Ортотопическая Глиобластома мышь Модель Поддержание Мозг паренхимы физических ограничений и подходит для прижизненной Двухфотонное микроскопии

Summary

Мы создали корковой ортотопической модели глиобластомы у мышей для прижизненной двухфотонного микроскопии, что повторяет биофизических ограничений обычно при игре в процессе роста опухоли. Хронический стекла замена череп выше опухоли позволяет наблюдение за прогрессированием опухолевого с течением времени по двухфотонного микроскопии.

Abstract

Глиобластомой мозга (GBM) является наиболее агрессивной формой опухоли головного мозга без каких-либо лечебных процедур, доступных на сегодняшний день.

Мышиные модели этой патологии полагаться на инъекции суспензии клеток глиомы в паренхимы мозга следующей разрез твердой мозговой-матер. В то время как клетки должны быть введены поверхностно, чтобы быть доступным для прижизненной двухфотонного микроскопии, поверхностные инъекции не в Повторим патофизиологические условия. Действительно, спасаясь через инъекции тракта большинство опухолевые клетки достигают экстра-дурального пространства, где они расширить аномально быстро в отсутствии механических ограничений из паренхимы.

Наши улучшение состоит не только в фокально имплантации глиомы сфероид, а не путем инъекций суспензии клеток глиомы в поверхностных слоях коры головного мозга, но и в засорение место инъекции с помощью сшитого декстрана гель геми-шарик, который приклеен к surrounдинь паренхимы и опечатаны в длительности матер с цианоакрилата. В целом эти меры применять физиологический расширение и проникновение опухолевых клеток внутри паренхимы мозга. Краниотомия был окончательно закрыт с оконное стекло укрепил к черепу, чтобы позволить хронический изображений над недель в отсутствии развития рубцовой ткани.

Воспользовавшись люминесцентных трансгенных животных, привитых с люминесцентными опухолевых клеток, мы показали, что динамика взаимодействий, происходящих между клеток глиомы, нейронов (например Thy1-CFP мышей) и сосудистой (выделено внутривенной инъекции флуоресцентного красителя) могут быть визуализированы прижизненный двухфотонного микроскопа во время прогрессирования заболевания.

Возможность изображение опухоли на микроскопическом резолюции в минимально угрозу головного среды представляет собой улучшение существующих моделей GBM животных, которые должны принести пользу поле нейро-онкологии и тестирования на наркотики.

Introduction

Глиобластомой мозга появляется как наиболее агрессивной формой опухоли головного мозга у взрослых с медианой выживаемости 12 месяцев и 5-летняя выживаемость 5%. Тактика ведения зависит от хирургии, лучевой и химиотерапии часто используется в комбинации. Тем не менее, влияние этих методов лечения остаются паллиативной ^1-3.

До сих пор, большинство из нейро-онкологии исследований полагаются на методы, которые может предоставить только статический вид и выполненных на больших когорт животных с опухолью в жертву на разных временных точках (см., например, ^4,5). Недавнее развитие методов Последующие меры на основании прижизненной визуализации позволяет изучать рост глиомы и взаимодействия между опухолевыми клетками и их патофизиологической микросреды на того же животного в течение долгого времени. Это открывает путь к эксклюзивному часть информации, которая была до сих пор недостижимым ^6. Трансгенные животные, выражающие флуоресцентные метки в клетках интерес могут быть использованыг для изучения конкретных взаимодействий между опухолевыми клетками, а, например нейронов в этой статье.

За последние десять лет, прижизненный двухфотонного микроскопии ⁷ стала золотым стандартом в фундаментальных исследованиях нейро-онкологии и доклинических испытаний ^8,9 для его способности выполнять глубокий прижизненный наблюдение мозга мыши (> 500 мкм ниже длительности матер) с микрометрический пространственное разрешение ^10. Использование прижизненной двухфотонного микроскопа с ортотопической модели животных с имплантированными хронического черепной окна ^11, можно следовать прогрессии опухоли с течением времени на той же ^9,12 мыши.

Одним из основных недостатков этих ранее опубликованных моделей на животных, однако, что они не имитировать физические ограничения, которые регулируют рост опухоли как твердая мозговая оболочка-не запечатан после инъекции суспензии клеток ^9,13,14. Клеток глиомы могут протекать вэкстрадуральная пространство преобразования ортотопической глиомы в гетеротопической один.

Животной модели, представленные здесь, состоит в инъекции сфероида флуоресцентных клеток глиомы в коре головного мозга на глубину 200 мкм с последующим уплотнением твердой мозговой оболочки-с сшитого декстрана гель геми-шарика и гисто-совместимый клея . Рост опухоли затем ограничивается паренхимы мозга, который поддерживает патофизиологические физические ограничения. Окно хронический стекло имплантировали выше опухоли позволяет легко оптического доступа для прижизненной двухфотонного микроскопии. Использование трансгенных животных выражения флуоресцентные метки в клетках интереса можно выполнить наблюдение за ростом глиомы в течение долгого времени и изучить его взаимодействие с его микросреды (здесь с нейронами и сосудистой выделенных с люминесцентными декстраны).

Protocol

Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с французским законодательством и в соответствии с Директивой Совета Европейского сообщества от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) по уходу и использованию лабораторных животных. Исследование на животных было санкционировано направление Départementale де Услуги Vétérinaires де Буш-дю-Рон (лицензия Д-13-055-21) и одобрены этическим комитетом Лазурный берег, Прованс н ° 14 (проект 87-04122012) .

1. Сфероиды Подготовка

1. Приготовление агарозных покрытием чашки Петри
   1. Смешайте 1 г агарозы с 100 мл среды культуры клеток не дополненной фетальной бычьей сыворотки. Используйте микроволновую печь (850 Вт для 40 сек, затем 3 х 15 сек; перемешивают раствор между каждым микроволновой сессии), чтобы вскипятить раствор и для полного растворения агарозы. Автоклав этот 1% раствор агарозы в течение 20 мин при 120 ° С, чтобы обеспечить STERI. LITY Примечание: Будьте осторожны, чтобы полностью растворить агарозы перед протокола автоклавного. Неоднородность может нарушить образование сфероидов.
   2. После того, как извлечены из автоклава, заливают 10 мл 1% раствора агарозы в 100 х 20 мм чашки Петри. Оставьте чашках Петри 20 мин при комнатной температуре, чтобы позволить 1% раствор агарозы затвердеть.
   3. Добавьте 10 мл PBS выше агарозы, чтобы поддерживать влажность. Закрыть крышку агарозном покрытием чашки Петри, обернув их парафином, чтобы избежать испарения. Чашки Петри можно хранить в течение до 2 месяцев при 4 ° С, если должным образом увлажненный слоем PBS.
2. Сфероид культура
   1. В 75 см ² колбы, культуры в клетки глиомы в рекомендуемом среды в виде монослоя.
   2. Заменить PBS от одного из 1%-ном агарозном покрытием чашке Петри в 1,5 мл переобусловленного "средний", собранных из колбы, содержащей 2D монослой глиомы клеткис.
   3. Извлеките носитель из колбы, содержащей 2D монослой клеток глиомы.
   4. Осторожно промыть монослой с 10 мл PBS.
   5. Добавить 2 мл 0,05% раствора трипсина / ЭДТА и инкубировать колбу 4 мин при 37 ° C. Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от клеточной линии, используемой.
   6. Добавить 8 мл культуральной среды, чтобы остановить действие трипсина, мягко спустить воду в клеточной суспензии. Примечание: Будьте осторожны, не для подачи воздуха в суспензии клеток, поскольку это увеличивает гибель клеток.
   7. Поместите 6 мл клеточной суспензии в стерильной пробирке.
   8. Центрифуга флакон 4 мин при 800 оборотах в минуту.
   9. Удалить супернатант и осторожно приостановить осадок клеток в 3 мл культуральной среды.
   10. Seed клеточной суспензии в подготовленную агарозном покрытием чашке Петри.
   11. Поставьте чашку Петри при 37 ° С в 5% СО ₂ атмосферы от 2 до 3 дней, пока Сфероиды из желаемого диаметра не образуются.
2. Сфероид и Окно Имплантация
1. Подготовка системы впрыска
   1. Чистый стеклянный капилляры (1 мм в диаметре) обработкой ультразвуком в 70% этаноле в течение 10 мин. Промыть два раза с водой перед размещением внутри инкубатора до сухой.
   2. Потяните несколько очищенных стеклянных капилляров с помощью пипетки съемник для подготовки небольшой запас.
   3. Перерыв кончик тянут капилляра царапин на оконечность на кусок тонкой бумаги для получения скошенную оконечность нужного размера: обычно наружным диаметром 300-350 мкм и внутренним диаметром 250-300 мкм. Во время этого процесса формования контролировать диаметр капилляра с помощью которого Макроскоп глазной оснащен градуированной Mira.
   4. Подключение не-скошенный оконечность капилляра в 3-х коллектора с использованием кусок пластиковой трубки, внутренний диаметр соответствует наружному диаметру капилляра.
   5. Использование пластиковой Тубинг, соединить две другие способы многообразия в 25 мкл мкл шприц и к 1 мл шприц с грузом гисто-совместимый минерального масла.
   6. Отрегулируйте многообразие выбора, чтобы установить пути между микролитра шприца и 1 мл шприц. Удалять поршень шприца микролитров и придать минеральное масло назад в микролитров шприца, пока она не просачивается, нажав на поршень 1 мл шприца. Замените поршень микролитра шприца, заботясь, чтобы не оставить пузырьки воздуха в трубке.
   7. Отрегулируйте многообразие выбора, чтобы установить пути между капилляра и 1 мл шприца. Заполните капилляр с минеральным маслом, пока он не просачивается от кончика, заботясь, чтобы не оставить пузырьки воздуха в трубке.
   8. Отрегулируйте многообразие выбора, чтобы установить связь между микролитра шприца и капилляра. Извергните около 10 мкл минерального масла.
   9. Опустите кончик капилляра в раствор PBSи используя датчик на микролитра шприца, сосать в 5 мкл PBS в капилляр. Заметим, что мениск между маслом и PBS четко виден.
   10. Fix капилляр на 3 оси микроманипулятора фитинг под хирургии Макроскоп. Эта система будет использоваться для целевой капилляр в месте инъекции под визуальным контролем.
2. Сфероид имплантация
   1. Слегка степенный мышь при вдыхании Isoflurane в индукционной камере (1,5% в воздухе во время 1 до 1,5 мин).
   2. Обезболить с животным внутрибрюшинно инъекции смеси кетамина / ксилазина (120 мг / кг, 12 мг / кг). Следует отметить, что анестезия часто снижает температуру тела животного. Рекомендуется, чтобы продолжить операции в комнате при 26 ° С и держать животных в тепле с основной thermocontrolled грелку.
   3. Применить глазную мазь, чтобы избежать высыхания глаз.
   4. Бритье головы животного.
   5. Местоживотное в стереотаксической раме с помощью уха баров и мундштук.
   6. Протрите кожу раствор йода (3% мыла, затем 10%-ным раствором).
   7. Сделать 1 см длинный разрез в продольном направлении в середине головы скальпелем. Использование ножницами вырезать и удалить выше теменных костей кожу.
   8. С лезвие скальпеля аккуратно удалите выше черепа надкостницы. Щедро применять цианоакрилат в верхней части кости, чтобы генерировать шероховатую поверхность для последующего присоединения цемента.
   9. Дрель теменной кости под хирургической Макроскоп генерировать трепанации черепа диаметром 4 мм. Великодушно добавить ледяной PBS, содержащий пенициллина (1000 ед / мл) и Streptomicin (1 мг / мл) в течение всей процедуры, чтобы предотвратить нагревание. Удалите небольшие фрагменты костей щипцами и влажной стерильной марлей. Позаботьтесь, чтобы развернуть по крайней мере 1 мм от теменной черепа швов, чтобы избежать кровоизлияния.
   10. Тонкий кость на границе трепанации черепа, где стекло будет закрытой. Цель заключается в еобеспечивать, позже плоская позиционирование оконное стекло с максимальной поверхности контакта между мозгом и стекла. Медленно удалить кости, используя пинцет и чистой лицевая Dura-матер с раствором PBS.
   11. Возьмите диаметр 5 мм круглый стекло покровное, очистить его с алкоголем и высушить его с салфеткой. Попытка использовать покровное в качестве крышки для краниотомии и подтвердить, что большая плоская поверхность мозга попадает в контакте со стеклом. При необходимости удалить покровное для дальнейшего тонкий боковые кости. Продолжать, пока мозг не может получить сжал плоским, если мягко применяя давление на покровное раз на месте.
   12. Очистите снова покровное с алкоголем, высушить его с папиросной бумаги, и сохранить его на части.
   13. С 26 иглы сделать отверстие в твердой мозговой-матер в центре трепанации черепа еще избегая основные кровеносные сосуды. Убедитесь в том, чтобы не повредить паренхимы мозга в качестве цели этой стадии лишь открыть Dura-матер.
   14. Аккуратно очистите длительность матер Wiй раствор PBS для удаления геморрагический кровь. Накрыть куском папиросной бумаги при подготовке инъекции сфероид.
   15. С сфероида системы впрыска, полученного на стадии 2.1, сосать круглый сфероид фитинг капиллярную внутренний диаметр (около 200-250 мкм) из чашки Петри, полученного на стадии 1.2. Сфероид должны прийти вместе с примерно 5 мкл культуральной среды. Следует падают на кончике капиллярности под ее весом.
   16. Снимите папиросную бумагу мокрой используется для покрытия трепанации черепа и позиционировать животное под системой впрыска.
   17. Опустите впрыска пипетки пока он не коснется отверстие, сделанное в длительности матер. Затем опустите его снова на 250 мкм. Подождите 30 сек.
   18. Медленно введите сфероид используя поршень микролитра шприца (2-3 мкл), качая лишнюю жидкость с тонким куском папиросной бумаги. Подождите 30 секунд, а затем осторожно поднимите впрыска пипетки на 50 мкм на поверхность. Подождите снова 30 сек и repeaне т процедуру подъема с шагом 50 мкм до поверхности. Время ожидания позволяет избежать добычу сфероида, что будет придерживаться пипетки.
   19. Подтвердить наличие сфероида в мозге использованием флуоресцентного Макроскоп.
   20. Смешайте диаметром 100-300 мкм сшитый декстран гелевые шарики с PBS раствора в чашке Петри. Подождите 1 мин и рыбу некоторые гидратированных бусы. Поместите их на кости, прилегающей к трепанации черепа.
   21. В соответствии с макроскопической контролем, выбрать один шарик диаметром, аналогичным размеру отверстия длительность оболочки. Разрежьте сшитый гель шарик декстрана в двух половинок с помощью щипцов.
   22. Аккуратно положить сшитый декстран гель геми-бусину в инъекционной отверстие с выпуклой поверхностью в сторону сфероида. Будьте осторожны, не удалите сфероид и слегка нажмите вниз, пока граница вогнутой не войти в контакт с окружающей длительности матер.
   23. Поместите каплю цианакрилатного клея на предметное стекло; окунуть кончик зубочистки в УЦИр взять небольшое количество клея. Быстро запечатать края сшитого декстрана гель геми-шарик на соседнюю длительности матер штамповкой клей вокруг. Позаботьтесь, чтобы выполнить быстрые и точные движения, чтобы избежать склеивания сшитый декстран гель геми-бусину на зубочистку. Избегайте избытка клея, который может распространиться и препятствовать, если не предотвратить изображений только сушат. Подождите 2 мин для клей для просушки, а затем очистите трепанации черепа и окружающей кости раствором PBS.
3. Окно имплантации
   1. Поставьте диаметр 5 мм круглый покровного над трепанации черепа (см. 2.2.12). Края покровного стекла должны быть на разбавленной черепа на внешней стороне краниотомии. Покровное должны быть в контакте с твердой мозговой оболочки-и разбавленной кости по краям. Это очень важно иметь прямой контакт между твердой мозговой-матер и покровного стекла в противном случае рубцовая ткань может развиваться и препятствуют оптическую прозрачность.
   2. С ткани, поглощают PBS на гоэ покровное края так, чтобы решения не в полной мере охватывают трепанации черепа при применении небольшой давление в центре покровного стекла. Это гарантирует, что кость, стекло и мозг склеены на стороне области, представляющей интерес.
   3. Поддерживать небольшой давление в центре покровного стекла с пинцетом, осторожно применяя цианакрилатного на границе между костью и покровного стекла. Клей не будет спонтанно распространяется до поверхности раздела с раствором PBS. Решение будет действовать как барьер данного гидрофобность клея. Уплотнение должно быть эффективным в менее чем за минуту, но принять крайнюю осторожность, чтобы не двигаться покровное, пока она не будет устранена. Это могли бы привести к утечке цианакрилатного на длительности матер следовательно привести к выходу из строя хирургии.
   4. В случае, если клей распространились бы на вершине стекла, удалите его с помощью микро-лезвие скальпеля, делая спиральные движения, как это может иным образом оптическую прозрачность. Следите, чтобы не сломать стекло покровное Даринаг процедура из-за чрезмерного давления.
   5. Объединение стеклянную фиксации с применением стоматологического цемента по краям покровного стекла в сторону смежного черепа. Убедитесь в том, чтобы покрыть всю открытую череп до головы. Использование дополнительного цемента, строить боковые стенки вокруг покровного стекла для создания пула, необходимое для погружения цели. Зубной цемент вылечит менее чем за 10 мин.

3. Послеоперационный уход и подготовка для работы с изображениями

1. Послеоперационный уход
   1. Отключив мышь от стереотаксической рамы, придать Dexamethazon (0,2 мг / кг) и Римадил (5 мг / кг) подкожно в течение тазовой области и заложить ее в клетке с теплой ткани-гнезда.
   2. Монитор животное, пока последствия анестезии не исчезли. В общем 2 до 3 часов после операции, мыши полностью мобильны. Убедитесь в том, что животное имеет легкий доступ к пище и воде. Обеспечить животное с агарозном содержащие глюкозы (агарозы3%, глюкоза 3%).
   3. Монитор массы животного ежедневно и придать Dexamethazon (0,2 мг / кг) и Римадил (5 мг / кг) подкожно в первый 10d после операции. По этическим соображениям, усыпить мышей, когда потеря превышает 15% от своего первоначального веса. Внутричерепное давление увеличивается с размером опухоли, ведущие к двигательными возможностями для животного. Это линия клеток опухоли зависит и происходит на различных задержек после операции. Особое внимание должно быть принято характеризовать конечную эксперимента с клеточной линии, используемой.
2. Подготовка для работы с изображениями
   1. Слегка успокоительное мыши при вдыхании Isoflurane в индукционной камере (1,5% в воздухе в течение от 1 до 1,5 мин).
   2. Обезболить с животным внутрибрюшинно инъекции смеси кетамина / ксилазина (100 мг / кг, 10 мг / кг). Такой наркоз обычно позволяет 45 мин наблюдения. Для выполнения более длинные сеансы визуализации, мышь находится под непрерывным вдыхания Isoflurane ввоздух (0,25-0,75%).
   3. Применить глазную мазь, чтобы избежать высыхания глаз.
   4. Положите животное на стереотаксической рамки и блокировать череп с earbars.
   5. Чтобы визуализировать кровеносные сосуды, флуоресцентный краситель может быть введен внутривенно.
   6. Если окно появляется грязный, его можно очистить путем осторожного удаления мусора с тонким лезвием и углу ткани. Не следует использовать спирт для очистки окна, как это не всегда совместимы с зубным цементом и она может охлаждать мозг под окном.

Representative Results

После хирургического протокола выполняется (рис. 1), животные не могут наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии в течение нескольких недель, пока жертвы. Воспалительная реакция может наблюдаться после операции, которая исчезает в течение одной или двух недель. Рост опухоли можно наблюдать с помощью различных методик микроскопии в том числе люминесцентных макроскопии и двухфотонного микроскопии (рис. 2). Пример изображения, изображенные здесь были реализованы на флуоресценции Макроскоп и двухфотонного микроскопа, соединенного с фемтосекундного импульсного лазера инфракрасного перестраиваемой и дома-модифицированной, чтобы позиционирование животных под 20-кратным глубоководное погружение цели (1.0NA).

Развитие опухоли оценивалась в течение долгого времени с помощью флуоресцентного Макроскоп сочетая косой освещение для светлого поля отражения изображений и эпифлуоресцентной излучения (рис. 2A-2C). Выбор порога флуоресценции легко дает доступ к области опухоли в то время как удобicial сосудистую отсоединить как темные структуры из белом фоне видимого светового изображения. С другой стороны, прижизненный двухфотонного микроскопия позволяет г-секционирования и ортогональных реконструкции крупных полей зрения с субклеточной резолюции (см. дендритов в рисунке 2D). Использование трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес (например, мыши Thy1-CFP, которые экспрессируют белок Cyan Fluorescent в нейронах, зеленый цвет псевдо-2D на рисунке) можно наблюдать прогрессии опухоли в нейрональной микро-среде. Тем не менее, следует отметить, что плотность клеток опухоли может ограничить глубину проникновения фотонов, а также обнаружение излучаемого фотона в связи с увеличением диффузии. Это отчетливо видно на рисунке 2D как пространственное разрешение начинает уменьшаться в 200 мкм ниже длительности вещества в опухоли, но не в здоровой паренхимы мозга. Кроме того, сигнал генерация второй гармоники, возникающие сюдам организовал модели без centrosymetric молекул, таких как тип я и III коллаген обеспечивает подпись длительность матер (голубой псевдо-цвета на рисунке 2D и стрелками). Следует отметить, что с нашим хирургического протокола, опухоль растет ниже твердой мозговой оболочки-в паренхиме головного мозга, где ее развитие регулируется физических ограничений мозга. Уплотнение твердой мозговой оболочки-с сшитого декстрана гель геми-шарик предотвращает выход клеток глиомы в экстрадуральной пространстве.

Когда затем прижизненной двухфотонного микроскопии прогрессирование опухоли между различных временных точках можно сравнить на клеточном разрешении. Визуализация и ту же область на D16 и D27 послеоперационной (фиг.3А), мы обнаружили некоторые кровеносные сосуды, как тот, выделенного стрелками, которые были стабильны в течение 11 дней; с другой стороны передней опухоль четко проникли в здоровой паренхимы за тот же период. Для оценки прогрессии опухоли, ее маrgin наблюдается при D27 была изложена с желтым пунктиром и накладывается на картинке, принятым на D16. 520 мкм сдвиг переднего края наблюдалось последовательно с отчетный пролиферативной профилем GL261 глиомы модели ^15. Узоры сети сосудов внутри опухоли были очень разные на D16 и D27 указывая, что значительная ремоделирования сосудов происходит в патологических зонах (рис. 3А). В опухолевых маржи, мы также обнаружили, случаи клеток глиомы отсоединение от ядра опухоли как ожидалось от инвазивной опухоли. Микроскопическая разрешение наших изображений показал, что не только эти клетки выделяют цитоплазматические выпячивания в смысле окружающей среды, но и что они могут использовать кровеносные сосуды в виде матрицы для их продвижения (наконечники стрел и г-реконструкции в рис. 3б). Таким образом, Двухфотонное микроскопия позволяет изучать клеточные взаимодействия в подлинно физиологическом аспекте. Использование трансгенных животных, где каждая ячейка население Процентыидентифицируется собственным флуоресцентного репортера становится возможным искать существования физических взаимодействий между опухолевыми клетками и окружающей их средой, как ключевых регуляторов прогрессирования заболевания (рис. 3В, справа).

Рисунок 1. Обзор хирургии. Краниотомия выполняется на левой теменной кости (А). Пределы левой теменной кости очерчены пунктирной линией и удаляют часть заполнена в желтый (B). После того, как трепанация черепа выполнена, теменная кора подвергается (C), область для инъекций сфероида выбран избегая основные кровеносные сосуды (стрелка на D) и 26 игла используется, чтобы открыть Dura-матер ( стрелка на Е). Сфероидвводят и отверстие в твердой мозговой-матер засорен по сшитого декстрана гель геми-шарик запечатанную цианакрилатного клея (стрелка в F). Покровным стеклом приклеен к кости, сохраняя при этом контакт с мозгом. Покровное более укрепил к открытой черепа, чтобы обеспечить долгосрочный прочную привязанность черепной окна для хронических наблюдений (GI). Весь протокол кратко схематически в J. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Рост опухоли ограничивается паренхиме головного мозга и может контролироваться с течением времени. Переменного тока. Рост опухоли (GL261 клеточная линия выражая DsRed2) наблюдается по мacroscopy на день операции (DO, А) и в дни 21 (В) и 27 (С). Стрелка в C выделяет каплю зубным цементом, который не был удален на стадии 2.3.5. D. Ортогональные реконструкции, полученные из области 3 х 3, приобретенного от 0 до 300 мкм ниже длительности матер в мыши Thy1-CFP, несущей опухоль GL261 двухфотонной микроскопии на D20 послеоперационной. Опухоль (красный), длительность матер наблюдали генерации второй гармоники (стрелки, голубой) и нейронов (зеленый). Обратите внимание, что опухоль растет ниже длительности матер в паренхимы мозга. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Vascular реконструкции и опухолевые клетки вторжение можно контролировать в течение долгого времени с сотовой пространственным разрешением по прижизненной двухфотонного микроскопии. . Опухоли GL261 (красный) наблюдается при D16 и D27 после операции после внутривенной инъекции Каскад-голубой декстран 70 кДа, чтобы подчеркнуть кровеносные сосуды. Пунктирная линия: маржа опухоли с D27; Стрелки: Пример кровеносных сосудов, которые могут быть использованы в качестве ориентиров для локализации и ту же область на D16 и D27. B. Отдельные клетки опухоли (красный) вторгнуться в здоровой паренхимы мозга (нейроны, зеленый) с помощью кровеносных сосудов в качестве матрицы для вторжения (наконечники стрел). Изображения были приняты на глубине от 100 до 150 мкм ниже твердой мозговой материи. Пунктирная линия:. Регион, где ортогональная реконструкция изображен в нижней центральной панели был реализован Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Discussion

Такой подход позволяет использовать методы оптических изображений для мониторинга за дни и недели рост на ортотопически имплантированного глиомы. То же самое животное может впоследствии быть подвергнут практически любого визуализации головного мозга модальности в ходе патологии; еще два-фотонной микроскопии конкретных подготовка предлагает уникальную возможность для достижения субклеточную разрешение внутри мозга живого животного. Наш протокол имеет преимущество для обеспечения рост опухоли в церебральной паренхиме, а не экстра-durally, как это происходит, если клетки глиомы могут оставить на центральную нервную систему через поврежденную твердой мозговой оболочки. При отсутствии физических ограничений, оказываемого на окружающую среду мозга, клеток опухоли действительно может размножаться быстрее, так как они не должны проникать в паренхиму ^16. Ранее опубликованные методы не пытался запечатать твердую мозговую оболочку после прививки, которая была все более проблематичным, чем они вводили суспензии клеток, а не сфероидах^9,13,14. Суспензии клеток действительно невозможно применить фокально как отдельные клетки высевают систематически вдоль тракта впрыска при снятии пипетку с глубины до твердой мозговой-оболочки.

Текущий протокол может применяться на различных линий мышей в том числе трансгенных и ослабленным иммунитетом животных. Различные линии глиомы клеток могут быть привиты и визуализировали, в том числе клеток непосредственно полученных из человеческих биопсии тех пор, пока они трансфицируют в стабильной экспрессии флуоресцентный репортерный предварительное прививки. Хирургический протокол может быть, как правило, выполняется в 1 ч и когорты животных быстро могут быть получены. Этот подход, таким образом, может быть использован для изучения реконструкции сосудов, эффекты фармакологического лечения на ангиогенез и рост опухоли, а также вербовку иммунных клеток в опухоли. При необходимости миграции клеток глиомы и динамические взаимодействия между клеток глиомы и микросреды можно наблюдать в реальном времени в течение нескольких хоуRS.

Как изображения может быть сделано в течение глубине 500 мкм можно покрыть большую часть объема опухоли изначально имплантировали 200 мкм ниже длительности оболочки. Для обеспечения максимальная глубина визуализации особое внимание должно быть принято во время операции, чтобы создать физический контакт между твердой мозговой-матер и покровного стекла. Это действительно уменьшает образование рубцовой ткани, которые могли бы поставить под угрозу оптическую прозрачность. Абсолютная стерильность хирургического среды также должны быть соблюдены, чтобы ограничить после операции воспаление, которое временно стирает окно. Мы в любом случае советую подождать 15 дней между хирургии и первой сессии наблюдения, чтобы получить оптимальные условия визуализации. После этого окно было установлено, остаются прозрачными до одного года после операции на ложнооперированных животных, подвергшихся весь протокол за исключением инъекции сфероида опухоли.

В заключение, протокол, описанный здесь представляет собой улучшение существующих Ортotopic модель глиомы мыши посвящена хронической прижизненной двухфотонного микроскопии. Поверхностный инъекция сфероида опухоли, засорение инъекции отслеживать с сшитого декстрана гель геми-шарика и герметизации твердой мозговой-матер обеспечения соблюдения развитие опухоли в среде мозга, которые действительно повторяет физические ограничения обычно, регулирующие развитие болезни. Не только этот метод будет служить фундаментальные исследования по глиомы патофизиологии но она также будет повысить релевантность фармакологических результатов во время доклинических испытаний.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы тепло поблагодарить д-ра К. К. Фенрих, доктор MC. Amoureux, П. Вебер и А. Jaouen за полезные обсуждения; М. Hocine, С. Менье, М. Metwaly, С. Bensemmane, Дж. Bonnardel, сотрудники вивария при IBDML и персонала изображений платформы PicSIL на IBDML на техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами от Национального института дю рака (ИНКА-DGOS-INSERM6038) в ОТО, Национальное агентство по де-ла-Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), федерация Pour La по исследованиям Cerveau (FRC) для ФО, на стипендии из федерации де-ла-Recherche Médicale и Cancéropole Лазурный Берег в ЧР.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Медицина выпуск 86 глиобластомой мозга прижизненной визуализации двухфотонная животная модель хронический черепной окно опухоли головного мозга нейро-онкологии.