Protocol
जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं उपयुक्त पशु प्रयोग के द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं सुनिश्चित करने और शरीर की देखभाल.
1 अग्रिम स्टॉक बफ़र तैयार
- 2 एल शेयर सीए 2 + मुक्त Tyrode की (1 टेबल) तैयार करें. NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें.
- 2 एल शेयर 1.2 मिमी सीए 2 + Tyrode है (तालिका 2) तैयार करें. NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें.
प्रयोग के दिन 2, छिड़काव, स्थानांतरण, और पाचन बफ़र तैयार
- सीए 2 + मुक्त Tyrode है (तालिका 3) में 150 मिलीलीटर छिड़काव बफर तैयार है और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
- 35 मिलीलीटर की तैयारी सीए 2 + मुक्त हस्तांतरण "बफर" "बफर बी '(तालिका 5) युक्त (तालिका 4) और 25 मिलीलीटर Ca 2. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से प्रत्येक फिल्टर.
- 0 का समाधान तैयार.06, 0.24, 0.6, और मिश्रण बफर से 1.2 मिमी Ca 2 और बी 6 तालिका प्रति.
- माउस के शरीर के वजन (BW) पर आधारित 25 मिलीलीटर छिड़काव बफर (तालिका 7) में पाचन एंजाइमों भंग करके 25 मिलीलीटर पाचन बफर तैयार करें. उपयोग करने से पहले एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
3 प्रायोगिक सेटअप
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या 3ml के प्रवाह की दर अनुमति देने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, ट्यूबिंग, और एक हीट एक्सचेंजर का तार का उपयोग कर, एक निरंतर प्रवाह Langendorff तंत्र इकट्ठा / 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम perfusate के मिनट. एक साधारण योजनाबद्ध बेल द्वारा 2011 की समीक्षा में प्रदान की, एट अल 18 है.
- प्रवेशनी से कि बहिर्वाह 3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर है तो Langendorff तंत्र की घूम पानी स्नान तापमान (~ 47 डिग्री सेल्सियस) सेट करें.
- Ultrapure प्रकार मैं पानी की 100 मिलीलीटर के द्वारा पीछा किया 15 मिनट के लिए छिड़काव प्रणाली, के माध्यम से 70% इथेनॉल चलाएँ. Syste के माध्यम से चलाने के छिड़काव बफर5 मिनट के लिए एम हवाई बुलबुले को नष्ट करते हुए.
- एक वांछित विधि के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित.
- एक 23 जी Luer-ठूंठ एडाप्टर की टिप करने के लिए पीई 50 ट्यूबिंग के एक छोटे टुकड़े (लगभग 3 मिमी) संलग्न द्वारा प्रवेशनी बनाएँ. ट्यूबिंग की हीट टिप महाधमनी तैनात किया जाएगा, जिस पर एक होंठ बनाने के लिए.
4 cardiomyocyte अलगाव
- Intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से, 0.2 मिलीग्राम हेपरिन समाधान (1,000 आइयू / एमएल) के साथ माउस इंजेक्षन.
- 5 मिनट के बाद, isofluorane साथ माउस anesthetize. पूरी तरह से (मजबूत पैर चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं) anesthetized करते हैं, तो 70% EtOH के साथ सीने में स्प्रे. , छाती ओपन जल्दी से 4 डिग्री सेल्सियस छिड़काव बफर में महाधमनी, और जगह नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है, दिल आबकारी. समझ और दिल के तहत लिफ्ट करने के लिए घुमावदार संदंश का प्रयोग करें. यह ठीक कैंची के साथ दिल के पीछे संलग्नक ट्रिम करने के लिए जगह बनाता है.
- धीरे ठीक संदंश के दो जोड़े के साथ महाधमनी के किनारे लोभी और ध्यान से openi खींच कर दिल cannulateप्रवेशनी के होंठ पर महाधमनी की एनजी. इस कोरोनरी धमनियों के माध्यम से दिल के छिड़काव रोकना होगा, प्रवेशनी की नोक महाधमनी वाल्व अतीत और वेंट्रिकल में तो नहीं है.
- तुरंत प्रवेशनी के होंठ के ऊपर महाधमनी के आसपास 5-0 रेशम सीवन के एक पाश बांधने से प्रवेशनी को महाधमनी सुरक्षित.
- नोट: 4.4 से 4.2 के रूप में जल्दी संभव के रूप में सबसे अच्छी गुणवत्ता के पाचन के लिए पूरा किया जाना चाहिए कदम.
- नोट: दिल पहले ही छिड़काव बफर बहने के साथ Langendorff उपकरण से जुड़ी प्रवेशनी पर सीधे लटका दिया जा सकता है. हालांकि, एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे छिड़काव बफर के एक छोटे से सिरिंज से जुड़ी एक प्रवेशनी पर दिल फांसी सबसे सफल होना पाया गया है. यह छिड़काव बफर की एक छोटी राशि कोरोनरी धमनियों के समाशोधन के लिए देख रहा है और सुरक्षित रूप से प्रवेशनी से जुड़ा हुआ है दिल, यह सुनिश्चित करने के माध्यम से धक्का दिया करने की अनुमति देता है. प्रवेशनी तो छिड़काव बफर चलाने के साथ Langendorff पर लटका दिया जाता है.
- छिड़कना2-3 मिनट के लिए 3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह में सीए 2 + मुक्त छिड़काव बफर के साथ दिल.
- पाचन बफर एंजाइम और 7-10 मिनट के लिए छिड़कना में जाएँ, दिल रंग में नरम और हल्का हो जाएगा.
- नोट: पाचन समय एंजाइम गतिविधि और दिल के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
- दिल palpably झूलता हुआ है एक बार, बफर (सीए 2 + मुक्त हस्तांतरण बफर) के साथ एक बाँझ P60 डिश में प्रवेशनी और जगह से दिल को हटा दें.
- अटरिया और महान वाहिकाओं निकालें. अगर वांछित सही वेंट्रिकल निकालें. संदंश के साथ, छोटे टुकड़ों में निलय अलग. एक बाँझ 5 एमएल हस्तांतरण विंदुक के साथ पिपेट कई बार आगे कोशिकाओं को फैलाने के लिए.
- एक 250 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन फ़िल्टर.
- निलंबन के बारे में 10 मिनट के लिए गोली की अनुमति दें.
- 0.06 मिमी सीए 2 + समाधान में गोली स्थानांतरण. कोशिकाओं 10 मिनट के लिए गोली की अनुमति दें. सबसे मृत कोशिकाओं को जारी करेगी, जबकि स्वस्थ कोशिकाओं, गोली जाएगा. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और 0.24 मिमी सीए 2 + समाधान करने के लिए गोली हस्तांतरण.
- 10 मिनट ऊष्मायन, आकांक्षा दोहराएँ, और कोशिकाओं 1.2 मिमी समाधान में हैं जब तक शेष दो सीए 2 + समाधान के माध्यम से हस्तांतरण. इस बिंदु पर, कोशिकाओं के बहुमत वाली छड़ी के आकार myocytes होना चाहिए.
5 मापने सिकुड़ना और कैल्शियम यात्रियों
- नोट: सिकुड़ना और कैल्शियम यात्रियों दोनों एक साथ मापा जा सकता है.
- 1 माइक्रोग्राम / μl के एक एकाग्रता के लिए निर्जल DMSO में resuspending द्वारा Fura-2:00 समाधान तैयार है. Fura-2:00 समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर एक desiccator में संग्रहित किया जा सकता है.
- लोड 1 μl Fura-2 AM साथ निलंबित कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर. कोशिकाओं अंधेरा 10 तब मिनट सतह पर तैरनेवाला Aspirate में बैठने की अनुमति. कोशिकाओं washes के बीच 10 मिनट के लिए अंधेरे में गोली करने की इजाजत दी, सीए 2 + Tyrode समाधान के साथ दो बार धोएं.
- गर्म पीई की अनुमति देता है कि एक चरण डालने में एक गिलास coverslip जगहएक myocyte क्षेत्र उत्तेजक साथ पेसिंग rfusion / आकांक्षा और इलेक्ट्रोड. उलटा माइक्रोस्कोप पर प्लेस चरण डालने एक तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग अगर लेंस को तेल की एक बूंद को जोड़ने, प्रतिदीप्ति माप के लिए निर्धारित किया है.
- 1.2 मिमी सीए 2 + Tyrode समाधान के साथ गर्म गुरुत्वाकर्षण छिड़काव सेट अप मंच पर समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है तो. निर्वात को आकांक्षा संलग्न. इलेक्ट्रोड संलग्न.
- माइक्रोस्कोप प्रणाली पर बारी, और ratiometric प्रतिदीप्ति और सेल dimensioning डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें.
- क्षण भर के छिड़काव अवरुद्ध स्वस्थ कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए, चरण डालने के लिए Fura-02:00 भरी हुई कोशिकाओं की कुछ बूँदें जोड़ें.
- वांछित सेल का पता लगाने के लिए 40x उद्देश्य का प्रयोग करें. एक स्वस्थ कोशिका छड़ी के आकार और अनायास करार नहीं होना चाहिए. यह दिख और समान रूप से अनुबंध सेल 5-20 वी पर पुस्तक है चाहिए जब
- नोट: शारीरिक विश्लेषण एक उच्च गुणवत्ता पाचन की आवश्यकता है. यह स्वस्थ लग रही है लेकिन देहात नहीं है कि कोशिकाओं के लिए संभव है शारीरिक विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से CE. पाचन प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता, स्वस्थ myocytes पाने के शोधन की आवश्यकता हो सकती. साथ ही, उत्परिवर्ती या रोगग्रस्त दिल प्रोटोकॉल में संशोधन की आवश्यकता हो सकती.
- लेंस रोटेशन और परिवर्तन एपर्चर तो वांछित सेल स्क्रीन और पृष्ठभूमि पर क्षैतिज होने वाली है समायोजित दिखाई नहीं देता है.
- Myocyte के प्रत्येक के अंत तक बढ़त का पता लगाने सलाखों संरेखित और सीमा को समायोजित. वर्दी sarcomeres के साथ सेल के एक हिस्से पर sarcomere पता लगाने संरेखित करें. अब आप इस बार कर सकते हैं, sarcomere लंबाई की अधिक सटीक गणितीय मॉडल इतने लंबे समय यह sarcomeres की दो आबादी पर नहीं है, के रूप में किया जाएगा.
- पेस कोशिकाओं 2 हर्ट्ज और रिकॉर्डिंग से पहले 10-15 सेकंड के लिए 5-20 वी पर.
- रिकॉर्ड अनुरेखण. परिवेश प्रकाश सबसे अच्छा कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम किया जाना चाहिए.
6 विश्लेषण
- Ratiometric प्रतिदीप्ति और सेल dimensioning डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग निशान का विश्लेषण करें.
- निर्धारण और immunostaining, प्रत्यक्ष दवा प्रभाव, लघु अवधि के संस्कृति, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का आकलन: इस प्रोटोकॉल सहित अन्य प्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो अतिरिक्त कोशिकाओं प्रदान करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सिकुड़ना और क्षणिक ट्रेसिंग (चित्रा 2) एकत्र हो जाने के बाद, डेटा को आसानी से उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. पूरे ट्रेसिंग, या भागों क्या है (चित्रा 3) औसतन किया जा सकता. सिकुड़ना तरीकों की एक किस्म में विश्लेषण किया जा सकता है. सिस्टोलिक समारोह के लिए, एक छोटा शिखर आंशिक छोटा करने, या समय के साथ संकुचन की गति के साथ संकुचन की भयावहता, और संकुचन वेग का आकलन कर सकते हैं. डायस्टोलिक समारोह 50% छोटा करने और तनाव कम करने के वेग को समय के साथ इसी प्रकार का विश्लेषण किया जा सकता है. कैल्शियम यात्रियों के लिए इसी तरह के डेटा बेस लाइन और शिखर Fura-2 के अनुपात और समय पीक करने के लिए या आधारभूत (तालिका 8) सहित तुलना की जा सकती. ये विश्लेषण भी इसी तरह पूरे अंग में शिथिलता के साथ एक दिल में बदला जा सकता है जो किसी भी सिस्टोलिक और डायस्टोलिक सेलुलर सिकुड़ा समारोह पर WT और को दिल, साथ ही कैल्शियम प्रवाह से तुलनीय डेटा प्रदान करते हैं. साथ ही, एक ही अलगाव से कोशिकाओं कर सकते हैंimmunohistochemical धुंधला (चित्रा 4) सहित प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध के रूप में अन्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
| सीए 2 + मुक्त Tyrode | मिमी | परिवार कल्याण / एकाग्रता | राशि 2 एल समाधान के लिए |
| NaCl | 135 | 58.44 जी | 15.8 ग्राम |
| KCl | 4 | 74.56 जी | 0.596 ग्राम |
| 2 MgCl | 1 | एम 1 | 2 मिलीलीटर |
| HEPES | 10 | 238.31 जी | 4.77 छ |
| नाह 2 पीओ 4 | 0.33 | 141.96 जी | 0.094 ग्राम |
तालिका 1 कैल्शियम मुक्त Tyrode समाधान - Reageशेयर सीए 2 + मुक्त Tyrode के समाधान के 2 एल के लिए एनटीएस.
| 1.2 मिमी सीए 2 + Tyrode | मिमी | परिवार कल्याण / एकाग्रता | राशि 2 एल समाधान के लिए |
| NaCl | 137 | 58.44 जी | 16 ग्राम |
| KCl | 5.4 | 74.56 जी | 0.805 ग्राम |
| 2 MgCl | 0.5 | एम 1 | 1 मिलीलीटर |
| HEPES | 10 | 238.31 जी | 4.77 छ |
| 2 CaCl · 2H 2 हे | 1.2 | 147.01 जी | 0.353 ग्राम |
तालिका 2 1.2 मिमी कैल्शियम Tyrode समाधान - शेयर 1.2 मिमी सीए के 2 एल के लिए अभिकर्मकों 2 +समाधान.
| छिड़काव बफर | मिमी | परिवार कल्याण | 150 मिलीलीटर CA में राशि 2 + मुक्त Tyrode |
| ग्लूकोज | 10 | 180.16 जी | 0.27 छ |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | 10 | 101.11 जी | 0.152 ग्राम |
| Taurine | 5 | 125.16 जी | 0.094 ग्राम |
3 तालिका छिड़काव बफर - अभिकर्मकों प्रयोग के दिन पर छिड़काव बफर तैयार करने के लिए.
| बफर | 35 मिलीलीटर छिड़काव बफर |
| गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) | 0.175 ग्राम |
तालिका 4 बफर - अभिकर्मकों प्रयोग के दिन बफर तैयार करने के लिए.
| बफर बी | मिमी | परिवार कल्याण | 25 मिलीलीटर सीए 2 + Tyrode बफर |
| ग्लूकोज | 5 | 180.16 जी | 0.0225 जी |
सारणी 5 बफर बी - अभिकर्मकों प्रयोग के दिन बफर बी तैयार करने के लिए.
| बफर स्थानांतरण | बफर (एमएल) | बफर बी (एमएल) |
| 0.06 मिमी सीए 2 + | 9.5 | 0.5 |
| 0.24 मिमी सीए 2 + | 8 | 2 |
| 0.6 मिमी सीए 2 + | 5 | 5 |
| 1.2 मिमी सीए 2 + | 0 | 10 |
6 तालिका स्थानांतरण बफर - अभिकर्मकों प्रयोग के दिन पर स्थानांतरण बफर तैयार करने के लिए.
| एंजाइम पाचन बफर | 25 मिलीलीटर छिड़काव बफर |
| Collagenase बी | 0.4 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन |
| Collagenase डी | 0.3 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन |
| प्रोटीज XIV | 0.05 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन |
टेबल 7 एंजाइम पाचन बफर - अभिकर्मकों एंजाइम डि तैयार करने के लिएप्रयोग के दिन Gestion बफर.
| सिकुड़ना | |
| बेसलाइन | 1.73 माइक्रोन |
| पीक | 1.64 माइक्रोन |
| आंशिक छोटा | 4.70% |
| समय चोटी | 0.056 सेकंड |
| 50% आधारभूत समय | 0.043 सेकंड |
| कैल्शियम यात्रियों | |
| बेसलाइन | 1.18 |
| पीक | 1.32 |
| समय चोटी | 0.021 सेकंड |
| 50% आधारभूत समय | 0.083 सेकंड |
टेबल 8 सिकुड़ना और कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण करती है. एन = 5.
प्रयोगात्मक डिजाइन की 1 जनरल अवलोकन चित्रा. ए) हार्ट एंजाइम पाचन बफर. बी) के साथ कोरोनरी छिड़काव के माध्यम से पच जाता है कोशिकाओं आगे व्यक्ति, स्वस्थ myocytes में बिखरे हैं. कोशिकाओं में कैल्शियम सहिष्णु. डी बन इतनी सी) कोशिकाओं क्रमिक रूप से बढ़ रही है कैल्शियम की सांद्रता के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं) कक्ष निर्भर कैल्शियम से भरी हुई हैं डाई, Fura-2 बजे. ई) भरा हुआ कोशिकाओं विद्युत sarcomere लंबाई, सेल लंबाई, और प्रतिदीप्ति दर्ज हैं, जबकि पुस्तक रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 ए) नमूना contractility बनाम समय. समय बनाम Fura-2 अनुपात द्वारा प्रतिनिधित्व बी) नमूना कैल्शियम यात्रियों sarcomere लंबाई द्वारा प्रतिनिधित्व अनुरेखण. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 ए) विश्लेषण. बी के बाद टूटने सिकुड़ना अनुरेखण) विश्लेषण के बाद कैल्शियम यात्रियों का औसत. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Cardiomyocyte cytoskeleton (α-actinin) के 4 चित्र Immunofluorescent धुंधला.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
गुणवत्ता cardiomyocytes के अलगाव अभ्यास और अनुकूलन के कुछ स्तर की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल बहुत पाचन के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि प्रमुख चरणों में हैं. प्रदर्शन और प्रोटोकॉल के निवारण जब ये ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. केन्युलेशन और छिड़काव के लिए दिल को हटाने से समय आदर्श कम पांच मिनट से अधिक, कम से कम किया जाना चाहिए. ठंडा बफर में दिल माउस से हटाने और विदारक और cannulating के बाद ठंडा छिड़काव बफर में तुरंत दिल Rinsing भी एक गुणवत्ता पाचन के अवसरों में वृद्धि होगी. केन्युलेशन अपने आप में एक महत्वपूर्ण कदम है. इस कोरोनरी धमनियों का छिड़काव कर पाएगा रूप प्रवेशनी की नोक, लेकिन नहीं वेंट्रिकल में महाधमनी वाल्व के माध्यम से महाधमनी की पहली शाखाओं के नीचे रखा जाना चाहिए. कोरोनरी छिड़काव एक गुणवत्ता पाचन के लिए आवश्यक है. इस प्रयोगशाला में, प्रवेशनी छिड़काव बफर से भरा एक सिरिंज से जुड़ा हुआ है. धीरे एक smal इंजेक्शनबढ़ते और रक्त का स्पष्ट कोरोनरी धमनियों केन्युलेशन की पर्याप्तता की जांच कर सकता देखने के बाद छिड़काव बफर के एल राशि.
इस प्रोटोकॉल समस्या निवारण ध्यान से ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण कदम का आकलन शामिल है. दिल पाचन के दौरान palpably नरम नहीं बन जाता है, तो कुछ संभावित कारण हैं. सबसे पहले, केन्युलेशन दौरान, प्रवेशनी की नोक कोरोनरी धमनियों के माध्यम से छिड़काव रोकने, महाधमनी वाल्व परे उन्नत किया गया है हो सकता है. इस Langendorff तंत्र पर दिल फांसी लेकिन एक सिरिंज के साथ प्रवेशनी के माध्यम से छिड़काव बफर की एक छोटी राशि धक्का और रक्त के स्पष्ट करने के लिए कोरोनरी धमनियों के लिए ध्यान से देखने से पहले मूल्यांकन किया जा सकता. छिड़काव पर्याप्त है लेकिन यदि दिल, अच्छी तरह से पचा एंजाइमों के विभिन्न बहुत सारी खरीद पर विचार नहीं करता है. एंजाइमों वास्तव में मिश्रण होते हैं, क्योंकि बहुत से हूबहू कार्रवाई नहीं करते. हम एक एंजाइम की छोटी मात्रा में खरीद की सलाह देते हैं. बहुत सारे, purc अच्छी तरह से पचा पाया कि जो होभविष्य में उपयोग के लिए है कि बहुत से बड़ी मात्रा hase. चर्चा की दिल का विच्छेदन और केन्युलेशन अब से 5-10 मिनट ले, पच कोशिकाओं की गुणवत्ता खराब हो सकता है. पीटकर या इलाज जानवरों पर जाने से पहले विच्छेदन मास्टर करने के लिए जंगली प्रकार या इलाज जानवरों के साथ पूरा isolations पर विचार करें. पाचन के बाद, कोशिकाओं को धीरे धीरे कैल्शियम सहिष्णु बनाया जा किया जाना चाहिए. कोशिकाओं में कैल्शियम समाधान में से प्रत्येक में कम से कम 10 मिनट बिताना चाहिए. इन चरणों भागने कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता कम कर सकते हैं.
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, शारीरिक माप एक गुणवत्ता पाचन के साथ शुरू करने पर निर्भर करते हैं. मापने के लिए कोशिकाओं का चयन, अनायास एक टपका हुआ, क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली को इंगित करता है, जो करार नहीं कर रहे हैं कि कोशिकाओं का चयन करें. पुस्तक जब कोशिकाओं समान रूप से अनुबंध करना चाहिए. सिकुड़ा स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए माप रिकॉर्डिंग से पहले 10-15 सेकंड के लिए कोशिकाओं पेसिंग पर विचार करें. सेल प्रकट होता है समान रूप से करार, लेकिन होने के लिए सीओ की मापntraction परिमाण काफी समय के साथ, पहले से परिभाषित हित के क्षेत्र sarcomeres की केवल एक ही आबादी को शामिल किया गया है कि सुनिश्चित करने के लिए जाँच भिन्न होता है. कभी कभी दो कोशिकाओं को एक साथ समूह और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में एक sarcomere की दो अलग आबादियों को मापने की जा सकती है. एक उचित लागत पर लाभ को चुना लेकिन सिकुड़ना एक एकल कोशिका के भीतर चर रहा है, तो सेल मर हो सकता है और एक और सेल से चुना जाना चाहिए. कैल्शियम यात्रियों के लिए यह पानी कार्यात्मक उपलब्ध है कि Fura-2 बजे के राशि परिवर्तन के रूप में शोषित निर्जल DMSO में Fura-02:00 पतला करने के लिए महत्वपूर्ण है. लोड करने के बाद, सभी Fura-02:00 सेल के भीतर de-esterify को अनुमति देने के लिए पहली धोने और मापने यात्रियों के बीच कम से कम 20 मिनट की अनुमति है. किसी भी फ्लोरोसेंट डाई के साथ के रूप में, दौरान और लदान के बाद प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा. कुछ कोशिकाओं इस प्रकार कभी कभी कोई कैल्शियम यात्रियों एक मापा सेल में मनाया जाएगा डाई, तेज नहीं होगा. सिकुड़ना और कैल्शियम यात्रियों ट्रेसिंग "दिखाई दे सकते हैंपेसिंग दर बहुत (0.5-1 हर्ट्ज) कम हो जाता है जब क्लीनर ", माप करीब माउस हृदय गति, पसंद किया जाता है कम से कम 2 हर्ट्ज का इस प्रकार एक गति को दर से अधिक शारीरिक हैं.
अगर वांछित अलगाव में ही संशोधित किया जा सकता है. इस प्रयोगशाला में छिड़काव के दौरान एक निरंतर प्रवाह विधि (चूहों के लिए 3 मिलीग्राम / मिनट) का उपयोग करता है. कुछ नंबर एक गुरुत्वाकर्षण अधिक प्रभावी प्रवाह मिल गया है. पाचन और अधिक आसानी से दिल के रूप में प्रवाह की दर बढ़ जाती है पच जाता है के रूप में देखे जा करने के लिए गुरुत्वाकर्षण प्रवाह छिड़काव की अनुमति देता है.
उल्लेख किया है, इन तकनीकों सीमाओं उठा है. शारीरिक माप की गुणवत्ता पाचन की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, यह प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए एक से अधिक दिल से myocytes को मापने के लिए समझदारी है. हर दिल को मापने के लिए कई myocytes प्रदान करेगा, लेकिन दोहराने digestions परिणाम दिलों के बीच लगातार कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करेंगे. प्रयोगात्मक डिजाइन foll शामिल है अलगाव, इस प्रकार, एक टर्मिनल प्रक्रिया हैसमय के साथ एक जानवर का दिल समारोह कारण cardiomyocytes केवल एक बार काटा जा सकता है. अधिक चूहों इसलिए आवश्यक हैं व्यक्तिगत चूहों cardiomyocytes का विश्लेषण करने के लिए बलिदान कर रहे हैं, जबकि एक पलटन longitudinally पीछा किया जा सकता.
हमारा ध्यान एक पीटकर माउस में सिकुड़ना और cytoskeletal संरचना का अध्ययन किया गया है, हालांकि, अलग cardiomyocytes औषधीय के प्रभाव की जांच, दबाव या मात्रा अतिभारित चूहों से cardiomyocytes का अध्ययन, टी नलिकाओं के लिए लाइव सेल धुंधला सहित अन्य प्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उपचार, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, अभिकर्मक 9, और ट्रांसक्रिप्शनल 19 रूपरेखा. इस बहुमुखी तकनीक दिल की विफलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों पर अनगिनत लाभ प्रदान करता है. व्यक्ति की कोशिकाओं का अध्ययन कर फिजियोलॉजी पूरे अंग च के साथ कि सेलुलर परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान, ऐसे इकोकार्डियोग्राफी या विद्युतहृद्लेख के रूप में पूरे अंग अध्ययन के द्वारा की पेशकश नहीं कर रहा है कि सूचना देता हैailure. पूरे सेल आसानी से सना हुआ और imaged किया जा सकता है के रूप में इसके अलावा, अलग कक्षों, इमेजिंग उप सेलुलर संरचनाओं के लिए बेहतर होते हैं. सिकुड़ना, कैल्शियम यात्रियों, और immunofluorescence के विश्लेषण के लिए cardiomyocytes अलग प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विशाल विविधता से बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है कि एक अत्यंत बहुमुखी तकनीक है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान वीडियोग्राफी उपकरण विभाग के प्रयोग के लिए मार्क Wozniak.
वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय सेल इमेजिंग साझा संसाधन.
इस काम DMB को ईआरपी के लिए अहा अनुदान 12PRE10950005, DMB करने अहा अनुदान 11GRNT7690040, एनआईएच अनुदान R01 HL037675 द्वारा समर्थित है. DMB कार्डियोवास्कुलर रिसर्च में ग्लेडिस पी Stahlman कुर्सी है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
References
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias. Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).
- Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block. Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).
- Splawski, I., et al. CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism. Cell. 119, 19-31 (2004).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart. Circulation Research. 26, 679-687 (1970).
- Fang, F., et al. Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion. Pharmacology. 88, 149-158 (2011).
- Feng, W., et al. Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin. Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).
- Kaestner, L., et al. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J Vis Exp. (31), e1433 (2009).
- Vainio, L., et al. Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).
- Park, M., et al. Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload. Basic Research in Cardiology. , 108 (2013).
- Novaes, R. D., et al. Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats. International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).
- Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function. PLoS One. 7, e46655 (2012).
- Papanicolaou, K. N., et al. Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).
- Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes. Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).
- Touchberry, C. D., et al. FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).
- Helmes, M., et al. Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole. The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
