Protocol
Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono approvati con l'uso appropriato degli animali e la cura del corpo.
1 Preparare buffer di archivio in anticipo
- Preparare 2 L stock Ca 2 + libero di Tyrode (Tabella 1). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
- Preparare 2 L stock di 1.2 mM Ca 2 + Tyrode (Tabella 2). Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
2 Sul giorno dell'esperimento, preparare perfusione, trasferimento, e digestione Buffer
- Preparare il tampone di perfusione 150 ml di Ca 2 + libero di Tyrode (Tabella 3) e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron.
- Preparare 35 ml di Ca 2 + trasferimento gratuito "Buffer A" (Tabella 4) e 25 ml di Ca 2 + contenente "Buffer B" (Tabella 5). Filtrare ciascuno attraverso un filtro da 0,2 micron.
- Preparare soluzioni di 0.06, 0.24, 0.6, e 1.2 mM Ca 2 + mescolando tampone A e B per ogni tabella 6.
- Preparare tampone di digestione 25 ml sciogliendo enzimi digestivi in 25 ml di tampone di perfusione (Tabella 7) sulla base del peso corporeo (BW) del mouse. Filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron prima dell'uso.
3 setup sperimentale
- Assemblare un apparato Langendorff flusso costante, disponibile in commercio o utilizzando una pompa peristaltica, tubi, e una batteria di scambio termico per consentire un flusso di 3 ml / min di perfusato riscaldato a 37 ° C. Un semplice schema è previsto nel 2011 recensione di Bell, et al 18.
- Impostare circolante temperatura del bagno d'acqua (~ 47 ° C) dell'apparato Langendorff cosicché deflusso dalla cannula è a 37 ° C ad una velocità di flusso di 3 ml / min.
- Eseguire il 70% di etanolo attraverso il sistema di perfusione per 15 minuti, seguita da 100 ml di acqua ultrapura di tipo I. Buffer di perfusione Corri attraverso il system per 5 min, eliminando le bolle d'aria.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un metodo desiderato.
- Crea cannula allegando un breve pezzo (circa 3 mm) di PE-50 tubo alla punta di un adattatore Luer-stub 23 G. Punta di calore dei tubi per creare un labbro sul quale l'aorta sarà posizionato.
4. Cardiomyocyte Isolamento
- Iniettare mouse con 0,2 ml di soluzione di eparina (1.000 UI / ml), mediante iniezione intraperitoneale.
- Dopo 5 minuti, anestetizzare mouse con isofluorane. Quando è completamente anestetizzato (nessuna risposta al forte pizzico piedi), spruzzare il petto con il 70% EtOH. Aprite la cassa, asportare rapidamente il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'aorta, e posto a 4 ° C buffer di perfusione. Utilizzare pinze curve di afferrare e sollevare sotto il cuore. Questo crea lo spazio per tagliare gli allegati dietro il cuore con le forbici sottili.
- Cannulate cuore afferrando delicatamente il bordo della aorta con due coppie di pinze sottili e tirando con attenzione la opening dell'aorta sopra il labbro della cannula. Assicurarsi che la punta della cannula non è oltre la valvola aortica e nel ventricolo, perché impedirebbe perfusione del cuore attraverso le arterie coronarie.
- Fissare l'aorta alla cannula legando un cappio di sutura di seta 5-0 intorno all'aorta immediatamente sopra il labbro della cannula.
- Nota: I passaggi 4.2 con 4.4 dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile per la digestione migliore qualità.
- Nota: Il cuore può essere appeso direttamente sulla cannula già attaccato al Apparato Langendorff con fluente buffer di perfusione. Tuttavia, appeso il cuore su una cannula collegata ad una piccola siringa di buffer di perfusione al microscopio dissezione è stato trovato per essere di maggior successo. Questo permette una piccola quantità di buffer di perfusione deve essere spinto attraverso, guardando per la compensazione delle arterie coronarie e garantendo il cuore è attaccato saldamente alla cannula. La cannula viene poi appeso alla Langendorff con tampone di corsa perfusione.
- Perfuseil cuore con Ca 2 + buffer di perfusione libero a un flusso di 3 ml / min per 2-3 minuti.
- Passare al buffer di digestione enzimatica e profumato per 7-10 minuti, il cuore diventerà più morbida e di colore più chiaro.
- Nota: tempo di digestione può essere regolata in base alle attività enzimatica e la dimensione del cuore.
- Una volta che il cuore è palpabile flaccido, rimuovere il cuore dalla cannula e mettere in un piatto p60 sterile con tampone A (Ca 2 + buffer di trasferimento gratuito).
- Rimuovere atri e dei grossi vasi. Rimuovere ventricolo destro se lo si desidera. Con pinze, separare il ventricolo in piccoli pezzi. Pipettare più volte con una sterile 5 ml trasferimento pipetta per disperdere ulteriormente le cellule.
- Filtrare la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml attraverso un filtro a rete di nylon da 250 micron.
- Lasciare che la sospensione a pellet per circa 10 min.
- Trasferire il pellet nella soluzione 0,06 mM Ca 2 +. Consentono alle cellule di pellet per 10 min. Le cellule sane saranno pellet, mentre la maggior parte delle cellule morte galleggia. Aspirare il surnatante e trasferire il pellet al Ca 2 + 0,24 mM soluzione.
- Ripetere 10 min di incubazione, aspirazione, e trasferire attraverso i restanti due Ca 2 + soluzioni fino a quando le cellule sono nella soluzione 1.2 mM. A questo punto, la maggioranza delle cellule dovrebbe essere miociti forma di bastoncello.
5. misura contrattilità e calcio Transients
- Nota: Sia la contrattilità e transienti di calcio possono essere misurate simultaneamente.
- Preparare Fura-2 AM soluzione risospendendo in DMSO anidro ad una concentrazione di 1 mg / mL. Soluzione Fura-2 AM può essere immagazzinato in un essiccatore a -20 ° C.
- Carico 1 ml di cellule in sospensione con 1 ml Fura-2 del mattino. Consentono alle cellule di sedersi nel buio 10 min poi aspirare il surnatante. Lavare due volte con la soluzione di Ca 2 + Tyrode, permettendo alle cellule di pellet al buio per 10 minuti tra un lavaggio.
- Posizionare un coprioggetto di vetro in un inserto fase che permette pe riscaldatarfusion / aspirazione ed elettrodo di stimolazione con uno stimolatore campo miociti. Luogo inserto sul palco microscopio invertito istituito per la misurazione della fluorescenza, aggiungendo una goccia di olio di lente se si utilizza un obiettivo ad immersione in olio.
- Impostare perfusione gravità riscaldata con soluzione 1,2 mM Ca 2 + Tyrode così soluzione sul palco raggiunge i 37 ° C. Fissare l'aspirazione a vuoto. Attaccare gli elettrodi.
- Accendere il sistema microscopio, e aprire la fluorescenza e di acquisizione dati dimensionamento delle cellule software raziometrico.
- Aggiungere qualche goccia di cellule caricate Fura-02:00 all'inserto fase, bloccando perfusione momentaneamente per consentire le cellule sane a stabilirsi.
- Utilizzare obiettivo 40X per individuare cella desiderata. Una cellula sana dovrebbe essere cilindriche e non spontaneamente contraente. Dovrebbe visibilmente e contratto uniforme quando la cella viene stimolato a 5-20 V.
- Nota: Analisi fisiologica richiede una digestione di alta qualità. E 'possibile avere le cellule che sembrano in buona salute, ma non lo fanno pa Ce bene per l'analisi fisiologica. Protocollo di digestione può richiedere raffinatezza per ottenere alta qualità, miociti sani. Inoltre, cuori mutanti o malati possono richiedere modifiche al protocollo.
- Regolare la rotazione della lente e il cambiamento di apertura così cella desiderata è allineata orizzontalmente sullo schermo e lo sfondo non è visibile.
- Allineare barre di rilevamento bordo a ciascuna estremità di miociti e regolare la soglia. Allineate rilevamento sarcomere su una porzione di cella con sarcomeri uniformi. Più a lungo si può fare questo bar, il più accurato il modello matematico di lunghezza sarcomero sarà, fintanto che non è su due popolazioni di sarcomeri.
- Cellule Pace a 2 Hz e 5-20 V per 10-15 secondi prima della registrazione.
- Record tracciato. La luce ambiente deve essere ridotta al minimo per la migliore registrazione di calcio transitori.
6 Analisi
- Analizzare le tracce utilizzando la fluorescenza raziometrico e software di acquisizione dati dimensionamento delle cellule.
- Questo protocollo fornisce le cellule in eccesso che possono essere utilizzati per una varietà di altri esperimenti, tra cui: fissazione e immunostaining, valutando gli effetti diretti della droga, la cultura a breve termine, e la microscopia a forza atomica.
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Representative Results
Una volta che la contrattilità e tracciati transitori vengono raccolti (Figura 2), i dati possono essere facilmente analizzati con il software appropriato. L'intero tracciato, o parti di essi possono essere mediate (Figura 3). Contrattilità può essere analizzato in una varietà di modi. Per la funzione sistolica, si può valutare l'ampiezza della contrazione con accorciamento frazionale, o la velocità di contrazione con il tempo al picco accorciando, e la velocità di contrazione. Funzione diastolica può essere analizzato in modo simile con il tempo di 50% di accorciamento e la velocità di rilassamento. Per i transienti di calcio, analoghi dati possono essere confrontati tra cui linea di base e di picco Fura-2 rapporti e il tempo al picco o al basale (Tabella 8). Queste analisi forniscono dati comparabili da cuori WT e KO sulla funzione contrattile cellulare sistolica e diastolica, così come il flusso di calcio, ciascuno dei quali può essere alterate in un cuore con disfunzione d'organo tutto simile. Inoltre, le cellule dello stesso isolamento puòessere utilizzato per altri esperimenti elencati nel protocollo, tra cui la colorazione immunoistochimica (Figura 4).
| Ca 2 + Tyrode gratis | mM | FW / concentrazione | Importo per 2 L soluzione |
| NaCl | 135 | 58,44 g | 15.8 g |
| KCl | 4 | 74.56 g | 0,596 g |
| MgCl 2 | 1 | 1 M | 2 ml |
| HEPES | 10 | 238,31 g | 4.77 g |
| NaH 2 PO 4 | 0,33 | 141,96 g | 0,094 g |
Tabella 1 soluzione priva di calcio di Tyrode - Reagenti per 2 L di soluzione di riserva di Ca 2 + -free Tyrode.
| 1.2 mM Ca 2 + Tyrode | mM | FW / concentrazione | Importo per 2 L soluzione |
| NaCl | 137 | 58,44 g | 16 g |
| KCl | 5.4 | 74.56 g | 0,805 g |
| MgCl 2 | 0.5 | 1 M | 1 ml |
| HEPES | 10 | 238,31 g | 4.77 g |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.2 | 147.01 g | 0.353 g |
Tabella 2 1.2 mM di calcio soluzione di Tyrode - Reagenti per 2 L di magazzino 1.2 mM Ca 2 +soluzione.
| Perfusione Buffer | mM | FW | Importo in 150 ml di Ca 2 + Tyrode gratis |
| Glucosio | 10 | 180.16 g | 0,27 g |
| 2,3-butanedione-monoxime (BDM) | 10 | 101.11 g | 0,152 g |
| Taurina | 5 | 125.16 g | 0,094 g |
Tabella 3 perfusione Buffer - Reagenti per preparare buffer di perfusione nel giorno dell'esperimento.
| Buffer A | 35 ml di perfusione tampone |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 0.175 g |
Tabella 4 Buffer A - Reagenti per preparare Buffer A il giorno dell'esperimento.
| Buffer B | mM | FW | Buffer di 25 ml di Ca 2 + Tyrode |
| Glucosio | 5 | 180.16 g | 0,0225 g |
Tabella 5 Buffer B - Reagenti per preparare Buffer B il giorno dell'esperimento.
| Transfer Buffer | Tampone A (ml) | Buffer B (ml) |
| 0.06 mM Ca 2 + | 9.5 | 0.5 |
| 0.24 mM Ca 2 + | 8 | 2 |
| 0,6 mM Ca 2 + | 5 | 5 |
| 1.2 mM Ca 2 + | 0 | 10 |
Tabella 6 Transfer Buffer - Reagenti per preparare buffer di trasferimento il giorno dell'esperimento.
| Digestione enzimatica Buffer | 25 ml di perfusione tampone |
| Collagenase B | 0,4 mg / g di peso corporeo |
| Collagenase D | 0,3 mg / g di peso corporeo |
| Proteasi XIV | 0,05 mg / g di peso corporeo |
Tabella 7 Digestione enzimatica Buffer - Reagenti per la preparazione di enzimabuffer di gestion il giorno dell'esperimento.
| Contrattilità | |
| Baseline | 1.73 micron |
| Picco | 1.64 micron |
| Frazione di accorciamento | 4,70% |
| Tempo di picco | 0,056 sec |
| Tempo al 50% della linea di base | 0.043 sec |
| Transienti di calcio | |
| Baseline | 1.18 |
| Picco | 1.32 |
| Tempo di picco | 0.021 sec |
| Tempo al 50% della linea di base | 0,083 sec |
Analizza Tabella 8 contrattilità e calcio transitoria. N = 5.
Figura 1 Panoramica generale del disegno sperimentale. A) Cuore viene digerito tramite perfusione coronarica con tampone di digestione enzimatica. B) Le cellule sono ulteriormente dispersi in singole, miociti sani. C) Le cellule vengono trasferite in modo sequenziale attraverso crescenti concentrazioni di calcio così le cellule diventano calcio tolleranti. D) Le cellule vengono caricati con il calcio dipendente colorante, Fura-2 AM cellule. E) Loaded sono stimolato elettricamente, mentre la lunghezza sarcomero, la lunghezza delle cellule, e fluorescenza sono registrati. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 A) contract campionePu tracing rappresentato dalla lunghezza del sarcomero in funzione del tempo. transienti B) di calcio campione rappresentati da Fura-2 il rapporto in funzione del tempo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 a) il rintracciamento contrattilità media dopo l'analisi. B) Media dei transienti di calcio dopo l'analisi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 immunofluorescenza di cardiomiociti citoscheletro (α-actinina).
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Discussion
Isolamento di cardiomiociti di qualità richiede un certo livello di pratica e di ottimizzazione. Questo protocollo contiene passaggi chiave che possono influenzare notevolmente il risultato della digestione. Questi dovrebbero essere considerate attentamente quando si esegue la risoluzione dei problemi e il protocollo. Il tempo dalla rimozione del cuore di cannulazione e perfusione deve essere ridotto al minimo, idealmente meno di cinque minuti. Sciacquare immediatamente il cuore in tampone di perfusione ghiacciato dopo la rimozione dal mouse e dalla dissezione e cannulating cuore in tampone ghiacciato anche aumentare le possibilità di una digestione qualità. L'incannulazione in sé è un passaggio fondamentale. La punta della cannula deve essere posto sotto i primi rami dell'aorta ma non attraverso la valvola aortica nel ventricolo, in modo da evitare perfusione delle arterie coronarie. Perfusione coronarica è essenziale per una digestione qualità. In questo laboratorio, la cannula è collegata ad una siringa riempita con tampone di perfusione. Iniettare delicatamente un smalquantità l di tampone di perfusione dopo il montaggio e guardare le arterie coronarie chiare di sangue possono testare l'adeguatezza della cannulazione.
Risoluzione dei problemi di questo protocollo prevede valutare attentamente i passaggi critici di cui sopra. Se il cuore non diventa palpabile morbida durante la digestione, ci sono alcune possibili cause. Prima, durante incannulazione, la punta della cannula può essere avanzato oltre la valvola aortica, impedendo perfusione attraverso le arterie coronarie. Questo può essere valutato prima di appendere cuore sull'apparato Langendorff ma spingendo una piccola quantità di buffer di perfusione attraverso la cannula con una siringa e guardando con attenzione per le arterie coronarie a chiara di sangue. Se la perfusione è adeguata, ma il cuore non digerisce bene, considerare l'acquisto di lotti diversi enzimi. Poiché gli enzimi sono in realtà miscele, i lotti non agiscono in modo identico. Si consiglia di acquistare piccole quantità di ciascun enzima. Quando lotti si trovano che digeriscono bene, purcHase maggiori quantità di quel lotto per un uso futuro. Come discusso, se la dissezione e cannulazione del cuore richiedono più tempo di 5-10 minuti, la qualità delle cellule digerite può essere scarsa. Considerare isolamenti completamento di tipo selvatico o animali non trattati a padroneggiare la dissezione prima di passare a eliminazione diretta o animali trattati. Dopo la digestione, le cellule devono essere lentamente essere fatte calcio tollerante. Le cellule devono passare almeno 10 min in ciascuna delle soluzioni di calcio. Rushing questi passaggi può diminuire la resa e la vitalità delle cellule.
Sebbene riproducibile, le misurazioni fisiologiche dipendono iniziando con una digestione qualità. Quando si selezionano le celle per misurare, scegliere le cellule che non sono spontaneamente amministrazioni, che indica una membrana cellula danneggiata perde. Le cellule devono contrarre uniforme quando stimolato. Considerare la stimolazione delle cellule per 10-15 secondi prima di registrare le misure per garantire la coerenza contrattile. Se appare cella da contrarre uniforme, ma le misurazioni di contraction grandezza varia drasticamente nel corso del tempo, controllare per assicurarsi che la regione di interesse definita copre solo una popolazione di sarcomeri. Due cellule Occasionalmente gruppo insieme e la regione di interesse (ROI), possono essere misurano due diverse popolazioni di sarcomero come uno. Se un ROI adeguato è scelto, ma la contrattilità è variabile all'interno di una singola cellula, la cellula può morire e un'altra cella dovrebbe essere scelto. Per i transienti di calcio, è fondamentale per diluire Fura-02:00 in essiccato DMSO anidro come l'acqua modifica la quantità di Fura-02:00 che è funzionalmente disponibile. Dopo il caricamento, attendere almeno 20 minuti tra il primo lavaggio e transitori di misura per consentire a tutti Fura-2 AM alle de-esterificare all'interno della cellula. Come con qualsiasi colorante fluorescente, proteggere le cellule dalla luce durante e dopo il caricamento. Alcune cellule non assorbimento del colorante, così di tanto in tanto non transienti di calcio saranno osservati in una cella di misura. Anche se contrattilità e di calcio transitori tracciati possono apparire "pulito "quando la frequenza di stimolazione è notevolmente ridotto (0,5-1 Hz), le misure sono più fisiologico a un tasso vicino al battito cardiaco del mouse, quindi un ritmo di almeno 2 Hz è preferito.
L'isolamento stesso può essere modificato se lo si desidera. Questo laboratorio utilizza un metodo di flusso costante (3 ml / min per topi) durante la perfusione. Alcuni gruppi hanno trovato fluire più efficace di una forza di gravità. Perfusione flusso di gravità permette la digestione da visualizzare più facilmente come la portata aumenta come il cuore viene digerito.
Come detto, queste tecniche siano portatori di limitazioni. Poiché la qualità delle misurazioni fisiologiche dipende dalla qualità della digestione, è prudente misurare miociti da più di un cuore per ogni condizione sperimentale. Ogni cuore fornirà molti miociti per misurare, ma digestioni ripetere farà in modo che i risultati siano coerenti tra i cuori. L'isolamento è una procedura terminale, quindi, se il disegno sperimentale prevede follcausa la funzione del cuore di un animale nel corso del tempo, i cardiomiociti possono essere raccolti solo una volta. Altri topi sono tenuti in modo da una coorte possono essere seguiti longitudinalmente mentre i singoli topi sono sacrificati per analizzare cardiomiociti.
Il nostro obiettivo è stato lo studio della contrattilità e della struttura del citoscheletro in un topo knockout, tuttavia, cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per una varietà di altri esperimenti, tra cui la colorazione delle cellule vive per t-tubuli, studiando cardiomiociti di pressione o di volume sovraccarico topi, esaminando gli effetti della farmacologico trattamento, immunofluorescenza, trasfezione 9, e profilatura trascrizionale 19. Questa tecnica versatile offre innumerevoli vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per studiare l'insufficienza cardiaca. Studiare la fisiologia delle singole cellule fornisce informazioni che non è offerto da studi di organi interi, quali ecocardiografia o elettrocardiografia, permettono di approfondire i cambiamenti cellulari che accompagnano tutto l'organo failure. Inoltre, le cellule isolate sono superiori per le strutture sub-cellulari di imaging, come tutta la cella può essere facilmente colorato e ripreso. Isolamento cardiomiociti per l'analisi della contrattilità, transienti di calcio, ed immunofluorescenza è una tecnica estremamente versatile che offre preziose informazioni da una grande varietà di disegni sperimentali.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Marc Wozniak per l'utilizzo del Dipartimento di Cell e Developmental Biology attrezzature videografia.
Vanderbilt University cellulare Imaging risorsa condivisa.
Questo lavoro è supportato da AHA concessione 12PRE10950005 di ERP, AHA concessione 11GRNT7690040 a DMB, NIH concedere R01 HL037675 a DMB. DMB è il presidente Gladys P. Stahlman di Ricerca Cardiovascolare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
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