Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Summary

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM), bugüne kadar hiçbir iyileştirici tedaviler ile beyin tümörlerinin en agresif formudur.

Bu patolojinin murin modelleri dura mater-kesi sonra beyin parankiması içine glioma hücre süspansiyonunun enjekte dayanır. Hücreler Intravital iki foton mikroskopi için erişilebilir olması yüzeysel enjekte edilir ise, yüzeysel enjeksiyonlar fizyopatolojik koşullarını özetlemek için başarısız. Nitekim, enjeksiyon yolu ile kaçan çoğu tümör hücreleri parankimden mekanik kısıtlamaların yokluğunda anormal hızlı genişletmek ekstra dural alan ulaşır.

Bizim gelişmeler fokal bir glioma sfero yerleştirilmesi yerine, serebral korteks yüzeysel katmanlarında glioma hücrelerinin bir süspansiyonu enjekte değil, aynı zamanda bir ortamda yapıştırılmış bir çapraz bağlı dekstran jel hemi-boncuk ile enjeksiyon yerinde tıkanma değil sadece oluşmaktadırding parankimi ve siyanoakrilatın ile dura mater-mühürlü. Toplamda bu önlemler, beyin dokusu içinde, tümör hücrelerinin genişleme ve fizyolojik infiltrasyonu uygulanması. Bir cam pencere skar dokusu gelişimi yokluğunda hafta içinde kronik görüntüleme izin kafatasına çimentolu ile Kranyotomi nihayet kapatıldı.

Biz glioma hücreleri, nöronlar (örn. Thy1-CFP fare) ve vasküler bir floresan boya (intravenöz enjeksiyon ile vurgulanır) arasında meydana gelen etkileşim dinamikleri intravital ile görselleştirilebilir göstermiştir floresan tümör hücreleri ile aşılanmış floresan transgenik hayvanların yararlanarak Hastalığın ilerlemesi sırasında iki foton mikroskopisi.

Minimal tehlikeye serebral ortamında mikroskobik çözünürlükte görüntünün bir tümör olasılığı nöro-onkoloji ve uyuşturucu testi alanını yararına olmalıdır cari GBM hayvan modellerinde bir gelişmeyi temsil etmektedir.

Introduction

Glioblastoma multiforme 12 aylık bir medyan sağkalım ile erişkinlerde beyin tümörü en agresif formu ve% 5, 5-yıllık sağkalım oranı olarak beliriyor. Klinik tedavi cerrahi, radyoterapi ve sık sık birlikte kullanılan kemoterapi dayanır. Ancak bu tedavilerin etkisi ^1-3 palyatif kalır.

Şimdiye kadar, nöro-onkoloji çalışmaların çoğu (örneğin ^4,5) bakın sadece statik bir görünüm sağlayabiliyoruz ve tümör taşıyan hayvanların büyük kohortlar gerçekleştirilen farklı zaman noktalarında kurban teknikleri güveniyor. Intravital görüntüleme göre izleme yöntemlerinin son gelişmeler glioma büyümesi ve tümör hücrelerinin ve zaman içinde aynı hayvan üzerinde kendi patofizyolojik mikro arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde sağlar. Bu ⁶ ana kadar ulaşılmaz bilgi oldu seçkin parçasına yol açar. Ilgi hücrelerinde floresan etiketler ifade eden transjenik hayvanların kullanımı olabilir,Bu yazıda, tümör hücreleri ve nöronlar arasındaki örneğin belirli etkileşimleri çalışmak d.

Geçtiğimiz on yıl içinde, intravital iki-foton mikroskopi ⁷ (> 500 dura-mater altında mikron) temel nöro-onkoloji çalışmaları ve klinik öncesi denemeler fare beyninin derin Intravital gözlem gerçekleştirme yeteneği için ^8,9 bir altın standart haline gelmiştir mikrometrik uzamsal çözünürlük ^10. Kronik kafatası pencere ^11, implante orthotopical hayvan modelleri intravital iki foton mikroskobu kullanarak, aynı fare ^9,12 üzerinde zamanla tümör ilerlemesini takip etmek mümkündür.

Bu, daha önce yayınlanmış hayvan modellerinin en önemli dezavantajlarından biri, dura mater-hücre süspansiyonu ^9,13,14 enjeksiyonundan sonra kapalı değildir gibi tümör gelişimini düzenleyen fiziksel kısıtlamaları taklit kalmamasıdır ancak bir. Glioma hücre sızabilenheterotopik birine ortotopik glioma modeli dönüştürüyor epidural boşluk.

Burada sunulan hayvan modeli, bir çapraz-bağlanmış jel hemi-dekstran boncuk ve histo-uyumlu yapıştırıcı ile dura mater-sızdırmaz ardından 200 um'lik bir derinlikte serebral kortekste floresan glioma hücrelerinin bir sferoit olması ile enjekte edilmesini kapsar . Tümör büyümesi patofizyolojik fiziksel kısıtlamaları muhafaza beyin parankiması ile sınırlandırılmıştır. Tümörün Yukarıdaki implante kronik bir cam pencere Intravital iki-foton mikroskopi için kolay bir optik erişim sağlar. Zamanla glioma büyüme takibini gerçekleştirmek ve (floresan Dekstranların vurgulanır nöronlar ve damar burada) olan mikro ile etkileşimini incelemek mümkündür ilgi hücrelerinde floresan etiketleri sentezleyen transgenik hayvanlar kullanma.

Protocol

Tüm deneysel prosedürleri laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Fransız mevzuatına uygun olarak ve 24 Kasım Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi, 1986 (86/609/EEC) uygun olarak yapılmıştır. Hayvanlar üzerinde araştırma Yön Départementale des Hizmetler Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (lisans D-13-055-21) tarafından yetkilendirilmiş ve Provence Cote d'Azur n ° 14 (Proje 87-04.122.012) etik komitesi tarafından onaylandı .

1.. Sferoitlerin Hazırlık

1. Agaroz kaplı Petri yemeklerin hazırlanması
   1. Fetal sığır serumu ile takviye edilmiş olmayan hücre kültür ortamı, 100 ml agaroz 1 g karıştırın. Bir mikrodalga fırın için (40 saniye boyunca 850 Watt, daha sonra 3 x 15 saniye, her mikrodalga oturum arasında solüsyonu ilave edin) çözeltisi kaynamaya ve agaroz tamamen çözünmesi için. Steri sağlamak için 120 ° C de 20 dakika boyunca, bu,% 1 agaroz çözeltisi otoklav. vasıflı Not: Tamamen otoklav protokolden önce agaroz çözmek için özen. İnhomojenlik küremsiler oluşumunu olumsuz yönde etkileyebilir.
   2. Bir kez otoklavdan alınır, 100 x 20 mm Petri tabaklarda% 1 agaroz çözeltisi 10 ml dökün. % 1 agaroz çözelti katılaşmasını sağlamak için oda sıcaklığında Petri-tabaklar 20 dakika bırakın.
   3. Nem elde etmek için agaroz üzerinde PBS 10 ml ilave edilir. Buharlaşmayı önlemek için parafilm ile sarılarak agaroz kaplı Petri kutularına kapağını sıkıca kapatın. Düzgün PBS tabakası ile nemlendirilir ise Petri kapları, 4 ° C 'de en fazla 2 ay boyunca saklanabilir.
2. Sferoid kültür
   1. Bir tek tabaka olarak tavsiye edilen ortam içinde, 75 cm ² şişe, kültüründe glioma hücreleri.
   2. Glioma hücre 2B tek tabaka ihtiva eden bir şişeye toplanan "ön şartlandırılmış ortam" 1,5 ml,% 1 agaroz kaplı Petri kabı birinden yerine PBSs.
   3. Glioma hücrelerinin 2B tek tabaka içeren şişeden gelen orta çıkarın.
   4. Yavaşça, 10 ml PBS ile tek tabaka yıkayın.
   5. Bir tripsin / EDTA solüsyonu% 0.05 'lik 2 ml ilave edilir ve 37 ° C Not şişe 4 dakika inkübe: Kuluçka süresi, kullanılan hücre hattına göre değişebilir.
   6. Yavaşça hücre süspansiyonu, floş Tiripsinin eylemi durdurmak için kültür ortamı 8 ml Not:. Hücre ölümünü artırır gibi hücre süspansiyonu hava temizlemesini dikkat edin.
   7. Steril bir şişe içinde hücre süspansiyonu 6 ml koyun.
   8. 800 rpm'de 4 dakika santrifüj şişe.
   9. Süpernatantı ve yavaşça kültür ortamının 3 ml hücre tortu askıya.
   10. Hazırlanan kaplanmış agaroz Petri kabındaki hücre süspansiyonu tohum.
   11. Arzu edilen çapta sferoidler oluşana kadar 2-3 gün boyunca bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de Petri kabı koyun.
2.. Sferoid ve Pencere İmplantasyonu
1. Enjeksiyon sisteminin hazırlanması
   1. 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde sonikasyon ile temiz bir cam kılcal kısımların (çapı 1 mm). Kadar kuru kuvözde su önce yerleştirilmesi ile iki kez durulayın.
   2. Küçük bir stok hazırlamak için bir pipet çektirmesi ile birkaç temizlenmiş cam kılcal damarları çekin.
   3. Tipik olarak 300-350 mikron bir dış çapı ve 250-300 um'lik bir iç çapı: istenen boyutta bir eğimli ekstremite elde etmek için doku bir kağıt parçası üzerine ekstremite kazımayla çekilmiş kılcal ucu kırın. Bu şekil verme işlemi sırasında, oküler dereceli bir mira ile donatılmış bir Makroskop'ta kullanarak kılcal çapını kontrol eder.
   4. Iç çap kapiller dış çapını uygun plastik boru bir parça kullanarak 3 yollu bir manifolda kılcal olmayan şivli ekstremite bağlayın.
   5. Plastik Tubin kullanmag, bir Manifolddaki iki başka yollar bağlamak 25 ul mikrolitre şırınga ve histo-uyumlu mineral yağ ile dolu bir 1 ml şırınga.
   6. Mikrolitre şırınga ile 1 ml şırınga ile bir yol oluşturmak için çeşitli seçme ayarlayın. Kaldırmak mikrolitre şırınga piston ve 1 ml şırınganın pistonu iterek dışarı sızar kadar mikrolitre şırınga içine geriye madeni yağ enjekte. Bakımı tüp içinde hava kabarcıkları bırakmak için ise mikrolitre şırınga pistonu değiştirin.
   7. Kılcal ve 1 ml şırınga ile bir yol oluşturmak için çeşitli seçme ayarlayın. Tüp içinde hava kabarcıkları bırakmamaya dikkat çekerken bunun ucundan dışarı sızar kadar mineral yağı ile kılcal doldurun.
   8. Mikrolitre şırınga ile kılcal arasında bir bağlantı kurmak için manifoldu seçici ayarlayın. Mineral yağ, yaklaşık 10 ul boşaltınız.
   9. PBS çözeltisi içine kılcal ucu Dipve mikrolitre şırınga ölçer kullanarak, kılcal PBS 5ml'lik emmek. Petrol ve PBS arasındaki menisküs açıkça görülebilir olduğuna dikkat edin.
   10. Cerrahi Makroskop'ta altında uydurma bir 3 eksenli mikromanipülatör kılcal düzeltmek. Bu sistem, görsel kontrol altında enjeksiyon yerinde için kılcal hedeflemek için kullanılacaktır.
2. Sferoid implantasyonu
   1. Hafifçe (1-1,5 dakika boyunca hava içinde% 1.5), bir indüksiyon odasında İsofluranın soluma ile fare sakinleştirici.
   2. Ketamin / Xylazine (120 mg / kg, 12 mg / kg) bir karışımı, bir intra-peritoneal enjeksiyonu ile hayvan anestezisi. Anestezi genellikle hayvanın vücut sıcaklığını azaltır unutmayın. Bu 26 ° C'de bir odada cerrahi ile devam etmek ve altta yatan bir ısı kontrollü ısıtma pedi ile hayvan sıcak tutmak için tavsiye edilir.
   3. Gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi sürün.
   4. Hayvanın derisi tıraş.
   5. Yerkulak çubukları ve bir ağızlık ile bir stereotaktik çerçeve içinde bir hayvan.
   6. Povidon iyot (% 3 sabun, sonra% 10 çözeltisi) ile cildi temizleyin.
   7. Bir neşter ile kafa derisi ortasında uzunlamasına bir 1 cm uzunluğunda kesi olun. Makas parietal kemikler üzerinde deriyi kesip kaldırmak.
   8. Bir neşter bıçağı ile yavaşça kafatası üzerinde periost çıkarın. Cömertçe sonra çimento bağlılık için pürüzlü bir yüzey oluşturmak için kemik üstüne siyanoakrilat geçerlidir.
   9. 4 mm çaplı kranyotomi oluşturmak için bir cerrahi Makroskop'ta altında parietal kemik Matkap. Cömertçe ısınmasını önlemek için, bütün işlem sırasında penisilin (1000 U / ml) ve Streptomicin (1 mg / ml) içeren buz gibi soğuk PBS ilave edin. Forseps ve ıslak steril bir gazlı bez ile küçük kemik parçaları çıkarın. Uzak kanamalar önlemek için parietal kafatası sütür en az 1mm matkap özen gösterin.
   10. Cam pencere kapalı olacak kraniotomi sınırında ince kemik. Amaç e olanbeyin ve cam arasında maksimum temas yüzeyi ile cam pencerenin nsure daha sonra düzlemsel yerleştirme. Yavaş yavaş bir forseps kullanarak kemiği kaldırmak ve PBS çözeltisi ile maruz dura-mater temizleyin.
   11. , 5 mm çapında yuvarlak cam lamel alın alkol ile temizlenmesi ve kağıt mendil ile kurulayın. Kraniotomi için bir kapak olarak lamel kullanımı ve beynin büyük bir düz yüzeye cam ile temas alır onaylamak için deneyin. Gerekirse lamel için daha ince yan kemikleri çıkarın. Yavaşça yerine kez lamel üzerinde baskı uygulayarak eğer beyin düz sıkılmış kadar devam edin.
   12. Tekrar alkol ile lamel temizleyin, kağıt mendil ile kurulayın ve ayrı kaydedin.
   13. 26 gauge iğne ile henüz ana kan damarlarının kaçınarak kraniotomi merkezinde dura-mater bir delik yapmak. Sadece dura-mater açmak için bu adımın amacı olarak beyin dokusunda olduğu zarar için değil emin olun.
   14. Yavaşça dura mater-wi temizleyinhemorajik kan kaldırmak için PBS çözüm inci. Sfero enjeksiyon hazırlarken doku kağıt parçası ile örtün.
   15. Aşama 2.1 'de hazırlanan küremsi enjeksiyon sistemi ile, aşama 1.2' de hazırlanan Petri çanağından kılcal iç çapa (yaklaşık 200-250 um) uygun yuvarlak sfero emmek. Sferoid yaklaşık 5 ul kültür ortamı ile birlikte gelmelidir. Onun ağırlığı altında kılcallığı ucu aşağı düşmek gerekir.
   16. Kraniotomi kapak ve enjeksiyon sistemi altında hayvan konumlandırmak için kullanılan ıslak mendil kağıdı çıkarın.
   17. Bu dura-mater yapılan delik değene kadar enjeksiyon pipet indirin. Ardından, 250 um tarafından tekrar düşürmek. 30 saniye bekleyin.
   18. Yavaş yavaş kağıt mendil ince bir parça ile fazla sıvıyı dışarı pompalama sırasında mikrolitre şırınga pistonu (2-3 | il) kullanılarak, küremsi enjekte edilir. 30 saniye bekleyin ve sonra hafifçe yüzeyine doğru 50 mikron ile enjeksiyon pipet kaldırın. 30 sn ve repea tekrar bekleyinyüzeyine kadar 50 um 'lik adımlarla ile kaldırma işlemi t. Bekleme sürelerini pipet sadık kalacağına sfero çıkarma önler.
   19. Bir floresan Makroskop'ta ile beyindeki sfero varlığını teyit edin.
   20. 100-300 mikron çapında bir Petri tabağına PBS çözeltisi ile çapraz bağlanmış jel dekstran boncuk karıştırın. 1dk bekleyin ve bazı hidrate boncuk balık. Kraniotomi bitişik kemik üzerine koyun.
   21. Makroskopik denetimi altında, dura mater-açılış büyüklüğüne benzer bir çapı olan bir boncuk seçin. Forseps kullanılarak iki yarım çapraz bağlı dekstran boncuk jel kesin.
   22. Yavaşça sfero doğru dışbükey yüzü enjeksiyon deliğine bir çapraz bağlı dekstran jel hemi-boncuk koydu. Konkav sınır çevreleyen dura mater-temas elde edene kadar yavaşça aşağı doğru sfero ve basın kaldırmak için özen gösterin.
   23. Bir cam slayt siyanoakrilat tutkal bir damla koyun; dro içine bir kürdan ucu daldırmayapıştırıcı bir miktar almak s. Çabuk yaklaşık tutkal damgası olarak bitişik dura mater-için, çapraz bağlanmış jel hemi-dekstran boncuk kenarlarını kapatırlar. Kürdan çapraz bağlı dekstran jel hemi-boncuk yapıştırma önlemek için hızlı ve doğru hareketleri gerçekleştirmek için özen gösterin. Kurutulmuş kez görüntüleme engel değilse yaymak ve engelleyebilir tutkal aşırı kaçının. Tutkal kuru ve daha sonra PBS çözeltisi ile kraniyotomi ve çevresindeki kemik temizlemek için 2 dakika bekleyin.
3. Pencere implantasyonu
   1. Kraniotomi yukarıdaki lamel yuvarlak 5 mm çapa koyun (2.2.12 bakınız). Örtücü camın kenarları, kraniyotomi dış de kafatası, inceltilmiş olmalıdır. Lamel kenarlarında dura mater-inceltilmiş ve kemik ile temas halinde olmalıdır. Aksi skar dokusu optik netlik geliştirmek ve engelleyebilirler dura-mater ve cam lamel arasında doğrudan bir temas olması çok önemlidir.
   2. Bir doku ile, inci PBS absorbelamel merkezinde küçük bir basınç uygularken, e bir örtücü cam, kenarları bu çözüm bu nedenle tam olarak kraniotomiye kapsamaz. Bu, kemik, cam ve beyin ilgili bölgenin tarafında birbirine yapıştırılmış sağlayacaktır.
   3. Yavaşça kemik ve lamel arasındaki sınırda siyanoakrilat uygularken, bir forseps ile lamel merkezinde küçük bir basınç muhafaza edin. Tutkal kendiliğinden PBS çözeltisi ile arayüzü kadar yayılacak. Çözüm tutkal hidrofobiklik verilen bir engel olarak hareket edecektir. Sızdırmazlık bir dakikadan daha az etkili olabilir ama o sabit kadar lamel taşımak için değil, aşırı dikkat etmelisiniz. Bu başka türlü dura mater-dolayısıyla cerrahi bir başarısızlığa yol üzerinde siyanakrilat sızıntıya neden olur.
   4. Tutkal cam üstüne yayılmış olurdu durumda aksi optik netlik azaltabilir gibi, spiral hareketler yaparak bir mikro-neşter bıçak kullanarak kaldırabilirsiniz. Cam lamel Durin kırmamaya dikkatg aşırı basınç nedeniyle prosedür.
   5. Bitişik kafatası doğru lamel kenarlarında dental çimento uygulayarak cam fiksasyon birleştirin. Kafa derisi kadar tüm maruz kafatası kapsayacak emin olun. İlave çimento kullanarak, amacın daldırma için gerekli havuzu oluşturmak için lamel etrafında yan duvarlar ördün. Diş çimento az 10 dakika içinde tedavi edecek.

3. Post-operatif Bakım ve Görüntüleme için Hazırlık

1. Post-operatif bakım
   1. Stereotaktik çerçeve fareyi çıkarın, Deksametazon (0.2 mg / kg) ve Rimadyl pelvik bölgeler üzerinde (5 mg / kg) sc enjekte ve sıcak bir doku-yuva ile onu kafesine yatıyordu.
   2. Anestezi etkileri yok kadar hayvan izleyin. Ameliyattan sonra genel 2-3 saat içinde, fareler tamamen mobil. Hayvansal gıda ve suya kolay erişimi olduğundan emin olun. Agaroz ihtiva eden glikoz ile (hayvan sağlamak agaroz% 3, glukoz% 3).
   3. Her gün, hayvan ağırlığı izlemek ve ameliyat sonrası ilk 10d için Deksametazon (0.2 mg / kg) ve Rimadyl (5 mg / kg) sc enjekte edilir. Kaybı, orijinal ağırlığının% 15 aştığında etik hususlar için, fareler euthanize. Kafa içi basınç hayvan için, motor bozukluklara yol açan tümör boyutu artar. Bu bağımlı tümör hücre hattı ve çeşitli gecikmeler ameliyat sonrası oluşur. Özel bakım kullanılan hücre hattı ile Deneyin son nokta karakterize etmek için alınmalıdır.
2. Görüntüleme için hazırlık
   1. Hafif bir indüksiyon odası (1-1,5 dakika boyunca hava içinde% 1.5), izofluran teneffüs ile fare sakinleştirici.
   2. Ketamin / Xylazine (100 mg / kg, 10 mg / kg) bir karışımı, bir intra-peritoneal enjeksiyonu ile hayvan anestezisi. Böyle bir anestezi genellikle gözlem 45 dakika izin verir. Uzun görüntüleme oturumları gerçekleştirmek için, fare içinde İsofluranın sürekli solunması altına yerleştirilirhava (% 0.25-0.75).
   3. Gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi sürün.
   4. Stereotaktik çerçeve üzerinde hayvan koyun ve earbars ile kafatası engellemek.
   5. Kan damarları görselleştirmek için, bir flüoresan boya intravenöz olarak enjekte edilebilir.
   6. Penceresi kirli görünüyorsa, yavaşça ince bir bıçak ve bir doku köşesi ile enkaz kaldırarak temizlenebilir. Her zaman diş çimento ile uyumlu değildir ve bu pencerenin altındaki beyin serin gibi penceresini temizlemek için alkol kullanmayın.

Representative Results

Cerrahi protokolü (Şekil 1) gerçekleştirildiğinde, hayvanların kurban edilmesine dek hafta boyunca floresan mikroskobu ile gözlenebilir. Inflamatuar reaksiyon, bir ya da iki hafta içinde kaybolur ameliyattan sonra gözlenebilir. Tümör büyümesi floresan makroskopi ve iki foton mikroskobu (Şekil 2) dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi teknikleri ile gözlenebilir. Burada tasvir örnek görüntüler bir floresan Makroskop'ta ve femtosaniye darbeli kızılötesi ayarlanabilir lazer ve ev-modifiye 20X suya daldırma hedefi (1.0NA) aşağıda hayvan konumlandırma izin bağlanmış bir iki foton mikroskop gerçekleştirilmiştir.

Tümör gelişimi parlak saha yansıma görüntüleme ve epifloresans emisyon (Şekil 2A-2C) için eğik aydınlatma birleştiren bir floresan Makroskop'ta kullanılarak zaman tahmin edilmiştir. Floresans Eşik kolayca tümör alanına erişim sağlar iken superficial damar görünür ışık görüntünün beyaz arka plan dışı olarak karanlık yapıları ayırmak. Öte yandan Intravital iki-foton mikroskopi z-kesit ve subsellüler çözünürlük ile büyük görüş alanlarının ortogonal rekonstrüksiyon (Şekil 2B dendrite bakınız) sağlar. (Örneğin, nöronlarda Cyan Floresan Protein ifade Thy1-CFP farenin, Şekil 2D'de sözde yeşil renkli) kendi nöronal mikro-ortamda tümör ilerlemesini izlemek mümkündür ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik hayvanların kullanılması. Bununla birlikte, tümör hücre yoğunluğu artan difüzyon foton penetrasyon derinliği hem de yayılan foton algılama sınırı olduğunu belirtmek gerekir. Uzaysal çözünürlüğü sağlıklı beyin dokusu tümör dura-madde altında 200 mikron azalmaya başlar ancak bu açıkça Şekil 2B görülebilir. Ayrıca, ikinci harmonik nesil sinyal sağa sola doğanm gibi I ve III kollajen dura-mater (Şekil 2D ve oklar camgöbeği sözde-renk) bir imza sağlar türü olarak non-centrosymetric moleküllerin desen düzenledi. Bizim cerrahi protokolü ile, tümör gelişimi beynin fiziksel kısıtlamaları tarafından yönetilir beyin parankiminde dura-mater altında büyür belirtmek gerekir. Bir çapraz bağlanmış jel hemi-dekstran boncuk ile dura mater-sızdırmazlık epidural boşluk içinde glioma hücrelerinin kaçmasını engeller.

Intravital iki foton mikroskopi, ardından zaman farklı zaman noktaları arasında, tümör ilerlemesi hücre çözünürlükte karşılaştırılabilir. D16 ve D27 ameliyat sonrası (Şekil 3A) biz 11 günlük bir süre zarfında kararlı olduğunu oklarla vurgulanan biri olarak bazı kan damarları bulunan aynı alanının görüntülenmesi; Öte yandan, tümör ön açıkça aynı süre boyunca sağlıklı parankimi içine sızmış. Tümör ilerlemesi, onun ma değerlendirmekD27 gözlenen rgin sarı noktalı çizgiyle ve D16 alınan resmin üzerine kurulmuştur. Ön kenarın bir 520 um kayma GL261 glioma modelinde ¹⁵ arasında bilgi proliferatif profili ile tutarlı bir şekilde gözlenmedi. Tümör içindeki damar ağının kalıpları önemli vasküler yeniden modellenme, patolojik alanları (Şekil 3A) meydana belirten D16 ve D27 çok farklıydı. Tümör kenar, biz de istilacı tümör beklendiği gibi tümör çekirdekten ayırma glioma hücre vaka bulundu. Bizim görüntülerin mikroskopik çözünürlüğü bu hücrelerin kendi ilerlemesi (ok uçları ve Şekil 3B'de z-yeniden) için bir matris olarak kan damarlarının kullanabilir bu da çevreyi algılamak için sitoplazmik çıkıntılar yayan ancak bu sadece göstermiştir. İki-foton mikroskopi böylece gerçekten fizyolojik bağlamda hücresel etkileşimleri çalışma sağlar. Ilgi her bir hücre nüfusu transgenik hayvanların kullanılmasıbu, hastalığın ilerlemesine (Şekil 3B, sağ) önemli düzenleyici olarak tümör hücreleri ve çevreleri arasındaki fiziksel etkileşimlerin varlığını aramak için mümkün hale gelir, kendi floresan haberci ile tanımlanır.

Cerrahi Şekil 1.. Bakış. Kraniotomi sol parietal kemikte (A) üzerinde yapılır. Sol parietal kemik sınırları bir noktalı çizgi ile özetlenen ve kaldırılan parça sarı (B) doldurulur. Kranyotomi gerçekleştirilmiştir sonra, parietal korteks (C) maruz kaldığı, sferoit olması ile enjeksiyon için alan ana kan damarlarının (D oku) ve bir 26 gauge iğne dura mater-açmak için kullanılır (önlemek için özen seçilmektedir ) E ok. Küremsi olduğunuenjekte edilmiş ve dura mater-delik siyanoakrilat yapıştırıcı (F oku) ile kapatılmış, bir çapraz bağlanmış jel hemi-dekstran boncuk ile tıkanmıştır. Beyin ile temas tutarken bir cam lamel kemiğe yapıştırılır. Lamel ayrıca kronik gözlemler (GI) için kafatası pencerenin uzun süreli sıkı bağlantısını sağlamak için maruz kafatasına yapıştırılır. Bütün protokol kısaca J de şematize edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2.. Tümör büyümesi beyin parankimi ile sınırlıdır ve zaman. AC üzerinden izlenebilir. Tümör büyümesi (DsRed2 ifade GL261 hücre hattı) m tarafından görülmektedirAmeliyat günü (DO, A) ve 21 gün (B) de acroscopy ve 27 (C). C ok ucu adım 2.3.5. D sırasında kaldırılmış değildi diş çimento bir damla vurgulamaktadır. D20 ameliyat sonrası iki-foton mikroskopi bir GL261 tümörü taşıyan bir Thy1-OBP fare dura-mater altında 300 um 0 alınan bir 3 x 3 alanda elde Ortogonal rekonstrüksiyon. Tümör (kırmızı), ikinci harmonik üretimi (oklar, camgöbeği) ve nöronlar (yeşil) tarafından gözlemlenen dura-mater. Tümör, beyin parankiminde dura-mater altında büyür unutmayın. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Vascular şekillenmesi ve tümör hücrelerinin istilası Intravital iki-foton mikroskobu ile hücresel uzaysal çözünürlüğü ile zamanla izlenebilir. Bir. GL261 tümör (kırmızı) kan damarlarını vurgulamak için Cascade-mavi dekstran 70 kDa intravenöz enjeksiyonundan sonra D16 ve D27 sonrası ameliyat gözlendi. Noktalı çizgi: D27 tümör marjı; oklar:. D16 ve D27 B aynı alana lokalize etmek işareti olarak kullanılabilen kan damarlarının örnek. Işgali (ok uçları) için bir matris olarak kan damarlarını kullanarak; Bireysel tümör hücreleri (kırmızı), sağlıklı beyin parankimi (yeşil nöronlar) işgal. Resimler den 100 dura-madde aşağıda 150 um arasında değişen derinlikte alınmıştır. Noktalı çizgi:. Bölge orta alt panelde gösterilen dik rekonstrüksiyon gerçekleştirildi büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Discussion

Bu yaklaşım, optik görüntüleme yöntemlerinin kullanımı gün ve haftalarda bir ortotopikal implante glioma büyüme üzerinde izlemenizi sağlar. Aynı hayvan daha sonra patoloji sırasında hemen hemen herhangi bir beyin görüntüleme yöntemi tabi tutulabilir; henüz iki-foton mikroskopi özgü hazırlık yaşayan hayvanın beyninde subsellüler çözünürlük elde etmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bizim protokol glioma hücreleri hasarlı dura aracılığıyla merkezi sinir sistemine bırakabilirsiniz eğer olur gibi değil, ekstra-durally daha beyin parankimi içine tümör büyümesini zorlamak için avantaj sunar. Beyin çevre tarafından uygulanan fiziksel kısıtlamaların yokluğunda, tümör hücresi gerçekten onlar parankimi ¹⁶ sızmak gerek yok gibi hızlı çoğalırlar. Daha önce yayınlanmış yöntemler onlar yerine küremsiler daha hücrelerinin süspansiyon enjekte daha bütün daha sorunlu aşılama sonra dura mater mühür girişimi yoktu^9,13,14. Hücre süspansiyonları gerçekten derinlikten dura-mater için pipet çekilirken tek tek hücreler sistematik enjeksiyon yolu boyunca seribaşı olarak fokal uygulamak imkansız.

Mevcut protokol transgenik ve bağışıklığı bastırılmış hayvanlar da dahil olmak üzere çeşitli fare suşları üzerinde uygulanabilir. Çeşitli glioma hücre çizgileri, aşılanmış ve doğrudan sürece sabit bir şekilde, bir flüoresan raportör önce aşılama ifade etmek üzere transfekte edilen insan biyopsi türetilmiş hücreler de dahil olmak üzere, görselleştirilebilir. Cerrahi protokol tipik olarak 1 saat içinde yapılabilir ve hayvan kohort hızlı bir şekilde elde edilebilir. Bu yaklaşım, bu nedenle, tümör içine vasküler yeniden yapılandırılması, anjiyojenez ve tümör büyümesi üzerindeki farmakolojik tedavilerin etkilerinin yanı sıra, bağışıklık hücrelerinin işe incelemek için kullanılabilir. Gerektiğinde glioma hücre göçü ve glioma hücreleri ile mikro arasındaki dinamik etkileşimler çok Hou için gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilirrs.

Görüntüleme 500 mikron derinliklerinde üzerinden yapılabilir gibi tümör hacminin en ilk dura-mater altında 200 mikron implante kapsayacak mümkündür. Sağlamak için maksimum görüntüleme derinliği özel bakım dura-mater ve cam lamel arasındaki fiziksel teması oluşturmak için ameliyat sırasında alınmalıdır. Bu gerçekten aksi optik netlik taviz verecek skar dokusu oluşumunu azaltır. Cerrahi ortamın mutlak sterilite ayrıca geçici penceresini bulanıklaştırır cerrahi sonrası inflamasyonu sınırlamak için dikkat edilmelidir. Biz yine de en uygun görüntüleme koşulları elde etmek için cerrahi ve ilk gözlem seans arasında 15 gün beklemenizi tavsiye ederler. Bundan sonra, cam tümör sferoit olması ile enjeksiyon hariç bütün protokolü uygulandı sham ameliyat hayvanlar üzerinde yapılan ameliyat sonrası bir yıla kadar açık kalmaya bulunmuştur.

Sonuç olarak, burada tarif edilen protokol, mevcut Orth bir gelişmeyi temsil ederotopic glioma fare modeli kronik Intravital iki-foton mikroskopi adamıştır. , Bir tümör sferoit olması ile yüzeysel enjeksiyonu, enjeksiyon tıkanma bir çapraz bağlı dekstran jel hemi-boncuk ve dura mater-gerçekten normal olarak hastalığın ilerlemesini idare eden fiziksel kısıtlamaları tekrarıdır beyin ortamda tümör gelişimini zorlamak ve sızdırmazlık ile takip edin. Bu yöntem glioma patofizyolojisi üzerinde temel çalışmalar hizmet verecek ama aynı zamanda klinik öncesi denemeler sırasında farmakolojik sonuçlarının alaka geliştirmek değil.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar sıcak Dr KK Fenrich Dr MC teşekkür ederim. Amoureux, P. Weber ve yararlı tartışmalar için A. Jaouen; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, IBDML de hayvan imkan ve teknik destek için IBDML de PicSIL görüntüleme platformu personel personel. Bu çalışma GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), federasyona Institut National du Kanser (INCA-DGOS-INSERM6038) hibe tarafından desteklenen federasyon burs tarafından, FD la Recherche sur le Cerveau (FRC) dökmek CR de la Recherche Médicale ve Cancéropole PACA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Tıp Sayı 86 Glioblastoma multiforme intravital iki foton görüntüleme hayvan modeli kronik kafa penceresi beyin tümörleri nöro-onkoloji.