En orthotopic Glioblastoma Mouse Model Opprettholde Brain Parenkymalt fysiske begrensninger og Egnet for Intravital To-foton mikroskopi

Summary

Vi har etablert en cortical orthotopic glioblastoma modell i mus for intra to-foton mikroskopi som sammenfatter de biofysiske begrensninger normalt være i sving under veksten av svulsten. En kronisk glass vindu erstatte skallen ovenfor svulsten gjør at oppfølgingen av svulsten progresjon over tid ved to-foton mikroskopi.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest aggressive formen for hjernesvulster uten kurative behandlinger tilgjengelig til dags dato.

Murine modeller av denne patologi er avhengige av injeksjon av en suspensjon av glioma celler i hjernen parenchyma følgende innsnitt av dura-mater. Mens cellene må injiseres overfladisk å være tilgjengelig for intra to-foton mikroskopi, overfladiske injeksjoner klarer å rekapitulere de physiopathological forhold. Faktisk, rømmer gjennom injeksjonskanalen de fleste kreftceller nå ekstra-dural plass hvor de utvider unormalt raskt i fravær av mekaniske begrensninger fra parenchyma.

Våre forbedringer består ikke bare i focally implantering av en glioma sfæroide stedet for å injisere en suspensjon av glioma-celler i de overflatiske lag av hjernebarken, men også tetter injeksjonsstedet av en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten som er limt til omgivelding parenchyma og forseglet til dura-mater med cyanoacrylate. Til sammen viser disse tiltakene håndheve den fysiologiske utvidelse og infiltrasjon av kreftceller i hjernen parenchyma. Kraniotomi ble endelig avsluttet med et glass vindu sementert til skallen for å gi kroniske bildebehandling over uker i fravær av arrvev utvikling.

Benytte seg av fluorescerende transgene dyr podet med fluorescerende tumorceller vi har vist at dynamikken i samspillet som oppstår mellom gliomceller, nevroner (f.eks Thy1-CFP mus) og blodkar (markert med en intravenøs injeksjon av et fluorescerende fargestoff) kan visualiseres ved intra to-fotonmikroskopi under utviklingen av sykdommen.

Muligheten til bildet en svulst på mikroskopisk oppløsning i en minimal kompromittert cerebral miljøet representerer en forbedring av dagens GBM dyremodeller som skal nyte godt innen nevro-onkologi og narkotika testing.

Introduction

Glioblastoma multiforme fremstår som den mest aggressive formen for hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse på 12 måneder og en 5-års overlevelse på 5%. Klinisk styring er avhengig av kirurgi, radioterapi og kjemoterapi ofte brukt i kombinasjon. Men effekten av disse behandlingene er fortsatt palliativ ^1-3.

Inntil nå, de fleste av nevro-onkologi studier er avhengige av teknikker som er bare i stand til å gi et statisk syn og utført på store årskull av tumorbærende dyr ofret på ulike tidspunkter (se for eksempel ^4,5). Den siste utviklingen av metoder for oppfølging, basert på intra bildebehandling kan studere glioma vekst og samspillet mellom kreftceller og deres patofysiologiske mikromiljøet på samme dyr over tid. Dette åpner veien til eksklusive stykke informasjon som var så langt uoppnåelig ^seks. Transgene dyr uttrykker fluorescerende tagger i celler av interesse kan være brukd å studere spesifikke interaksjoner mellom kreftceller og f.eks nevroner i dette papiret.

I løpet av det siste tiåret, har intra to-foton mikros ⁷ blitt en gullstandard i fundamentale nevro-onkologi studier og prekliniske studier ^8,9 for sin evne til å utføre dype intra observasjon av mus hjernen (> 500 mikrometer under dura-mater) med en micrometric romlig oppløsning ^10. Ved hjelp av intravital to-fotonmikroskopi med orthotopical dyremodeller implantert med en kronisk kranie vindu ^11, er det mulig å følge den tumorprogresjon over tid på den samme musen ^9,12.

En av de største ulempene med disse tidligere publiserte dyremodeller er imidlertid at de ikke etterligner de fysiske begrensninger som styrer tumorvekst som dura mater-ikke er forseglet etter injeksjon av cellesuspensjonen ^9,13,14. Glioma celler kan lekke iextradural plass transformere en orthotopic glioma modell i en heterotop ett.

Denne dyremodell er presentert her består i injisering av et sfæroide av fluorescerende glioma celler i cerebral cortex i en dybde på 200 mikrometer, etterfulgt av forsegling av dura-mater med en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten og histo-kompatibel lim . Tumorvekst blir deretter begrenset til hjernen parenchyma som opprettholder patofysiologiske fysiske begrensninger. En kronisk glass vindu implantert ovenfor svulsten gir en enkel optisk tilgang til intra to-foton mikroskopi. Ved hjelp av transgene dyr uttrykker fluorescerende tagger i celler av interesse det er mulig å utføre en oppfølging av glioma vekst over tid og å studere dens interaksjon med sitt mikromiljø (her med nerveceller og blodårer markerte med fluorescerende dekstraner).

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med den franske lovgivning og i samsvar med EF rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609/EØF) for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forskningen på dyr ble godkjent av Direction Départementale des Services Veterinaires des Bouches-du-Rhône (lisens D-13-055-21) og godkjent av den etiske komiteen i Provence Cote d'Azur n ° 14 (Prosjekt 87-04122012) .

En. Spheroids Forberedelse

1. Fremstilling av de agarose-belagte petriskåler
   1. Bland 1 g agarose med 100 ml cellekulturmedium ikke supplert med føtalt bovint serum. Bruk en mikrobølgeovn (850 watt i 40 sekunder, og deretter 3 x 15 sekunder; røre løsningen mellom hver mikrobølgeovn sesjon) å koke oppløsningen og for å fullstendig oppløse agarosen. Autoklaver av dette 1% agarose-løsning i 20 min ved 120 ° C for å sikre klor. heten Merk: Vær nøye med å løse opp agarose før autoklaven protokollen. Inhomogeneity kan kompromittere dannelsen av sfæroider.
   2. Når den er funnet fra autoklaven, helles 10 ml av 1% agarose-løsning i 100 x 20 mm petriskåler. La Petri-retter 20 min ved romtemperatur for å tillate at 1% agarose-løsning til å stivne.
   3. Tilsett 10 ml PBS over agarose for å opprettholde fuktigheten. Tett lokk av agarose-belagt petriskåler ved å pakke dem med parafilm for å unngå fordampning. Petriskåler kan lagres i opp til to måneder ved 4 ° C hvis riktig fuktet av PBS laget.
2. Spheroid kultur
   1. I en 75 cm ² kolbe, kultur de gliomceller i deres anbefalte medium som en monolayer.
   2. Sett PBS fra en av 1% agarose-belagte petriskål med 1,5 ml "preconditioned medium" innsamlet fra kolben inneholdende den 2D monolag av glioma celles.
   3. Fjern mediet fra kolben inneholdende den 2D monolag av glioma celler.
   4. Skyll forsiktig monolaget med 10 ml PBS.
   5. Tilsett 2 ml av 0,05% av et Trypsin / EDTA-løsning og inkuberes i kolben 4 min ved 37 ° C. Bemerk: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av den cellelinjen som benyttes.
   6. Legg 8 ml kultur medium for å stoppe handlingen av trypsin, skylle forsiktig cellesuspensjonen. Merk: Pass på å ikke skylle luft i cellesuspensjonen som det øker celledød.
   7. Sett 6 ml av cellesuspensjonen i en steril ampulle.
   8. Sentrifuger hetteglasset fire minutter ved 800 rpm.
   9. Fjern supernatanten og forsiktig suspencellebunnfall i 3 ml dyrkningsmedium.
   10. Seed cellesuspensjonen i den klargjorte agarose-belagte petriskål.
   11. Sett petriskål ved 37 ° C i en 5% _CO2 atmosfære i 2 til 3 dager inntil sfæroider av ønsket diameter dannes.
2. Spheroid og Vindu Implantasjon
1. Utarbeidelse av innsprøytningssystemet
   1. Rent glasskapillærer (1 mm i diameter) ved sonicating i 70% etanol i 10 min. Vask to ganger med vann før plassering inne i en inkubator til den er tørr.
   2. Trekk flere rengjorte glasskapillærer med en pipette puller for å forberede et lite lager.
   3. Bryt spissen trukket kapillær ved å skrape den ytterste ende på et stykke papir for å oppnå en avfaset spiss av den ønskede størrelse typisk en utvendig diameter av 300-350, um og en innvendig diameter på 250 til 300 mikrometer. I løpet av denne formingsprosessene å kontrollere diameteren av kapillarrøret ved hjelp av en macroscope som har okulær er utstyrt med en gradert mira.
   4. Koble den ikke-avskrådde ende av kapillarrøret til et 3-veis fordeleren ved hjelp av et stykke av plastrør hvis indre diameter passer til ytre diameter av kapillar.
   5. Ved hjelp av plast tubing, koble de to andre måter å manifolden til en 25 ul mikroliter sprøyte og til en 1 ml sprøyte lastet med histo-kompatibel mineralolje.
   6. Juster manifoldvelger for å etablere en vei mellom mikroliter sprøyte og 1 ml sprøyte. Fjern stempelet i den mikroliter sprøyte og injiseres mineralolje bakover inn i mikroliter sprøyte inntil den lekker ut ved å skyve stempelet i 1 ml sprøyte. Bytt ut stempelet av mikroliter sprøyte mens du tar vare ikke å forlate luftbobler i røret.
   7. Juster manifoldvelger for å etablere en vei mellom den kapillære og 1 ml sprøyte. Fyll kapillær med olje til det lekker ut fra tuppen mens du tar vare ikke å forlate luftbobler i røret.
   8. Juster manifold velgeren for å etablere en forbindelse mellom mikroliter sprøyte og kapillær. Utvise omtrent 10 pl mineralolje.
   9. Dypp kapillær spissen inn PBS løsningog ved hjelp av måle av mikroliter sprøyte, suger i 5 ul PBS i kapillarrøret. Legg merke til at menisken mellom olje og PBS er klart synlig.
   10. Fest kapillær på en 3 akse mikromanipulator montering under operasjonen macroscope. Dette systemet vil bli brukt til å målrette den kapillære på injeksjonsstedet etter visuell kontroll.
2. Spheroid implantasjon
   1. Lett bedøve musen ved inhalering av isofluran i en induksjonskammeret (1.5% i luft i løpet av 1 til 1,5 min).
   2. Anesthetize dyret med en intra-peritoneal injeksjon av en blanding av ketamin / xylazin (120 mg / kg, 12 mg / kg). Legg merke til at anestesi reduserer ofte kroppstemperaturen til dyret. Det anbefales å fortsette med kirurgi i et rom på 26 ° C, og for å holde dyret varm med en underliggende thermocontrolled varmepute.
   3. Påfør øyesalve for å unngå uttørking av øynene.
   4. Barber hodebunnen til dyret.
   5. Steddyret i en stereotaktisk ramme ved hjelp av øret barer og et munnstykke.
   6. Rens huden med povidon jod (3% såpe, og deretter 10% oppløsning).
   7. Foreta en 1 cm lang snitt i lengderetningen i midten av hodebunnen med en skalpell. Ved hjelp av saks kutte og fjerne huden over parietalbena.
   8. Med en skalpell blad forsiktig fjerne periosteum over skallen. Sjenerøst gjelder cyanoacrylate på toppen av beinet for å generere en ru overflate for senere sement tilslutning.
   9. Bor issebeinet under et kirurgisk macroscope å generere en kraniotomi av 4 mm diameter. Generously legge iskald PBS inneholdende penicillin (1000 U / ml) og Streptomicin (1 mg / ml) i løpet av hele fremgangsmåten for å hindre oppvarming. Fjern de små beinfragmenter med pinsett og en våt steril kompress. Vær nøye med å bore minst 1mm unna parietal skallen sting for å unngå blødninger.
   10. Thin beinet på grensen av kraniotomi der glassvinduet vil bli forseglet. Målet er å eONTROLLER senere plane posisjonering av glass-vindu med maksimal kontaktflate mellom hjernen og glasset. Sakte fjerne benet ved hjelp av en pinsett og rengjør eksponert dura-mater med PBS løsning.
   11. Ta en 5 mm diameter runde glass dekkglass, rengjør den med alkohol og tørk den med silkepapir. Prøv å bruke dekkglass som et lokk for kraniotomi og bekrefter at en stor flat overflate av hjernen kommer i kontakt med glasset. Hvis det er nødvendig å fjerne dekkglass til ytterligere tynne side bein. Fortsett til hjernen kan bli klemt flat hvis forsiktig legge press på dekkglass en gang på plass.
   12. Rengjør igjen dekkglass med alkohol, tørk den med silkepapir, og redde den fra hverandre.
   13. Med en 26 gauge nål lage et hull i dura mater-i midten av kraniotomi ennå unngår hovedblodkarene. Sørg for ikke å skade hjernen parenchyma som hensikten med dette trinnet er bare å åpne dura-mater.
   14. Rengjør forsiktig dura-mater with PBS-løsning for å fjerne hemoragisk blod. Dekk med et stykke silkepapir mens forbereder spheroid injeksjon.
   15. Med den sfæroide injeksjonssystemet fremstilt i trinn 2.1, suger en rund sfæroide montering av kapillær indre diameter (ca. 200 til 250 mikrometer) fra petriskålen fremstilt i trinn 1.2. Spheroid bør komme sammen med omtrent 5 mL kultur medium. Det skal falle ned til spissen av kapillaritet under sin vekt.
   16. Fjern vått papir som brukes til å dekke kraniotomi og plassere dyret under innsprøytningssystemet.
   17. Senk injeksjon pipette til den berører hull laget i dura-mater. Deretter senke det igjen ved 250 mikrometer. Vent 30 sek.
   18. Sakte injisere den sfæroide ved hjelp av stempelet i den mikroliter sprøyte (2-3 ul) ved å pumpe ut den overskytende væske med et tynt stykke silkepapir. Vent 30 sekunder og deretter forsiktig løft injeksjons pipette med 50 mikrometer mot overflaten. Vent igjen 30 sek og repeat fremgangsmåten løfte i trinn på 50 mikrometer til overflaten. Venter ganger unngår utvinning av spheroid som ville holde seg til pipette.
   19. Bekrefte tilstedeværelsen av den sfæroide i hjernen ved hjelp av et fluorescens macroscope.
   20. Bland 100-300 mikrometer diameter tverrbundne dekstran-gel-perler med PBS-løsning i en petriskål. Vent 1min og fiske noen hydrerte perler. Plasser dem på bein ved siden av kraniotomi.
   21. Under makroskopisk kontroll ved å velge en perle med en diameter tilsvarende til størrelsen på dura mater-åpning. Skjær tverrbundet dextran-gel vulsten i to halvdeler ved hjelp av tang.
   22. Forsiktig satt en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten inn i injeksjonshullet med den konvekse side mot den sfæroide. Pass på å ikke fjerne spheroid og trykk forsiktig nedover til grensen av den konkave komme i kontakt med det omkringliggende dura-mater.
   23. Ta en dråpe Cyanoakrylat lim på et glass lysbilde; dyppe en tannpirker inn i hydrop å ta en liten mengde lim. Raskt forsegle kantene av tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten til den tilstøtende dura-mater ved stempling lim rundt. Vær nøye med å utføre raske og nøyaktige bevegelser for å unngå liming det kryssbundne dekstran-gel hemi-vulsten til tannpirker. Unngå for mye av limet som kan spre seg og hindre hvis ikke hindre avbildning gang tørket. Vent 2 min for limet tørke og rengjør deretter kraniotomi og de omkringliggende bein med PBS løsning.
3. Vindu implantasjon
   1. Sett diameter på 5 mm runde dekkglass over kraniotomi (se 2.2.12). Kantene på dekkglass må være på det tynnet skallen på utsiden av kraniotomi. Den dekkglass må være i kontakt med dura mater-og tynnet benet på kantene. Det er svært viktig å ha en direkte kontakt mellom dura-mater og glass dekkglass ellers arrvev kan utvikle og hindre optisk klarhet.
   2. Med en vev, absorbere PBS på the dekk kanter, slik at løsningen ikke fullt ut dekker kraniotomi ved anvendelse av et lite trykk i sentrum av dekkglasset. Dette sikrer at benet, glass og hjernen er limt sammen på den side av regionen av interesse.
   3. Opprettholde et lite press på midten av dekkglass med en tang mens forsiktig påføring cyanoacrylate på grensen mellom benet og dekkglass. Limet vil spre seg spontant til grensesnittet mot PBS-løsning. Løsningen vil fungere som en barriere gitt hydrofobisitet av lim. Tetting bør være effektiv i mindre enn ett minutt, men ta en ekstrem forsiktighet for ikke å flytte dekkglass før det er løst. Dette ville ellers resultere i cyanoakrylat lekkasje på dura-mater dermed føre til en feil i operasjonen.
   4. I tilfelle limet ville ha spredt på toppen av glasset, fjerner du det ved hjelp av en mikro-skalpell blad ved å gjøre spiral bevegelser som det ellers kan redusere optisk klarhet. Se opp for ikke å bryte glass dekkglass During prosedyren grunn av overtrykk.
   5. Samle glasset fiksering ved å anvende dentalsement på kantene av dekk mot den tilstøtende skallen. Sørg for å dekke hele eksponert skallen inntil hodebunnen. Ved hjelp av ekstra sement, bygge opp sideveggene rundt dekkglass for å lage bassenget kreves for nedsenking av målet. The dental sement vil kurere på mindre enn 10 min.

Tre. Postoperativ behandling og forberedelse til Imaging

1. Post-operative omsorg
   1. Fjern musen fra stereotaktisk ramme, injisere Dexamethazon (0,2 mg / kg) og Rimadyl (5 mg / kg) sc over bekken regioner og legge henne i et bur med en varm vev-reir.
   2. Overvåk dyret før effekten av anestesi har forsvunnet. Generelt 2 til 3 timer etter operasjonen, mus er fullt mobil. Sørg for at dyret har en enkel tilgang til mat og vann. Gi dyret med agarose inneholdende glukose (agarose3%, glukose 3%).
   3. Overvåk dyrevekt hver dag og injisere Dexamethazon (0,2 mg / kg) og Rimadyl (5 mg / kg) sc for første 10d etter operasjonen. For etiske hensyn, avlive mus når tapet overstiger 15% av sin opprinnelige vekt. Intrakranielt trykk øker med tumorstørrelse fører til motoriske svekkelser for dyret. Dette er tumorcellelinje avhengig og forekommer på forskjellige forsinkelser etter kirurgi. Spesiell forsiktighet bør utvises for å karakterisere den endepunktet av forsøket med cellelinjen som brukes.
2. Forberedelse til bildebehandling
   1. Lett bedøve musen ved inhalering av isofluran i en induksjonskammeret (1,5% i luft i 1 til 1,5 min).
   2. Anesthetize dyret med en intra-peritoneal injeksjon av en blanding av ketamin / xylazin (100 mg / kg, 10 mg / kg). En slik anestesi tillater vanligvis 45 min observasjon. For å utføre lengre bildebehandling økter, er musen plasseres under kontinuerlig innånding av isofluran iluft (0,25 til 0,75%).
   3. Påfør øyesalve for å unngå uttørking av øynene.
   4. Sett på dyret på en stereotaktisk ramme og blokkere skallen med earbars.
   5. For å visualisere blodårene, kan et fluorescerende fargestoff injiseres intravenøst.
   6. Hvis vinduet ser skitten, kan det bli renset ved å forsiktig fjerne rusk med et tynt blad, og hjørnet av en vev. Ikke bruk av alkohol for å rense vinduet som det ikke alltid er forenlig med dentalsement, og det kan avkjøles hjernen under vinduet.

Representative Results

Når det kirurgiske protokoll er utført (figur 1), kan dyrene observeres ved hjelp av fluorescerende mikros over uker før ofring. En inflammatorisk reaksjon kan observeres etter kirurgi som forsvinner i løpet av en eller to uker. Tumor vekst kan observeres ved mikroskopi forskjellige teknikker, inkludert fluorescerende macroscopy og to-fotonmikroskopi (figur 2). Eksempel bilder som er avbildet her ble realisert på en fluorescens macroscope og en to-foton mikroskop koblet til en femtosecond pulset infrarød tunbare laser og hjemme endret for å tillate dyr posisjonering under 20X vannimmersjonsobjektiv (1.0NA).

Svulsten utvikling ble estimert over tid ved hjelp av en fluorescens macroscope kombinerer skrå belysning for lyse felt refleksjon bildebehandling og epifluorescence utslipp (figur 2A-2C). Terskelverdier for fluorescens gir lett tilgang til svulsten området mens overflicial blodkar løsne som mørke strukturer ut av den hvite bakgrunnen av synlig lys bildet. På den annen side intravital to-fotonmikros tillater z-seksjonering og ortogonale rekonstruksjoner av store synsfelt med subcellulære oppløsning (se dendritter i figur 2D). Ved hjelp av transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i cellene av interesse (for eksempel Thy1-CFP mus som uttrykker cyan Fluorescent Protein i nevroner, grønt pseudo-farge i figur 2D) er det mulig å observere tumorprogresjon i sin neuronal mikro-miljø. Det må imidlertid bemerkes at tumorcelletetthet kan begrense fotonpenetreringsdybden, samt den emitterte fotoner deteksjon på grunn av økt diffusjon. Dette er klart synlig i figur 2D som den romlige oppløsningen begynner å avta ved 200 mikrometer under dura-saken i tumoren, men ikke i friske hjernen parenchyma. Videre har den andre-harmonisk generering signal som oppstår from organisert mønster av ikke-centrosymetric molekyler som type I og III kollagen gir en signatur av dura-mater (cyan pseudo-farge i figur 2D og piler). Det må bemerkes at med vår kirurgisk protokoll, vokser svulsten under dura-mater i hjernen parenchyma hvor utviklingen er styrt av de fysiske begrensningene i hjernen. Forseglingen av dura-mater med en tverrbundet dextran-gel hemi-perle forhindrer utslipp av glioma celler i extradural plass.

Ved etterfulgt av intravital to-fotonmikros tumor progresjon mellom forskjellige tidspunkter kan sammenlignes på celleoppløsning. Imaging det samme området på D16 og D27 etter kirurgi (figur 3A) vi fant noen blodårer som er uthevet med piler som var stabile over en periode på 11 dager; på den annen side tumor foran klart infiltrert inn i sunt parenchyma over samme periode. For å evaluere tumor progresjon, sin margin observert på D27 ble skissert med en gul stiplet linje og kledde på bildet tatt på D16. En 520 mikrometer forskyvning av forkanten ble observert konsekvent med den rapporterte proliferativ profil av GL261 glioma modell ^15. Mønstrene i den vaskulære nettverk inne i svulsten var veldig forskjellig på D16 og D27 som indikerer at betydelig vaskulær remodellering forekommer i patologiske områder (figur 3A). På kreft marginer, vi fant også tilfeller av gliomceller detaching fra svulsten kjerne som forventet fra en invasiv svulst. Den mikroskopiske oppløsning på våre bilder viste ikke bare at disse cellene avgir cytoplasmatiske utstikkere til å oppfatte miljøet, men også at de kan bruke blodårer som en matrise for sin progresjon (pilspisser og z-gjenoppbygging i Figur 3B). To-foton mikroskopi tillater dermed å studere cellulære interaksjoner i en virkelig fysiologisk sammenheng. Ved hjelp av transgene dyr hvor hver celle populasjon av interesse eridentifisert av sin egen fluorescerende reporter blir det mulig å se for eksistensen av fysiske interaksjoner mellom kreftceller og deres miljø som viktige regulatorer av sykdomsprogresjon (Figur 3B, høyre).

Figur 1. Oversikt over operasjonen. The kraniotomi utføres på venstre parietal ben (A). Grensene for venstre issebeinet er skissert med en stiplet linje og den fjernede delen er fylt med gult (B). Når kraniotomi utført, blir den parietale cortex eksponert (C), er i området for injeksjon av den sfæroide valgt å ta vare for å unngå hoved blodkar (pil i D) og en 26 gauge nål brukes for å åpne dura mater-( arrow i E). Den spheroid erinjisert og hullet i dura mater-er tilstoppet av en tverrbundet dextran-gel hemi-bead forseglet med cyanoakrylat-lim (pilen i F). Et glass dekkglass er limt til benet samtidig kontakt med hjernen. Dekkglass er ytterligere sementert til utsatt skallen for å sikre langsiktig god forankring av kranie vinduet for kroniske observasjoner (GI). Hele protokollen er kort skjematisert i J. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Tumor vekst er begrenset til hjernen parenchyma og kan overvåkes over tid. AC. Tumorvekst (GL261 cellelinje som uttrykker DsRed2) er observert av macroscopy på operasjonsdagen (DO, A) og på dager 21 (B) og 27 (C). Pilspissen i C fremhever en dråpe dental sement som ikke ble fjernet under punkt 2.3.5. D. Ortogonale rekonstruksjoner hentet fra en 3 x 3 felt kjøpt 0-300 mikrometer under dura-mater i en Thy1-CFP mus bærer en GL261 svulsten ved to-foton mikroskopi på D20 etter operasjonen. Tumor (rød), dura-mater observert av andre-harmoniske generasjon (piler, cyan) og nerveceller (grønt). Legg merke til at svulsten vokser under dura-mater i hjernen parenchyma. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3. Vascular ombygging og kreftceller invasjon kan følges over tid med mobilnettet romlig oppløsning av intra to-foton mikroskopi. A. GL261 svulst (rød) observert på D16 og D27 post-kirurgi etter en intravenøs injeksjon av Cascade-blå dekstran 70 kDa å markere blodkar. Prikket linje: tumor margin på D27; piler: Eksempel på blodårer som kan brukes som landemerker for å lokalisere det samme området på D16 og D27 B.. Enkelte kreftceller (rød) invaderer sunn hjerne parenchyma (nevroner, grønn) ved bruk av blodårer som en matrise for invasjon (pilspisser). Bilder ble tatt ved dybden fra 100 til 150 pm under dura-saken. Prikket linje:. Regionen der den ortogonale rekonstruksjon avbildet i bunnen midtre panelet ble realisert Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Denne tilnærmingen tillater bruk av optiske avbildningsmetoder for å overvåke over dager og uker veksten av en orthotopically implantert glioma. De samme dyr kan deretter bli utsatt for praktisk talt alle hjerneavbildnings modalitet i løpet av den patologi; men de to-fotonmikroskopi bestemt preparat gir en unik mulighet til å oppnå subcellulære oppløsning inne i hjernen av det levende dyr. Vår protokoll presenterer den fordel å håndheve tumorvekst i den cerebrale parenkym fremfor ekstra-durally slik det skjer dersom glioma celler kan forlate den sentrale nervesystemet gjennom den skadede dura. I fravær av fysiske begrensninger som utøves av hjernen miljø, kan svulst celle faktisk spre seg raskere som de ikke trenger å infiltrere parenchyma ^16. Tidligere publiserte metoder gjorde ikke forsøk på å forsegle dura mater etter pode som var enda mer problematisk enn de injiserte suspensjon av celler snarere enn sfæroider^9,13,14. Suspensjoner av cellene er faktisk umulig å søke focally som individuelle celler blir systematisk seeded langs injeksjonskanalen ved uttak pipetten fra dypet til dura-mater.

Den nåværende protokollen kan brukes på ulike musestammer inkludert transgene og immunsupprimerte dyr. Ulike glioma cellelinjer kan bli podet og visualisert, inkludert celler direkte avledet fra humane biopsier, så lenge de er tilført til stabilt uttrykke et fluorescerende reporter før pode. Kirurgisk protokollen kan vanligvis utføres i en time og årskull av dyr kan raskt bli innhentet. Denne fremgangsmåten kan således anvendes til å studere vaskulær remodellering, virkningen av farmakologiske behandlinger på angiogenese og tumorvekst, og rekruttering av immun-celler i tumoren. Ved behov glioma cellemigrering og dynamisk interaksjon mellom glioma celler og mikromiljøet kan observeres i sanntid for flere hours.

Som avbildning kan gjøres over dybder på 500 mikrometer er det mulig å dekke de fleste av tumorvolum i utgangspunktet implantert 200 mikrometer under dura-mater. For å sikre maksimal bildedybde spesielle hensyn må tas under operasjonen for å skape fysisk kontakt mellom dura-mater og glass dekkglass. Dette reduserer faktisk dannelse av arrvev som ellers ville kompromittere optisk klarhet. Absolutt sterilitet av det kirurgiske miljøet bør også følges for å begrense post-kirurgi betennelse som forbigående utydelig vinduet. Vi uansett anbefale å vente 15 dager mellom kirurgi og den første observasjonsperiode for å oppnå optimale bildeforhold. Deretter vindu ble funnet å forbli klare opp til ett år etter operasjonen på sham opererte dyr som gjennomgikk hele protokoll bortsett fra injeksjon av tumor sfæroide.

I konklusjonen, protokollen beskrevet her representerer en forbedring av eksisterende orthotopic glioma mus modell dedikert til kronisk intra to-foton mikroskopi. Den overfladiske injeksjon av en tumor sfæroide, tilstopping av injeksjons spor med en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten, og tetningen av dura mater-tvinge tumorutvikling i hjernen omgivelsene som virkelig sammenfatter de fysiske begrensninger som normalt styrer sykdomsprogresjon. Ikke bare denne metoden vil tjene grunnleggende studier på glioma patofysiologi, men det vil også forbedre relevansen av farmakologiske resultater i prekliniske studier.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne hjertelig takk Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber og A. Jaouen for nyttige diskusjoner; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, de ansatte på Dyreavdelingen ved IBDML og de ansatte på PicSIL bildebehandling plattformen på IBDML for teknisk support. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) til GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) til FD, ved stipend fra Fédération de la Recherche MEDICALE og Cancéropole PACA til CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Medisin glioblastoma multiforme intra to-foton bildebehandling dyremodell kronisk hjerne vindu hjernesvulster nevro-onkologi.