Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

Summary

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Abstract

multiforme glioblastoma (GBM) הוא הצורה האגרסיבית ביותר של גידולים במוח ללא טיפולים מרפאים זמינים עד כה.

מודלים Murine של פתולוגיה זו מסתמכים על הזריקה של השעיה של תאי גליומה לתוך המוח parenchyma הבא חתך של הדורה-מאטר. ואילו התאים צריכים להיות מוזרקים באופן שטחי להיות נגיש לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital, זריקות שטחיות לא מצליחות לשחזר את תנאי physiopathological. ואכן, שנמלט דרך מערכת ההזרקה רוב התאים הסרטניים מגיעים לשטח הנוסף, שבו הם dural להרחיב מהירים באופן חריג בהעדר אילוצים מכאניים מparenchyma.

השיפורים שלנו מורכבים לא רק בfocally השתלה אליפטית גליומה במקום הזרקת השעיה של תאי גליומה בשכבות השטחיות של קליפת המוח, אלא גם בסתימת אתר ההזרקה על ידי חמי חרוז ג'ל dextran צולבים כי הוא דבוק לsurrounparenchyma דינג ואטום לדורה מאטר-עם cyanoacrylate. בסך הכל אמצעים אלה לאכוף את הרחבה וחדירה הפיזיולוגיות של התאים הסרטניים בתוך parenchyma המוח. Craniotomy סופו של דבר סגרה עם חלון זכוכית ביצרו לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות בהעדר התפתחות רקמת צלקת.

ניצול של בעלי חיים מהונדסים ניאון מורכב עם תאים סרטניים ניאון שהראינו שהדינמיקה של אינטראקציות המתרחשות בין תאי גליומה, תאי עצב (למשל עכברי Thy1-CFP) וכלי דם (מודגש על ידי הזרקה תוך ורידית של צבע פלואורסצנטי) ניתן דמיינו ידי intravital שני פוטונים במיקרוסקופ במהלך ההתקדמות של המחלה.

האפשרות לתמונה ברזולוציה גידול מיקרוסקופית בסביבת מוחין בסכנה מינימאלית מהווה שיפור של מודלים של בעלי החיים GBM הנוכחיים שאמור להועיל לתחום נוירו אונקולוגיה ובדיקות סמים.

Introduction

multiforme glioblastoma מופיע כצורה האגרסיבית ביותר של גידול במוח במבוגרים עם חציון הישרדות של 12 חודשים ושיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 5%. ניהול קליני מסתמך על ניתוח, הקרנות וכימותרפיה משמשת לעתים קרובות בשילוב. עם זאת, ההשפעות של טיפולים אלה יישארו פליאטיבי ^1-3.

עד כה, רוב מחקרי נוירו אונקולוגיה מסתמכים על טכניקות כי הם רק מסוגלים לספק תצוגה סטטית ובוצעו על קבוצות גדולות של בעלי חיים הנושאים גידול הקריבו בזמן נקודות שונות (ראה, למשל, ^4,5). הפיתוח האחרון של שיטות מעקב המבוססים על ההדמיה intravital מאפשר לימוד צמיחת גליומה ויחסי הגומלין בין תאים סרטניים והמיקרו pathophysiological על אותו בעלי החיים לאורך זמן. זו פותחת את הדרך ליצירה בלעדית של מידע שהייתה בלתי ניתן להשגה עד כה ^6. בעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין עשויים להיות שימושד ללמוד אינטראקציות ספציפיות בין תאים סרטניים ותאי עצב לדוגמא במאמר זה.

במהלך העשור האחרון, שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital ⁷ הפך לסטנדרטי במחקרי נוירו אונקולוגיה בסיסיים וניסויים פרה ^8,9 ביכולתה לבצע תצפית intravital עמוקה של מוח עכבר זהב (> 500 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-) עם רזולוציה מרחבית micrometric ^10. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים intravital עם מודלים של בעלי החיים orthotopical המושתלים עם חלון גולגולתי כרוני ^11, ניתן לעקוב אחר התקדמות גידול לאורך זמן באותו ^9,12 עכבר.

אחד החסרונות העיקריים של מודלים של בעלי החיים שפורסמו בעבר אלה הוא, עם זאת, הם לא מחקים את המגבלות פיזיות הקובעים את צמיחת גידול כדורה מאטר, אינו אטום לאחר ההזרקה של ההשעיה תא ^9,13,14. תאי גליומה עלולים לדלוף בחלל extradural הפיכת מודל גליומה orthotopic לאחד heterotopic.

מודל החיה המוצג כאן מורכב בהזרקה של אליפטית של תאי גליומה ניאון בקליפת המוח בעומק של 200 מיקרומטר ואחרי האיטום של הדורה מאטר, עם ג'ל, חמי חרוז dextran צולבים ודבק histo התואם . צמיחת הגידול מכן הוגבלה לparenchyma המוח ששומר על מגבלות פיזיות pathophysiological. חלון זכוכית כרונית המושתל מעל לגידול מאפשר גישה אופטית קלה עבור שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital. שימוש בבעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין זה ניתן לבצע מעקב של צמיחת גליומה לאורך זמן וללמוד את האינטראקציה שלה עם microenvironment (כאן עם נוירונים וכלי דם מודגשים עם dextrans ניאון).

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לחוק הצרפתי ובהתאם להוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86/609/EEC) לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. המחקר על בעלי חיים אושר על ידי הכיוון Départementale des שירותי Vétérinaires des בוש דו רון (רישיון D-13-055-21) ואושר על ידי הוועדה האתית של פרובנס קוט ד 'אזור n 14 ° (פרויקט 87-04,122,012) .

1. Spheroids הכנה

1. הכנת צלחות פטרי מצופה agarose
   1. מערבבים 1 גרם של agarose עם של מדיום תרבות תא 100 מיליליטר לא בתוספת סרום שור העובר. להשתמש בתנור מיקרוגל (850 וטס ל40 שניות, 3 x 15 שניות לאחר מכן; מערבב את הפתרון בכל מפגש בין מיקרוגל) לרתיחת הפתרון ולפרק את agarose לחלוטין. החיטוי פתרון agarose 1% זה עבור 20 דקות ב120 ° C כדי להבטיח steri. Lity הערה: תשמור על עצמך כדי לפזר את agarose לחלוטין לפני פרוטוקול החיטוי. Inhomogeneity עלול לסכן את היווצרות הספרואידים.
   2. , לקח פעם אחת מהחיטוי לשפוך 10 מיליליטר של פתרון agarose 1% ב100 x 20 מ"מ צלחות פטרי. השאר 20 דקות פטרי צלחות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר את פתרון agarose 1% כדי לחזק.
   3. הוסף 10 מיליליטר של PBS מעל agarose כדי לשמור על לחות. לאטום את המכסה של צלחות פטרי מצופה agarose ידי עטיפתם עם parafilm כדי למנוע אידוי. צלחות פטרי ניתן לאחסן לתקופה של עד 2 חודשים על 4 מעלות צלזיוס אם humidified כראוי על ידי שכבת PBS.
2. תרבות אליפטית
   1. ב75 סנטימטר ² בקבוק, תרבות תאי גליומה במדיום המומלץ שלהם כשכבה.
   2. החלף את PBS מאחד 1% צלחת פטרי מצופה agarose ידי 1.5 מיליליטר של "מדיום preconditioned" שנאסף מהבקבוק המכיל monolayer 2D של תאי גליומהs.
   3. הוצא את המדיה מהבקבוק המכיל monolayer 2D של תאי גליומה.
   4. לשטוף בעדינות את monolayer עם 10 מיליליטר של PBS.
   5. הוסף 2 מיליליטר של 0.05% מפתרון טריפסין / EDTA ו לדגור דקות בקבוק 4 ב 37 ° C. הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם לשורת התא בשימוש.
   6. הוסף 8 מיליליטר של מדיום התרבות להפסיק את הפעולה של טריפסין, בעדינות לשטוף את ההשעיה תא הערה:. יש להיזהר שלא לשטוף את האוויר בהשעית התא כפי שהוא מגביר את המוות של תאים.
   7. שים 6 מיליליטר של ההשעיה התא בבקבוקון סטרילי.
   8. צנטריפוגה 4 דקות הבקבוקון ב800 סל"ד.
   9. הסר את supernatant ועדינות להשעות את משקע התאים ב 3 מיליליטר של מדיום התרבות.
   10. זרעי ההשעיה התא בצלחת פטרי מצופה agarose מוכן.
   11. שים את צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO _{2 למשך} 2 עד 3 ימים עד הספרואידים של קוטר רצוי נוצרים.
2. השרשה אליפטית וחלון
1. הכנה של מערכת ההזרקה
   1. נימי זכוכית נקייה (1 מ"מ קוטר) על ידי sonicating ב70% אתנול ל10 דקות. יש לשטוף פעמיים עם הצבת לפני מים בתוך חממה עד יבש.
   2. משוך כמה נימי זכוכית ניקו עם חולץ פיפטה על מנת להכין את המניות קטנות.
   3. לשבור את הקצה של הנימים משכו על ידי גירוד בגפיים על פיסת נייר הטישו כדי להשיג גפיים משופעים בגודל הרצוי: בדרך כלל בקוטר חיצוני של 300-350 מיקרומטר וקוטר פנימי של 250-300 מיקרומטר. במהלך תהליך עיצוב זה, לשלוט בקוטר של הנימים באמצעות macroscope עיני שהוא מצויד במירה סיימתי את הלימודים.
   4. חבר את הגפיים שאינם משופעים בנימים לסעפת 3 דרך באמצעות חתיכת צינור פלסטיק שקוטר פנימי מתאימה לקוטר החיצוני של הנימים.
   5. שימוש בטובין הפלסטיקגרם, לחבר את שתי דרכים אחרות של הסעפת ל 25 μl מזרק microliter ולמזרק 1 מיליליטר עמוס בשמן מינרלי histo התואם.
   6. כוון את בורר הסעפת להקים מסלול בין מזרק microliter ומזרק 1ml. להסיר הבוכנה של מזרק microliter ולהזריק שמן מינרלים אחורה לתוך מזרק microliter עד שהוא דולף החוצה על ידי לחיצה על הבוכנה של מזרק 1ml. החזר את הבוכנה של מזרק microliter תוך הקפדה לא להשאיר בועות אוויר בצינור.
   7. כוון את בורר הסעפת להקים מסלול בין הנימים ומזרק 1 מיליליטר. מלא את הנימים עם שמן מינרלים עד שהוא ידלוף החוצה מהקצה תוך הקפדה לא להשאיר בועות אוויר בצינור.
   8. כוון את בורר הסעפת כדי ליצור חיבור בין מזרק microliter והנימים. לגרש כ -10 μl של שמן מינרלים.
   9. טובלים את קצה הנימים לתוך פתרון PBSובאמצעות המד של מזרק microliter, למצוץ ב5μl של PBS בנימים. שים לב שהמניסקוס בין שמן וPBS נראה בבירור.
   10. תקן את הנימים על micromanipulator 3 ציר המתאים תחת macroscope הניתוח. מערכת זו תשמש למקד נימים על הזריקה תחת שליטה חזותית.
2. השתלה אליפטית
   1. קל להרדים את העכבר על ידי שאיפה של Isoflurane בחדר אינדוקציה (1.5% באוויר במהלך 1-1.5 דקות).
   2. להרדים את החיה עם זריקה תוך הצפק מתערובת של קטמין / Xylazine (120 מ"ג / קילוגרם, מ"ג 12 / קילוגרם). שים לב שהרדמה לעתים קרובות מפחיתה את טמפרטורת הגוף של בעלי החיים. מומלץ להמשיך בניתוח בחדר ב26 מעלות צלזיוס ולשמור על החום בבעלי החיים עם כרית חימום thermocontrolled בסיסית.
   3. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
   4. לגלח את הקרקפת של החיה.
   5. מקוםבעלי החיים במסגרת stereotactic באמצעות מוטות אוזן ושופר.
   6. נקה את העור עם יוד povidone (סבון של 3%, ואז פתרון 10%).
   7. לעשות חתך ארוך 1 סנטימטר אורכים באמצע הקרקפת עם אזמל. בעזרת מספריים לחתוך ולהסיר את העור מעל העצמות הקודקודית.
   8. עם להב סכין מנתחים בעדינות להסיר את קרום העצם מעל לגולגולת. בנדיבות להחיל cyanoacrylate על גבי העצם כדי ליצור משטח מחוספס לדבקות מלט מאוחר יותר.
   9. לקדוח את העצם הקודקודית תחת macroscope כירורגית כדי ליצור פתיחת גולגולת של 4 מ"מ קוטר. בנדיבות להוסיף קר כקרח PBS המכיל הפניצילין (1,000 U / ml) וStreptomicin (1 מ"ג / מיליליטר) במהלך ההליך כולו כדי למנוע חימום. הסר את שברי עצמות הקטנים עם מלקחיים וגזה סטרילית רטובה. תשמור על עצמך לקדוח לפחות 1 מ"מ מתפרי גולגולת הקודקודית, כדי למנוע דימומים.
   10. דק העצם בגבול של פתיחת הגולגולת שבו חלון הזכוכית יהיה אטומה. המטרה היא דוארNsure מאוחר מיצוב מישוריים של חלון הזכוכית עם שטח מגע מרבי בין המוח והזכוכית. לאט לאט להסיר את עצם שימוש במלקחיים ולנקות את הדורה מאטר, החשוף עם פתרון PBS.
   11. קח coverslip זכוכית עגול בקוטר 5 מ"מ, לנקות אותו עם אלכוהול ולייבש אותו בנייר טישו. נסה להשתמש coverslip כמכסה לפתיחת הגולגולת ולוודא כי משטח שטוח גדול של המוח מקבל במגע עם הזכוכית. אם יש צורך להסיר את coverslip כדי לדלל עוד יותר את העצמות בצד. המשך עד שהמוח יכול להידחס שטוח אם בעדינות הפעלה לחץ על coverslip פעם אחת במקום.
   12. לנקות שוב את coverslip עם אלכוהול, לייבש אותו בנייר טישו, ולשמור אותו לגזרים.
   13. עם מחט מד 26 לעשות חור בדורה מאטר, במרכזה של פתיחת הגולגולת עדיין הימנעות כלי דם ראשיים. הקפד שלא לפגוע במוח parenchyma כמטרת שלב זה הוא רק כדי לפתוח את הדורה-מאטר.
   14. נקה בעדינויות את wi-הדורה מאטרה פתרון PBS להסיר דם מדמם. כסה עם חתיכת נייר הטישו בעת ההכנה להזרקת אליפטית.
   15. עם מערכת ההזרקה אליפטית מוכנה בשלב 2.1, למצוץ אליפטית עגול הולם את קוטר הנימים הפנימי (כ 200-250 מיקרומטר) מצלחת פטרי מוכנה בשלב 1.2. אליפטית צריכים לבוא יחד עם בערך 5 מדיום התרבות μl. זה צריך לנפול לקצה נימיות תחת כובד משקלה.
   16. הסר את נייר הטישו הרטוב המשמש לכיסוי פתיחת הגולגולת ולמקם את החיה מתחת למערכת ההזרקה.
   17. מנמיכים את פיפטה ההזרקה עד שהוא נוגע החור שנעשה בדורת מאטר-. לאחר מכן, הורד אותה שוב על ידי 250 מיקרומטר. חכה 30 שניות.
   18. לאט לאט להזריק אליפטית באמצעות הבוכנה של מזרק microliter (2-3 μl) תוך שאיבה החוצה הנוזל העודף עם חתיכת נייר הטישו דקה. חכה 30 שניות ולאחר מכן בעדינות להרים את פיפטה ההזרקה ידי 50 מיקרומטר לכיוון פני השטח. חכה שוב 30 שניות וrepeat הליך ההרמה על ידי צעדים של 50 מיקרומטר עד פני השטח. זמני המתנה נמנעה ממיצוי של אליפטית שהייתי מקל לפיפטה.
   19. לאשר את קיומו של אליפטית במוח באמצעות macroscope הקרינה.
   20. מערבבים 100-300 מיקרומטר קוטר חרוזים ג'ל dextran צולבים עם פתרון PBS בצלחת פטרי. חכה 1min ולדוג כמה חרוזים התייבשות. מניחים אותם על העצם הסמוך לפתיחת הגולגולת.
   21. תחת שליטת מאקרוסקופי, לבחור חרוז אחד בקוטר דומה לגודל של פתיחת הדורה-מאטר. חותכים את חרוז ג'ל dextran צולבים בשני חצאים באמצעות מלקחיים.
   22. בעדינות לשים את חמי חרוז ג'ל dextran צולבים לתוך חור ההזרקה עם הפנים קמורים כלפי אליפטית. יש להיזהר שלא להסיר את אליפטית ולחץ בעדינות כלפי מטה עד הגבול של קעור לקבל במגע עם הדורה מאטר-שמסביב.
   23. לשים טיפה של דבק cyanoacrylate בשקופית זכוכית; טובל את הקצה של קיסם לdrop לקחת כמות קטנה של דבק. מהירות לאטום את הקצוות של חמי חרוז ג'ל dextran צולבים לדורת מאטר, הסמוך על ידי רקיעת דבק מסביב. תשמור על עצמך לבצע תנועות מהירות ומדויקות על מנת להימנע מהדבקת dextran ג'ל, חמי חרוז צולבים לקיסם. הימנע מעודף של דבק שיכול להתפשט ולעכב אם לא למנוע הדמיה פעם אחת יבש. חכה 2 דקות לדבק להתייבש ולאחר מכן לנקות את פתיחת הגולגולת ועצמות המקיפות עם פתרון PBS.
3. השתלת חלון
   1. שים בקוטר 5 מ"מ עגול coverslip מעל craniotomy (ראה 2.2.12). הקצוות של coverslip חייבים להיות על הגולגולת דליל בחלקו החיצוני של פתיחת הגולגולת. Coverslip חייב להיות במגע עם הדורה מאטר, והעצם דליל בקצוות. זה מאוד חשוב שיהיה מגע ישיר בין הדורה מאטר, וcoverslip הזכוכית אחרת רקמת צלקת עלולה להתפתח ולעכב בהירות אופטית.
   2. עם רקמה, לספוג את PBS על הקצות coverslip הדואר כך פתרון שאינו מכסים באופן מלא את פתיחת הגולגולת בעת החלת לחץ קטן במרכז של coverslip. זה יבטיח כי עצם, זכוכית והמוח דבוק יחד בצד של האזור של עניין.
   3. לשמור על לחץ קטן במרכז coverslip עם מלקחיים תוך יישום העדינות cyanoacrylate בגבול בין העצם וcoverslip. הדבק באופן ספונטני יתפשט עד לממשק עם פתרון PBS. פתרון יפעל כמחסום ניתנה הידרופוביות של הדבק. איטום צריכה להיות יעיל בפחות מדקה, אבל לקחת בזהירות רבה שלא להזיז את coverslip עד שהוא קבוע. זה אחרת היה לגרום לדליפת cyanoacrylate בדורת מאטר, ומכאן להוביל לכישלון של הניתוח.
   4. במקרה דבק היה להתפשט על גבי הזכוכית, להסיר אותו באמצעות סכין מיקרו אזמל ידי ביצוע תנועות ספירלה כפי שהוא עשוי אחרת להפחית את הבהירות אופטית. תיזהר לא לשבור את coverslip הזכוכית דוריןg ההליך בשל לחץ מוגזם.
   5. איחוד קיבעון הזכוכית על ידי יישום מלט שיניים בקצוות של coverslip לכיוון הגולגולת הסמוכה. הקפד לכסות את הגולגולת חשופה כולו עד לקרקפת. שימוש בבטון נוסף, לבנות את הקירות צדדיים סביב coverslip כדי ליצור את הבריכה הנדרשת לטבילה של המטרה. מלט השיניים ירפא בפחות מ 10 דקות.

3. טיפול והכנה להדמיה לאחר ניתוח

1. טיפול שלאחר ניתוח
   1. הסר את העכבר מהמסגרת stereotactic, להזריק Dexamethazon (0.2 מ"ג / קילוגרם) וRimadyl sc (5 מ"ג / קילוגרם) על פני אזורי האגן והשכיב אותה בכלוב עם רקמת קן חם.
   2. לפקח על בעלי החיים עד להשפעות של הרדמה נעלמו. באופן כללי 2 עד 3 שעות לאחר ניתוח, עכברים הם ניידים באופן מלא. ודא שיש לו בעלי החיים גישה קלה למזון ומים. לספק את החיה עם גלוקוז agarose המכיל (agarose3%, 3% גלוקוז).
   3. לפקח על המשקל של בעלי החיים בכל יום ולהזריק Dexamethazon (0.2 מ"ג / קילוגרם) וRimadyl sc (5 מ"ג / קילוגרם) ל10d הראשון שלאחר ניתוח. לשיקולים אתיים, להרדים את העכברים כאשר ההפסד עולה על 15% מהמשקל המקורי שלה. לחץ תוך גולגולתי עולה עם גודל גידול שמוביל לליקויים מוטוריים לבעלי החיים. זוהי שורת תאים הסרטני תלויה ומתרחשת בעיכובים שונים שלאחר ניתוח. יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי לאפיין את נקודת הסיום של הניסוי עם הקו הסלולרי בשימוש.
2. הכנה להדמיה
   1. קל להרדים את העכבר על ידי שאיפה של Isoflurane בחדר אינדוקציה (1.5% באוויר במשך 1-1.5 דקות).
   2. להרדים את החיה עם זריקה תוך הצפק מתערובת של קטמין / Xylazine (100 מ"ג / קילוגרם, 10 מ"ג / קילוגרם). כגון הרדמה בדרך כלל מאפשרת 45 דקות של התבוננות. כדי לבצע פגישות הדמיה ארוכות יותר, עכבר ממוקם מתחת לאיפה מתמדת של Isoflurane באוויר (0.25-0.75%).
   3. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
   4. שים את החיה על מסגרת stereotactic ולחסום את הגולגולת עם earbars.
   5. כדי להמחיש את כלי הדם, צבע פלואורסצנטי ניתן להזריק לווריד.
   6. אם החלון מופיע מלוכלך, ניתן לנקות אותו בעדינות על ידי הסרת הפסולת עם להב דק והפינה של רקמות. אין להשתמש באלכוהול כדי לנקות את החלון כפי שהוא לא תמיד בקנה אחד עם מלט שיניים וזה יכול לקרר את המוח מתחת לחלון.

Representative Results

ברגע שהפרוטוקול הניתוחי מבוצע (איור 1), ניתן לראות בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל שבועות עד הקרבה. תגובה דלקתית יכולה להיות שנצפתה לאחר הניתוח, הנעלם בתוך שבוע או שבועות. גידול יכול להיות שנצפה על ידי שיטות מיקרוסקופיה שונות, כולל macroscopy ניאון ושני פוטונים במיקרוסקופ (איור 2). תמונות דוגמא המתוארות כאן מומשו על macroscope הקרינה ומיקרוסקופ שני פוטונים מצמידים את לייזר femtosecond פעם אינפרא אדום מתכונן ובית שונה כדי לאפשר מיקום של בעלי חיים מתחת לאובייקטיבי 20X טבילה במים (1.0NA).

התפתחות הגידול נאמדה לאורך זמן באמצעות macroscope הקרינה שילוב תאורה אלכסונית הדמיה החזרה שדה בהיר ופליטת epifluorescence (איורים 2 א-2C). קביעת ערכי סף של הקרינה בקלות נותנת גישה לאזור הגידול בזמן superfכלי דם icial לנתק מבנים כהים מהרקע הלבן של התמונה באור הנראה. על יד intravital האחר שני הפוטונים במיקרוסקופ מאפשר Z-חתך ושחזורים מאונך של שדות גדולים של תצוגה עם הרזולוציה subcellular (ראו דנדריטים באיור 2 ד). שימוש בבעלי חיים מהונדסים מבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין (למשל, עכברי Thy1-CFP המבטאים את חלבון ציאן פלורסנט בנוירונים, פסאודו צבע ירוק באיור 2 ד) ניתן לצפות בהתקדמות הגידול במייקרו הסביבה העצבית שלה. עם זאת, יש לציין כי צפיפות תאים סרטניים יכולה להגביל את עומק חדירת הפוטון, כמו גם זיהוי הפוטון הנפלט עקב דיפוזיה מוגברת. זה נראה בבירור באיור 2 ד כרזולוציה מרחבית מתחילה ירידה ב200 מיקרומטר מתחת לדורה, העניין בגידול אבל לא parenchyma המוח בריא. יתר על כן, את אות הדור השנייה הרמוני הנובעת לכאן ולכאןמ 'שאורגן על דפוסים של מולקולות שאינן centrosymetric כגון סוג I ו-III קולגן מספק חתימה של הדורה-מאטר (ציאן פסאודו הצבע באיור 2 ד וחצים). יש לציין כי עם הפרוטוקול הניתוחי שלנו, הגידול גדל מתחת הדורה מאטר-בparenchyma המוח שבו הפיתוח שלה נשלטת על ידי המגבלות פיזיות של המוח. האיטום של הדורה מאטר, עם חמי חרוז ג'ל dextran צולבים מונע את בריחתם של תאי גליומה במרחב extradural.

כאשר אחריו שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital התקדמות הגידול בין נקודות זמן שונות ניתן להשוות ברזולוציה סלולרית. הדמיה באותו האזור ובD16 D27 שלאחר הניתוח (איור 3 א) מצאנו כמה כלי דם כאחד מודגש על ידי חצים שהיו יציבים על פני תקופה של 11 ימים; ומצד שני מול הגידול הסתנן באופן ברור לparenchyma בריא לעומת התקופה המקבילה. כדי להעריך את התקדמות גידול, MArgin נצפה בD27 היה מסומן בקו מקווקו צהוב ומעולף על התמונה שצולמה בD16. משמרת 520 מיקרומטר של הקצה הקדמי נצפתה באופן עקבי עם פרופיל השגשוג המדווח של מודל גליומה GL261 ^15. הדפוסים של רשת כלי הדם בתוך הגידול היו שונים מאוד על D16 וD27 מצביעים על כך ששיפוץ של כלי דם משמעותי מתרחש באזורים פתולוגיים (איור 3 א). בשולי הגידול, מצאו גם מקרים של תאי גליומה ניתוק מליבת הגידול כצפוי מגידול פולשני. הרזולוציה המיקרוסקופית של התמונות שלנו הראתה כי לא רק שתאים אלה פולטים בליטות cytoplasmic לחוש את הסביבה, אלא גם כי הם יכולים להשתמש בכלי דם כמטריצה ​​להתקדמות שלהם (ראשי החץ וZ-השיקום באיור 3 ב). שני הפוטונים במיקרוסקופ וכך מאפשר ללמוד אינטראקציות הסלולר בהקשר באמת פיסיולוגי. שימוש בבעלי חיים מהונדסים שבו כל אוכלוסיית תא של עניין היאזוהה על ידי כתב הניאון שלה ניתן יהיה לחפש את קיומו של אינטראקציות פיזיות בין תאים הסרטניים וסביבתם כרגולטורי מפתח להתקדמות מחלה (איור 3B, מימין).

איור 1. סקירה כללית של הניתוח. פתיחת הגולגולת מתבצעת על העצם הקודקודית השמאלי (). הגבולות של העצם הקודקודית השמאלי מתוארים בקו מקווקו ואת החלק שהוסר הוא מלא בצהוב (ב '). ברגע שבצעה הפתיחה הגולגולת, קליפת המוח הקודקודית חשופה (C), באזור להזרקה של אליפטית נבחר לטפל כדי למנוע כלי דם עיקריים (חץ בD) ומחט מד 26 משמשת כדי לפתוח את הדורה-מאטר ( חץ בE). אליפטית היאהזריק והחור בדורה מאטר, יש סתימה על ידי חמי חרוז ג'ל dextran צולבים חתום עם דבק cyanoacrylate (חץ בF). Coverslip זכוכית מודבק לעצם, תוך שמירה על קשר עם המוח. Coverslip הוא ביצרו עוד יותר לגולגולת חשופה כדי להבטיח מצורף מוצקות לטווח הארוך של החלון גולגולתי לתצפיות כרוניות (GI). כל פרוטוקול schematized בקצרה בג'יי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. צמיחת גידול מוגבל לparenchyma המוח ויכול להיות במעקב לאורך הזמן. AC. צמיחת גידול (קו תאי GL261 להביע DsRed2) שנצפה על ידי מ 'acroscopy ביום של ניתוח (DO,) ובימים 21 (B) ו27 (C). ראש החץ ב-C מדגיש טיפה של דבק דנטלי שלא הוסר במהלך השלב 2.3.5. ד. שחזורי אורתוגונלי מתקבלים משדה 3 x 3 רכש 0-300 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-בעכבר Thy1-CFP נושאות גידול GL261 ידי שני פוטונים במיקרוסקופ בD20 שלאחר הניתוח. גידול (אדום), הדורה מאטר, שנצפה על ידי דור השני הרמוני (חיצים, ציאן) ותאי עצב (ירוק). שים לב שהגידול גדל מתחת הדורה מאטר-בparenchyma המוח. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. Vaפלישת שיפוץ ותאים סרטניים scular יכולה להיות במעקב לאורך זמן עם רזולוציה מרחבית סלולרית על ידי שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital. גידול. GL261 (אדום) נצפה בD16 D27 ולאחר ניתוח לאחר הזרקה תוך ורידית של דקסטראן כחול אשד 70 kDa כדי להדגיש את כלי דם. קו מקווקו: שולי גידול בD27; חיצים: דוגמא של כלי דם שיכול לשמש גם כציוני דרך למקם אותו האזור ובD16 D27 B.. תאים סרטניים בודדים (אדום) לפלוש parenchyma בריא במוח (נוירונים; ירוק) באמצעות כלי דם כמטריצה ​​לפלישה (ראשי חץ). תמונות צולמו בעומק הנע 100-150 מיקרומטר מתחת לדורה-העניין. קו מקווקו:. אזור שבו השחזור מאונך המתואר בלוח המרכז התחתון מומש לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

גישה זו מאפשרת השימוש בשיטות הדמיה אופטיות כדי לפקח על ימים ושבועות הצמיחה של גליומה המושתלת orthotopically. בעלי החיים זהים בהמשך יכולים להיות נתונה לכמעט כל שיטת הדמיה מוחית במהלך הפתולוגיה; עדיין ההכנה הספציפית במיקרוסקופ שני פוטונים מציעה הזדמנות הייחודית להשיג רזולוציה subcellular בתוך המוח של בעלי החיים חיים. הפרוטוקול שלנו מציג את היתרון לאכוף את צמיחת הגידול לparenchyma המוח ולא במיוחד durally כפי שזה קורה אם תאי גליומה יכולים לעזוב את מערכת העצבים המרכזית דרך הדורה הפגומה. בהעדר מגבלות פיזיות שהופעלו על ידי סביבת המוח, תאים סרטניים יכולים אכן מתרבים מהר כמו שהם לא צריכים לחדור parenchyma ^16. שיטות שפורסמו בעבר לא ניסו לאטום את מאטר הדורה לאחר ההשתלה שהייתה כל בעייתי יותר ממה שהם הזריקו השעיה של תאים ולא הספרואידים^9,13,14. השעיות של תאים הן אכן בלתי אפשריים ליישם focally כתאים בודדים הם זורעים באופן שיטתי לאורך מערכת ההזרקה בעת משיכת פיפטה מעומק לדורת מאטר-.

הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם על זני עכבר שונים, כולל מהונדס ובעלי חיים immunosuppressed. יכולות להיות מורכבים שורות תאי גליומה שונות ומדמיינים, כוללים תאים נגזרים ישירות מביופסיות אדם, כל עוד הם transfected להביע את השתלה לפני כתב ניאון ביציבות. פרוטוקול כירורגי יכול להיות מבוצע בדרך כלל בשעה 1 ובמהירות ניתן לקבל קבוצות של בעלי חיים. גישה זו יכולה ובכך לשמש כדי לחקור שיפוץ של כלי דם, את ההשפעות של טיפולים תרופתיים באנגיוגנזה וגידול, כמו גם הגיוס של תאי מערכת החיסון לתוך הגידול. בעת צורך נדידת תאי גליומה ואינטראקציות דינמיות בין תאי גליומה והמיקרו ניתן לצפות בזמן אמת במשך כמה hours.

כהדמיה יכולה להיעשות על מעמקי 500 מיקרומטר אפשר לכסות את רוב נפח הגידול בתחילה מושתל 200 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-. טיפול עומק הדמיה מקסימאלי כדי להבטיח מיוחד חייב להילקח במהלך הניתוח ליצירת מגע פיזי בין הדורה מאטר, וcoverslip הזכוכית. זה אכן מפחית את היווצרות של רקמה צלקתית שאחרת היה מתפשרת בהירות אופטית. גם עקרות מוחלטות של הסביבה כירורגית יש לשים לב להגבלת הדלקת לאחר הניתוח שtransiently מטשטשת את החלון. אנחנו בכל מקרה ממליצים להמתין 15 ימים שבין הניתוח והפעלת התצפית הראשונה להשיג תנאי הדמיה אופטימליים. לאחר מכן, חלון נמצא להישאר ברור עד שנה לאחר הניתוח על בעלי חיים דמה פעל שעברו את כל הפרוטוקול מלבד הזריקה של אליפטית הגידול.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מהווה שיפור של אורת הקיימתמודל עכבר גליומה otopic מוקדש לשני פוטונים במיקרוסקופ intravital הכרוני. ההזרקה השטחית של אליפטית גידול, הסתימה של הזרקת מסלול עם ג'ל, חמי חרוז dextran צולבים והאיטום של הדורה מאטר-לאכוף התפתחות גידולים בסביבת המוח שבאמת מסכמת את המגבלות פיזיות בדרך כלל מסדירות את התקדמות מחלה. לא רק ששיטה זו תשמש לימודי יסוד על הפתופיזיולוגיה גליומה אבל זה יהיה גם לשפר את הרלוונטיות של תוצאות תרופתיים במהלך ניסויים פרה.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים בחום מודים לד"ר KK Fenrich, ד"ר MC. Amoureux, פ וובר וא 'Jaouen לדיונים מועילים; מ 'Hocine, ג Meunier, מ' Metwaly, ס 'Bensemmane, J. Bonnardel, צוות של מתקן בעלי החיים בIBDML וצוות של פלטפורמת ההדמיה PicSIL בIBDML לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי du הסרטן (האינקה-DGOS-INSERM6038) לGR, סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), הפדרציה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le Cerveau (FRC) לFD, על ידי מלגות מהפדרציה דה לה משוכלל ונדיר Médicale וCancéropole PACA לCR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

רפואה גיליון 86 multiforme Glioblastoma הדמיה שני פוטונים intravital מודל חיה חלון גולגולתי כרוני גידולים במוח נוירו אונקולוגיה.