem Papier zu studieren.

Während des letzten Jahrzehnts, Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie ⁷ hat sich zu einem Standard in der Grundneuroonkologie Studien und präklinischen Studien ^8,9 für seine Fähigkeit, tief Intravital Beobachtung Gehirn der Maus durchführen (> 500 um unter die Dura mater) mit eine mikrometrischen räumlichen Auflösung ^10. Mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie mit orthotopical Tiermodellen mit einer chronischen Hirn Fenster ¹¹ implantiert, ist es möglich, die Tumorprogression im Laufe der Zeit auf der gleichen Maus ^9,12 folgen.

Einer der Hauptnachteile dieser vorveröffentlichten Tiermodell ist jedoch, daß sie die physikalischen Beschränkungen, die das Tumorwachstum regeln, die Dura mater wird nicht nach der Injektion der Zellsuspension ^9,13,14 abgedichtet nicht nachahmen müssen. Gliom-Zellen können in der Leckextraduralen Raum Transformation eines orthotopen Gliom-Modell in eine heterotope ein.

Das Tiermodell hier dargestellt, besteht in der Injektion eines Sphäroids fluoreszierender Gliomzellen in der Hirnrinde bei einer Tiefe von 200 &mgr; m, gefolgt von der Abdichtung der Dura mater mit einer vernetzten Dextran-Gel-hemi-Wulst und histo-kompatible Kleber . Das Tumorwachstum wird dann in das Hirnparenchym, die pathophysiologischen physikalischen Beschränkungen hält beschränkt. Eine chronische Glasfenster über dem Tumor implantiert ermöglicht einen einfachen optischen Zugang für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie. Mit transgenen Tiere exprimieren fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse ist es möglich, ein Follow-up der Gliom-Wachstum im Laufe der Zeit durchzuführen und seine Interaktion mit seiner Mikroumgebung (hier mit Neuronen und Gefäßsystem mit fluoreszierenden Dextranen hervorgehoben) zu studieren.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Gesetzgebung Französisch und in Übereinstimmung mit der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Forschung an Tieren wurde von der Direction des services Départementale Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (Lizenz-D-13-055-21) zugelassen und wird von der Ethikkommission der Provence Côte d'Azur n ° 14 (Projekt 87-04122012) zugelassen .

1. Spheroids Vorbereitung

1. Herstellung von Agarose-beschichteten Petrischalen
   1. Mischen 1 g Agarose mit 100 ml Zellkulturmedium mit fötalem Rinderserum. Verwenden Sie eine Mikrowelle (850 Watt für 40 Sekunden, dann 3 x 15 sec; rühren Sie die Lösung zwischen den einzelnen Mikrowellen Sitzung), um die Lösung zu kochen und um die Agarose vollständig zu lösen. Autoklavieren 1% Agarose-Lösung für 20 min bei 120 ° C zu gewährleisten, Steri. keit Hinweis: Achten Sie darauf, um die Agarose vollständig zu lösen, bevor der Autoklav-Protokoll. Inhomogenität kann die Bildung von Sphäroiden beeinträchtigen.
   2. Sobald aus dem Autoklaven abgerufen gießen 10 ml der 1% igen Lösung in 100 x 20 mm Petrischalen. Verlassen die Petrischalen 20 min lang bei Raumtemperatur, damit das 1% Agarose-Lösung zu verfestigen.
   3. 10 ml PBS über dem Agarose Feuchtigkeit zu halten. Verschließen Sie den Deckel der Agarose-beschichteten Petrischalen, indem Sie sie mit Parafilm um Verdunstung zu vermeiden. Petrischalen für bis zu 2 Monate bei 4 ° C gelagert, wenn sie richtig mit der PBS-Schicht befeuchtet werden.
2. Sphäroid-Kultur
   1. In einer 75 cm ^2-Kolben, die Kultur Gliom-Zellen in ihrer empfohlenen Medium als Monoschicht.
   2. Ersetzen der PBS aus einer 1%-Agarose-beschichteten Petrischale mit 1,5 ml "vorkonditioniert mittel" von den Kolben mit dem 2D-Gliom-Zellmonoschicht gesammelts.
   3. Entfernen des Mediums aus den Kolben mit dem 2D-Monoschicht von Gliomzellen.
   4. Die Monoschicht vorsichtig spülen mit 10 ml PBS.
   5. 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung und Inkubieren der Kolben 4 min bei 37 º C Anmerkung: Die Inkubationszeit kann je nach der verwendeten Zelllinie variieren.
   6. In 8 ml Kulturmedium, um die Wirkung von Trypsin zu stoppen, sanft spülen Sie die Zellsuspension. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht in die Luft in der Zellsuspension zu spülen, wie es Zelltod erhöht.
   7. Setzen 6 ml der Zellsuspension in einem sterilen Fläschchen.
   8. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 4 min bei 800 Umdrehungen pro Minute.
   9. Entfernen des Überstandes und sanft auszusetzen das Zellsediment in 3 ml Kulturmedium.
   10. Samen der Zellsuspension in die vorbereitete Agarose-beschichteten Petrischale.
   11. Setzen Sie die Petrischale bei 37 ° C in einem 5% CO _{2-Atmosphäre} für 2 bis 3 Tage, bis Sphäroiden gewünschten Durchmesser gebildet werden.
2. Sphäroid-und Fenster-Implantation
1. Herstellung des Einspritzsystems
   1. Rein Glaskapillaren (1 mm im Durchmesser) durch Beschallung in 70% Ethanol für 10 min. Zwei Mal mit Wasser vor Platzierung innerhalb eines Inkubators, bis sie trocken spülen.
   2. Ziehen Sie mehrere gereinigte Glas Kapillaren mit einer Pipette Puller, um einen kleinen Vorrat vorzubereiten.
   3. Brechen die Spitze der Kapillare gezogen durch Kratzen der Extremität auf einem Papiertuch, um eine abgeschrägte Ende der gewünschten Größe zu erhalten: in der Regel einen Außendurchmesser von 300-350 &mgr; m und einem Innendurchmesser von 250-300 &mgr; m. Während dieser Formgebungsverfahren, steuern die Durchmesser der Kapillare mit einem Makroskop deren Okular mit einem abgestuften Mira ausgestattet.
   4. Verbinden des nicht abgeschrägten Ende der Kapillare mit einem 3-Wege-Verteiler mit einem Stück Kunststoffschlauch, dessen Innendurchmesser entspricht dem Außendurchmesser der Kapillare.
   5. Mit Kunststoff Tubing, verbinden die beiden anderen Möglichkeiten, den Verteiler ein 25 &mgr; l Mikroliter-Spritze und einer 1 ml Spritze mit histo-kompatiblen Mineralöl beladen.
   6. Stellen Sie die vielfältigen Wahlschalter auf einen Weg zwischen der Mikroliter-Spritze und dem 1 ml Spritze zu etablieren. Entfernen der Kolben des Mikroliter-Spritze aufgezogen und Mineralöl rückwärts in Mikroliter-Spritze, bis er austritt, indem der Kolben der 1 ml Spritze. Ersetzen Sie den Kolben der Mikroliterspritze, während die Betreuung keine Luftblasen in der Röhre zu verlassen.
   7. Stellen Sie die vielfältigen Wahlschalter auf einen Weg zwischen der Kapillare und der 1-ml-Spritze zu etablieren. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl, bis es aus Lecks von der Spitze, während die Betreuung keine Luftblasen in der Röhre zu verlassen.
   8. Einstellen der Verteiler Selektor, um eine Verbindung zwischen der Mikroliterspritze und der Kapillare zu schaffen. Auszustoßen etwa 10 &mgr; l Mineralöl.
   9. Tauchen Sie die Kapillare Spitze in PBS-Lösungund mit Hilfe der Gradmesser für die Mikroliter-Spritze, saugen in 5 ul PBS in der Kapillare. Beachten Sie, dass der Meniskus zwischen Öl und PBS ist deutlich sichtbar.
   10. Befestigen Sie die Kapillare auf einem 3-Achs-Mikromanipulator Montage unter der Operation Makroskops. Dieses System wird verwendet, um die Kapillarwirkung an der Injektionsstelle unter Sichtkontrolle zu zielen.
2. Sphäroid-Implantation
   1. Die Maus leicht sedieren durch Inhalation von Isofluran in einem Induktionskammer (1,5% in Luft während 1 bis 1,5 min).
   2. Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin / Xylazin (120 mg / kg, 12 mg / kg). Beachten Sie, dass der Anästhesie die Körpertemperatur des Tieres verringert oft. Es wird empfohlen, mit der Operation in einem Raum bei 26 ° C gehen und das Tier warm, mit einer darunter liegenden temperaturgeregelten Heizkissen halten.
   3. Augensalbe anwenden, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
   4. Rasur der Kopfhaut des Tieres.
   5. Ortdas Tier in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars und ein Mundstück.
   6. Reinigen Sie die Haut mit Povidon-Iod (3% Seife, dann 10% Lösung).
   7. Einen 1 cm langen Schnitt in Längsrichtung in der Mitte der Kopfhaut mit einem Skalpell. Mit einer Schere schneiden und entfernen Sie die Haut oberhalb der Scheitelbeine.
   8. Mit einem Skalpell vorsichtig die Knochenhaut über dem Schädel. Cyanacrylat Großzügig auf dem Knochen, um eine raue Oberfläche für später Zement Treue zu erzeugen.
   9. Bohren Sie das Scheitelbein unter einem chirurgischen Makroskops um eine Kraniotomie von 4 mm Durchmesser zu erzeugen. Großzügig hinzufügen eiskaltem PBS mit Pencillin (1.000 U / ml) und Streptomicin (1 mg / ml) während des gesamten Verfahrens zur Erwärmung zu verhindern. Entfernen Sie die kleine Knochenfragmente mit einer Zange und einem nassen steriler Gaze. Achten Sie darauf, mindestens 1 mm vom parietalen Schädelnähte zu vermeiden, Blutungen zu bohren.
   10. Dünn der Knochen an der Grenze der Kraniotomie, wo die Glasfenster verschlossen werden. Ziel ist es, eNsure später ebenen Positionierung der Glasscheibe mit einer maximalen Kontaktfläche zwischen dem Gehirn und dem Glas. Entfernen Sie langsam den Knochen mit einer Pinzette und reinigen Sie die freiliegenden Dura mater mit der PBS-Lösung.
   11. Nehmen Sie einen runden Glasdeckglas 5 mm Durchmesser, reinigen Sie es mit Alkohol und trocknen Sie sie mit Seidenpapier. Versuchen Sie, das Deckglas als Deckel für die Kraniotomie verwenden und bestätigen, dass eine große, flache Oberfläche des Gehirns in Kontakt mit dem Glas bekommt. Bei Bedarf entfernen Sie das Deckglas auf die Seiten weitere dünne Knochen. Gehen Sie, bis das Gehirn kann flach zusammengedrückt, wenn sanft Druck auf das Deckglas einmal an Ort und Stelle zu bekommen.
   12. Reinigen Sie wieder das Deckglas mit Alkohol, trocknen Sie sie mit Seidenpapier, und speichern Sie sie auseinander.
   13. Mit einer 26-Gauge-Nadel ein Loch in der Dura mater in der Mitte der Schädel noch vermieden Hauptblutgefäße. Achten Sie darauf, nicht die Hirnparenchym als Zweck dieses Schrittes beschädigt wird, nur um die Dura mater zu öffnen.
   14. Reinigen Sie die Dura mater-with PBS-Lösung zu hämorrhagischen Blut zu entfernen. Abdeckung mit einem Stück Seidenpapier während der Vorbereitung der Injektion Sphäroid.
   15. Mit dem Sphäroid Einspritzsystem in Schritt 2.1 hergestellt, saugen einen runden Sphäroid Montage des kapillaren Innendurchmesser (ungefähr 200-250 &mgr; m) aus der Petrischale in Schritt 1.2 hergestellt. Sphäroid sollte die zusammen mit rund 5 ul Kulturmedium. Es sollte bis in die Spitze der Kapillarwirkung unter seinem Gewicht fallen.
   16. Entfernen Sie die nasse Seidenpapier verwendet, um die Kraniotomie decken und die Position des Tieres unter dem Einspritzsystem.
   17. Senken Sie die Injektionspipette, bis sie das Loch in der Dura mater gemacht berührt. Dann senken Sie es wieder von 250 um. Warten Sie 30 Sekunden.
   18. Spritzen Sie das Sphäroid mit dem Kolben der Mikroliterspritze (2-3 ul), während das Pumpen Sie das überschüssige Flüssigkeit mit einem dünnen Stück Seidenpapier. Warten Sie 30 Sekunden und dann sanft heben Sie die Injektionspipette um 50 um in Richtung der Oberfläche. Warten Sie erneut 30 sec und repeat die Hebevorgang von den Schritten von 50 &mgr; m bis zur Oberfläche. Wartezeiten vermeidet Extraktion des Sphäroiden, die mit der Pipette haften würde.
   19. Bestätigen das Vorhandensein des Sphäroids im Gehirn unter Verwendung eines Fluoreszenz-Makroskop.
   20. Mischen 100-300 um Durchmesser vernetztes Dextran-Gel-Perlen mit PBS-Lösung in einer Petrischale. Warten 1min und Fisch einige hydratisierten Perlen. Legen Sie sie auf den Knochen neben dem Kraniotomie.
   21. Unter makroskopischen Steuer, wählen Sie eine Perle mit einem Durchmesser ähnlich der Größe der Dura mater-Öffnung. Schneiden Sie das vernetzte Dextran Gelkügelchen in zwei Hälften mit einer Pinzette.
   22. Sanft legte ein vernetztes Dextran-Gel Hemi-Perle in die Injektionsbohrung mit der konvexen Seite in Richtung der Sphäroid. Achten Sie darauf, das Sphäroid, und drücken Sie leicht nach unten zu entfernen, bis die Grenze der konkaven in Kontakt mit der umgebenden Dura mater zu erhalten.
   23. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf einem Glasträger; Tauchen Sie die Spitze eines Zahnstochers in die drop eine kleine Menge von Klebstoff zu nehmen. Dichtung schnell die Kanten des vernetzten Dextran-Gel Hemi-Wulst an der benachbarten Dura mater durch Stanzen Kleber an. Achten Sie auf eine schnelle und präzise Bewegungen, um zu verhindern Verkleben der vernetzten Dextrangel Hemi-Wulst zum Zahnstocher durchzuführen. Vermeiden Sie Überschuß von Leim, zu verbreiten und behindern kann, wenn nicht zu verhindern, Bild einmal getrocknet. Warten Sie 2 min für den Leim trocknen und reinigen Sie den Kraniotomie und den umgebenden Knochen mit PBS-Lösung.
3. Fenster-Implantation
   1. Setzen Sie die 5 mm Durchmesser rund Deckglas über der Kraniotomie (siehe 2.2.12). Die Ränder des Deckglases muss mit dem ausgedünnten Schädel an der Außenseite des Schädel sein. Das Deckglas ist in Kontakt mit der Dura mater und der Knochendünnt auf den Kanten. Es ist sehr wichtig, einen direkten Kontakt zwischen der Dura mater und dem Deckglas haben sonst kann Narbengewebe entwickeln und behindern optische Klarheit.
   2. Mit einem Gewebe, absorbieren die PBS auf the Deckglas, so dass die Kanten-Lösung nicht vollständig decken die Kraniotomie bei Anlegen einer kleinen Druck in der Mitte des Deckglases. Dadurch wird sichergestellt, dass der Knochen-, Glas-und Gehirn gemeinsam auf der Seite des Bereichs von Interesse verklebt.
   3. Halten Sie einen kleinen Druck auf der Mitte des Deckglases mit einer Pinzette vorsichtig, während die Anwendung Cyanacrylat an der Grenze zwischen dem Knochen und dem Deckglas. Der Kleber spontan, bis die Schnittstelle mit PBS-Lösung verteilt. Lösung als Barriere aufgrund der Hydrophobie des Klebstoffs dienen. Dicht sollten wirksam in weniger als einer Minute, aber nehmen einen extremen darauf, nicht die Deck bewegen, bis es behoben ist. Dies würde sonst in Sekunden Leckage auf die Dura mater damit zu einem Scheitern der Operation führen führen.
   4. Im Falle würde Kleber auf dem Glas ausgebreitet haben, entfernen Sie sie mit einem Mikro-Skalpell, indem Sie Spiralbewegungen, wie es sonst optische Klarheit zu verringern. Achten Sie nicht auf das Deckglas Durin brecheng das Verfahren wegen zu hoher Druck.
   5. Konsolidieren des Glasfixierungs indem Zahnzement an den Kanten des Deckglases in Richtung der benachbarten Schädel. Stellen Sie sicher, die ganze Schädel ausgesetzt, bis die Kopfhaut bedecken. Mit Extra-Zement, aufzubauen Seitenwände rund um das Deckglas auf den Pool für das Eintauchen des Ziels erforderlich erstellen. Der Zahnzement wird in weniger als 10 min zu härten.

3. Post-operative Pflege und Vorbereitung für Imaging

1. Post-operative Betreuung
   1. Entfernen Sie die Maus von der stereotaktischen Rahmen, injizieren Dexamethazon (0,2 mg / kg) und Rimadyl (5 mg / kg) sc in den Beckenregionen und legen sie in einen Käfig mit einem warmen Gewebe-Nest.
   2. Überwachen Sie die Tier, bis die Auswirkungen der Narkose sind verschwunden. In der Regel 2 bis 3 Stunden nach der Operation, sind Mäuse voll mobil. Stellen Sie sicher, dass das Tier hat einen einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser. Geben Sie das Tier mit Agarose, die Glukose (Agarose3% Glucose 3%).
   3. Überwachung der Tiergewicht täglich und injizieren Dexamethazon (0,2 mg / kg) und Rimadyl (5 mg / kg) sc für die erste 10d nach der Operation. Aus ethischen Überlegungen, die Mäuse einschläfern, wenn ein Verlust von mehr als 15% seines ursprünglichen Gewichts. Hirndruck steigt mit der Größe des Tumors, die zu motorischen Beeinträchtigungen für das Tier. Dies ist abhängig von Tumorzelllinie und tritt bei verschiedenen Verzögerungen nach der Operation. Besondere Vorsicht ist geboten, um den Endpunkt des Experiments mit der verwendeten Zelllinie zu charakterisieren.
2. Vorbereitung für die Bildgebung
   1. Die Maus leicht sediert durch Inhalation von Isofluran in einer Induktionskammer (1,5% in Luft für 1 bis 1,5 min).
   2. Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin / Xylazin (100 mg / kg, 10 mg / kg). Eine solche Betäubung erlaubt in der Regel 45 Minuten der Beobachtung. Um mehr Imaging-Sitzungen durchführen, wird der Maus unter Dauer Inhalation von Isofluran in platziertLuft (0,25 bis 0,75%).
   3. Augensalbe anwenden, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
   4. Setzen Sie das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen und blockieren die Schädel mit den earbars.
   5. Um die Darstellung von Blutgefäßen, kann ein fluoreszierender Farbstoff intravenös injiziert werden.
   6. Wenn das Fenster erscheint schmutzig, kann es durch sanftes Entfernen der Fremdkörper mit einer dünnen Klinge und der Ecke eines Gewebe gereinigt werden. Verwenden Sie keinen Alkohol, um das Fenster zu reinigen, da es nicht immer mit Zahnzement kompatibel und unter dem Fenster das Gehirn kühlen.

Representative Results

Sobald die chirurgische Protokoll ist (Fig. 1) durchgeführt wird, Tieren kann mittels Fluoreszenzmikroskopie über Wochen bis zur Tötung beobachtet werden. Eine entzündliche Reaktion kann nach der Operation, die in ein bis zwei Wochen verschwindet beobachtet werden. Tumorwachstum kann durch verschiedene Techniken, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie makroskopische und Zwei-Photonen-Mikroskopie (Fig. 2) beobachtet werden. Beispiel hier gezeigten Bilder wurden auf einem Fluoreszenz Makroskops und einem Zwei-Photonen-Mikroskop zu einem Femtosekunden Infrarot abstimmbaren Laser und haus modifiziert werden, um Tier Positionierung unter dem 20X Wasserimmersionsobjektiv (1.0NA) erlauben gekoppelt realisiert.

Die Tumorentwicklung wurde im Laufe der Zeit mit Hilfe eines Fluoreszenz Makroskops Kombination schräge Beleuchtung für Hellfeld Reflexions Bildgebung und Epi-Fluoreszenz-Emission (Fig. 2A-2C) geschätzt. Schwellenwert der Fluoreszenz gibt Zugang zu Tumorbereich leicht während superficial Gefäßsystem zu lösen als dunkle Strukturen aus dem weißen Hintergrund des sichtbaren Lichtbild. Auf der anderen Seite der Intravital-zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht z-Schnitte und Rekonstruktionen von orthogonalen große Sichtfelder mit subzellulärer Auflösung (siehe Dendriten in 2D). Verwendung von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierenden Proteine ​​in Zellen von Interesse (zB Thy1-GFP-Mäuse, die den Cyan Fluorescent Protein in Neuronen exprimieren, grün Pseudofarb in Fig. 2D), ist es möglich, die Tumorprogression im neuronalen Mikroumgebung zu beobachten. Es muss jedoch angemerkt, dass die Tumorzelldichte kann die Photonen Eindringtiefe sowie der emittierten Photonendetektion durch erhöhte Diffusion zu begrenzen. Dies ist deutlich in Fig. 2D ersichtlich, wie die räumliche Auflösung beginnt bei 200 &mgr; m unter der Dura-Material in den Tumor zu verringern, aber nicht im gesunden Hirnparenchym. Darüber hinaus ist die Erzeugung der zweiten Harmonischen Signal her, die sichm organisierten Mustern von nicht-centrosymetric Moleküle wie Typ I und III Kollagen eine Signatur der Dura mater (Cyan Pseudofarb in Fig. 2D und Pfeile). Es ist zu beachten, dass mit den chirurgischen Protokoll, wächst der Tumor unter der Dura mater in das Hirnparenchym, wo seine Entwicklung wird durch die physikalischen Beschränkungen des Gehirns unterliegen. Die Abdichtung der Dura mater mit einer vernetzten Dextran-Gel, halb Wulst verhindert das Entweichen von Gliom-Zellen in der extradural Raum.

Wenn durch Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie folgte der Tumorprogression zwischen verschiedenen Zeitpunkten können auf zellulärer Auflösung verglichen werden. Imaging der gleichen Gegend bei D16 und D27 nach der Operation (3A) fanden wir einige Blutgefäße wie die von Pfeilen, die über einen Zeitraum von 11 Tagen stabil waren hervorgehoben; auf der anderen Seite der Tumor vor deutlich in das gesunde Parenchym im gleichen Zeitraum infiltriert. Bis zur Tumorprogression, seine ma bewertenrgin bei D27 beobachtet wurde, mit einem gelben gestrichelten Linie skizziert und auf dem Bild bei D16 genommen überlagert. A 520 um Verschiebung der Vorderkante wurde konsequent mit der berichteten proliferative Profil des GL261 Gliom-Modell ¹⁵ beobachtet. Die Muster der Gefäßnetz im Tumor waren sehr unterschiedlich auf D16 und D27 die anzeigt, dass signifikante vaskulären Remodelling bei pathologischen Bereiche (3A) auftritt. Bei den Tumorrändern fanden wir auch Fälle von Gliom-Zellen aus dem Tumor Abnehmen Kern aus einem invasiven Tumor erwartet. Die mikroskopische Auflösung unserer Bilder zeigten nicht nur, dass diese Zellen emittieren zytoplasmatischen Vorsprünge, die Umwelt zu spüren, sondern auch, dass sie die Blutgefäße als Matrix für die Progression (Pfeilspitzen und z-Rekonstruktion in 3B) verwenden können. Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht somit die zelluläre Interaktionen in einer wirklich physiologischen Kontext zu studieren. Mit Hilfe von transgenen Tieren, wobei jede Zelle Bevölkerung von Interesse istdurch sein eigenes fluoreszierendes Reporter wird es möglich, das Vorhandensein von physikalischen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung als wichtige Regulatoren der Krankheitsprogression (3B, rechts) zu identifizieren.

1. Übersicht der Operation. Kraniotomie auf der linken Scheitelbein (A) durchgeführt. Die Grenzen des linken parietalen Knochen mit einer gestrichelten Linie umrissen und der entfernte Teil wird gelb (B) gefüllt. Sobald die Kraniotomie geführt wird, die parietalen Kortex ausgesetzt (C), wird der Bereich für die Injektion des Sphäroids ausgewaehlte Hauptblutgefäße (Pfeil in D) und ein 26-Gauge-Nadel verwendet wird, um die Dura mater zu öffnen (zu vermeiden Pfeil in E). Das Sphäroid istinjiziert und das Loch in der Dura mater durch ein vernetztes Dextran-Gel Hemi-Perle mit Sekundenkleber (Pfeil F) abgedichtet ist verstopft. Ein Deckglas wird auf den Knochen aufgeklebt, während Kontakt mit dem Gehirn. Das Deckglas ist ferner auf der freiliegenden Schädel geklebt langfristig solide Befestigung des Schädelfenster für chronische Beobachtungen (GI) zu gewährleisten. Das gesamte Protokoll wird kurz in J schematisiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Das Tumorwachstum wird dem Hirnparenchym beschränkt und kann im Laufe der Zeit. AC überwacht werden. Das Tumorwachstum (GL261 Zelllinie, die DsRed2) durch m beobachtetacroscopy am Tag der Operation (DO, A) und an den Tagen 21 (B) und 27 (C). Die Pfeilspitze in C hebt einen Rückgang von Zahnzement, die nicht in Schritt 2.3.5. D entfernt wurde. Orthogonal Rekonstruktionen aus einem 3 x 3 Feld von 0 bis 300 um unter die Dura mater in einer Thy1-CFP Maus, die eine GL261 Tumors durch Zwei-Photonen-Mikroskopie bei D20 nach der Operation erworbene erhalten. Tumor (rot), durch Erzeugung der zweiten Harmonischen (Pfeile, Cyan) und Neuronen (grün) beobachtet Dura mater. Beachten Sie, dass der Tumor wächst unter der Dura mater in das Hirnparenchym. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

3. Vascular Umbau und Invasion von Tumorzellen im Laufe der Zeit mit zellulären räumliche Auflösung von Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet werden. A. GL261 Tumor (rot) beobachtet bei D16 und D27 nach der Operation nach einer intravenösen Injektion von Cascade-blau Dextran 70 kDa, die Blutgefäße zu markieren. Gepunktete Linie: Tumor-Marge bei D27; Pfeile: Beispiel der Blutgefäße, die als Landmarken verwendet werden können, um die gleiche Fläche in D16 und D27 B lokalisieren.. Einzelne Tumorzellen (rot) dringen in das gesunde Hirnparenchym (Neuronen, grün) mit Blutgefäßen als Matrix für die Invasion (Pfeilspitzen). Bilder wurden in der Tiefe von 100 bis 150 &mgr; m unterhalb der Dura Stands entnommen. Gepunktete Linie:. Bereich, wo die orthogonal Wiederaufbau in der unteren Mittelkonsole dargestellt realisiert Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Dieser Ansatz ermöglicht die Verwendung von optischen bildgebenden Verfahren zu überwachen, über Tage und Wochen das Wachstum einer orthotop Gliom implantiert. Das gleiche Tier kann anschließend im Verlauf der Pathologie zu praktisch jeder Hirnbildgebungsverfahren unterzogen werden; noch die Zwei-Photonen-Mikroskopie spezifische Vorbereitung bietet die einmalige Gelegenheit, subzellulärer Auflösung im Gehirn des lebenden Tieres zu erreichen. Unser Protokoll bietet den Vorteil, das Tumorwachstum in Hirngewebe und nicht als Extra-durally durchzusetzen, wie es geschieht, wenn Gliom-Zellen können das zentrale Nervensystem durch die beschädigte Dauer verlassen. In Abwesenheit von körperlichen Einschränkungen, die durch das Gehirn Umfeld ausgeübt wird, können Tumorzellen vermehren sich zwar schneller als die sie nicht brauchen, um die ¹⁶ Parenchym infiltrieren. Die bisher veröffentlichten Methoden nicht versuchen, die Dura mater nach der Transplantation, die umso problematischer, als sie Suspension von Zellen eher als Kügelchen injiziert war versiegeln^9,13,14. Suspensionen von Zellen sind in der Tat unmöglich, fokal gelten als Einzelzellen systematisch entlang der Einspritztrakt ausgesät beim Herausziehen der Pipette aus der Tiefe an die Dura mater.

Das aktuelle Protokoll kann auf verschiedenen Mausstämme mit transgenen und immunsupprimierten Tieren angewendet werden. Verschiedene Gliomzelllinien gepfropft und visualisiert, einschließlich menschlichen Zellen, die direkt aus Biopsien abgeleitet sind, solange sie stabil transfiziert sind eine fluoreszierende Reporter vor Transplantation exprimieren. Chirurgisches Protokoll kann in der Regel in 1 Stunde durchgeführt werden und Kohorten von Tieren kann schnell erreicht werden. Dieser Ansatz kann somit zur vaskulären Umbau, die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlungen auf die Angiogenese und das Tumorwachstum sowie die Rekrutierung von Immunzellen in den Tumor zu untersuchen. Bei Bedarf Gliom-Zellmigration und dynamischen Wechselwirkungen zwischen Gliomzellen und der Mikroumgebung in Echtzeit für mehrere Hou beachtenrs.

Wie Bildgebung kann über Tiefen von 500 um durchgeführt werden ist es möglich, decken die meisten Tumorvolumen implantiert zunächst 200 um unter die Dura mater. Um sicherzustellen, dass die maximale Bildtiefe besondere Vorsicht während der Operation getroffen werden, um körperlichen Kontakt zwischen Dura mater und dem Deckglas zu erstellen. Dies reduziert in der Tat die Bildung von Narbengewebe, die sonst beeinträchtigt würde optische Klarheit. Absolute Sterilität der chirurgischen Umgebung ist auch zu beachten, um die postoperative Entzündung, die vorübergehend verwischt die Fenster beschränken. Wir raten trotzdem zu 15 Tage warten zwischen der Operation und dem ersten Beobachtungssitzung, um eine optimale Abbildungsbedingungen zu erhalten. Danach wurde festgestellt, klare Fenster bis zu einem Jahr nach der Operation auf scheinoperierten Tieren, die das ganze Protokoll außer der Injektion der Tumor Sphäroid zogen bleiben.

Im Ergebnis der hier beschriebenen Protokoll stellt eine Verbesserung der bestehenden orthotopic Gliom Mausmodell zu chronischen Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie gewidmet. Die oberflächliche Injektion von Tumor Sphäroid, die Verstopfung des Einspritz Spur mit einer vernetzten Dextran-Gel-hemi-Wulst und der Dichtung der Dura mater durchsetzen Tumorentstehung im Gehirn Umgebung, die wirklich faßt die physikalischen Beschränkungen normalerweise über Krankheitsprogression. Nicht nur diese Methode grundlegenden Studien über Gliome Pathophysiologie dienen, sondern es wird auch die Bedeutung der pharmakologischen Ergebnisse bei präklinischen Studien zu verbessern.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren herzlich danken Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. und A. Weber Jaouen für hilfreiche Diskussionen; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, die Mitarbeiter der Tierhaltung bei IBDML und das Personal der PicSIL Imaging-Plattform an IBDML für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) an GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche unterstützt sur le Cerveau (FRC) auf FD, durch Stipendien von der Fédération de la Recherche Médicale und Cancéropôle PACA CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

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