Protocol
Sicherzustellen, dass alle Verfahren, die Tiere werden durch die entsprechenden Tier Verwendung zugelassen und Pflege Körper.
1. Bereiten Sie Vektor Puffer in Advance
- Herstellung von 2 L stock Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4.
- Herstellung von 2 L stock 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-(Tabelle 2). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4.
2. Am Tag des Experiments Bereiten Perfusion, Transfer, und die Verdauung Puffer
- Bereiten Sie 150 ml Perfusionspuffer in Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 3) und durch ein 0,2 um Filter.
- Vorbereitung 35 ml Ca 2 + Übertragungs freien "Puffer A" (Tabelle 4) und 25 ml Ca 2 + mit "Puffer B" (Tabelle 5). Filtern jeweils durch ein 0,2 um-Filter.
- Werden die Lösungen von 00,06, 0,24, 0,6 und 1,2 mM Ca 2 + durch Mischen Puffer A und B pro Tabelle 6.
- Vorbereitung 25 ml Aufschlusspuffer durch Auflösen von Verdauungsenzymen in 25 ml Perfusionspuffer (Tabelle 7), bezogen auf das Körpergewicht (BW) der Maus. Filtriert durch ein 0,2 um Filter vor der Verwendung.
3. Versuchsaufbau
- Zubauen einen konstanten Fluss Langendorff-Apparatur, im Handel erhältlich oder unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe, Schlauch und eine Wärmetauscherrohrschlange, um eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml zu ermöglichen / min Spülflüssigkeit auf 37 ° C erhitzt. Eine einfache schematische in der Überprüfung im Jahr 2011 von den Bell, et al 18.
- Eingestellt zirkulierenden Wasserbad Temperatur (~ 47 ° C) der Langendorff-Apparatur, so daß Ausströmen von der Kanüle ist bei 37 ° C bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min.
- Führen Sie 70% Ethanol durch die Perfusion System für 15 Minuten, gefolgt von 100 ml Reinstwasser vom Typ I Wasser. Führen Perfusionspuffer durch die system für 5 min beim Beseitigen von Luftblasen.
- Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen mit einer gewünschten Methode.
- Kanüle erstellen, indem ein kleines Stück (etwa 3 mm), PE-50-Schlauch an der Spitze einer 23 G Luer-Steckadapter. Wärme Spitze Schlauch an eine Lippe, über die der Aorta positioniert wird erstellen.
4. Cardiomyocyte Isolation
- Injizieren Maus mit 0,2 ml Heparinlösung (1000 IU / ml), durch intraperitoneale Injektion.
- Nach 5 min zu betäuben Maus mit Isofluran. Wenn es vollständig betäubt (keine Reaktion auf den starken Fuß Prise), sprühen die Brust mit 70% EtOH. Öffnen Sie die Brust, schnell das Herz herauszuschneiden, man aufpassen, nicht die Aorta, und in 4 ° C Perfusionspuffer beschädigen. Verwenden einer gebogenen Pinzette zu greifen und zu heben unter dem Herzen. Das schafft Platz, um Anlagen hinter dem Herzen mit einer feinen Schere trimmen.
- Kanülieren das Herz durch leichtes Greifen der Rand der Aorta mit zwei Paaren von feinen Pinzette und sorgfältig Ziehen des OPENing der Aorta über die Lippe der Kanüle. Sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle nicht über die Aortenklappe und in die Herzkammer, da dadurch die Durchblutung des Herzens über den Koronararterien zu inhibieren.
- Sicherung der Aorta an der Kanüle durch das Binden einer Schleife von 5-0 Seidenfaden um die Aorta unmittelbar oberhalb der Lippe der Kanüle.
- Hinweis: Die Schritte 4.2 bis 4.4 sollten so schnell wie möglich für beste Qualität Verdauung abgeschlossen sein.
- Hinweis: Das Herz kann direkt auf die Kanüle bereits auf das Langendorff-Apparatur mit fließenden Perfusionspuffer befestigt aufgehängt werden. Jedoch hängt das Herz auf eine Kanüle zu einer kleinen Spritze von Perfusionspuffer unter einem Präpariermikroskop angebracht ist gefunden worden, am erfolgreichsten. Dies ermöglicht eine kleine Menge Perfusionspuffer durchgeschoben werden, gerade für die Reinigung der Koronararterien und Herz Gewährleistung fest mit Kanüle befestigt. Die Kanüle wird dann hing an der Langendorff-Perfusion mit Laufpuffer.
- PerfuseDas Herz mit Ca2 + freien Puffer Perfusion bei einem Fluß von 3 ml / min für 2-3 min.
- Wechseln, um die Verdauung Enzym und Puffer für 7-10 min durchströmen, werden Herz weicher und heller in der Farbe.
- Hinweis: Verdauungszeit kann auf der Grundlage der Enzymaktivität und Herzgröße eingestellt werden.
- Sobald Herz ist spürbar schlaff, zu entfernen Herz aus Kanüle und in eine sterile p60 Gericht mit Puffer A (Ca 2 + ablösefrei Puffer).
- Entfernen Vorhöfe und der großen Gefäße. Entfernen rechten Herzkammer, wenn gewünscht. Mit einer Pinzette, trennen die Kammer in kleine Stücke. Pipette mehrmals mit einer sterilen 5 ml Transferpipette weiter zerstreuen Zellen.
- Filtern der Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen durch ein 250 um Nylonmaschenfilter.
- Ermöglichen die Suspension für etwa 10 Minuten zu pelletieren.
- Übertragen Sie die Pellets in der 0,06 mM Ca 2 +-Lösung. Sodass die Zellen für 10 min pelletieren. Gesunde Zellen werden pelletieren, während die meisten toten Zellen zu schweben. Saugen Sie den Überstand, und übertragen Sie die Pellets in der 0,24 mM Ca 2 +-Lösung.
- Wiederholen Sie 10 min Inkubation, Aspiration, und übertragen Sie durch die verbleibenden zwei Ca 2 +-Lösungen, bis die Zellen sind in der 1,2 mM Lösung. An diesem Punkt sollte die Mehrzahl der stabförmigen Zellen Myozyten sind.
5. Mess Kontraktilität und Calcium Transienten
- Anmerkung: sind Kontraktilität und Calcium Transienten gleichzeitig gemessen werden können.
- Vorbereitung Fura-2 AM-Lösung durch Resuspendieren in wasserfreiem DMSO auf eine Konzentration von 1 ug / ul. Fura-2-AM-Lösung kann in einem Exsikkator bei -20 ° C gelagert werden.
- Last 1 ml suspendierten Zellen mit 1 ul Fura-2 AM. Sodass die Zellen in dunkel 10 min und dann gründlich absaugen Überstand sitzen. Zweimal waschen mit Ca 2 + Tyrode-Lösung, so dass Zellen, die in der Dunkelheit für 10 Minuten zwischen den Waschgängen zu pelletieren.
- Legen Sie ein Deckglas in einem Stadium, Einsatz, beheizten pe ermöglichtrfusion / Aspiration und Elektrode Stimulation mit einem myocyte Feld Stimulator. Ort Tischeinsatz auf inverse Mikroskop für Fluoreszenzmessung eingestellt, indem Sie einen Tropfen Öl auf die Linse, wenn unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv.
- Bis beheizten Schwerkraft Perfusion mit 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-Lösung so eingestellt, Lösung auf der Bühne erreicht 37 ° C. Bringen Anspruch, Vakuum. Bringen Elektroden.
- Schalten Sie das Mikroskop-System, und öffnen Sie die ratiometrischen Fluoreszenz und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware.
- Fügen Sie ein paar Tropfen des Fura-2 AM beladenen Zellen auf die Bühne Einsatz, Sperrung Durchblutung vorübergehend, damit die gesunden Zellen zu begleichen.
- Verwenden, um die gewünschten Ziel 40X Zelle zu lokalisieren. Eine gesunde Zelle sollte stabförmigen und nicht spontan kontra. Es sollte sichtbar und gleichmäßig zusammenziehen, wenn Zelle bei 5-20 V. Tempo
- Hinweis: Physiologische Analyse erfordert eine hohe Qualität der Verdauung. Es ist möglich, Zellen, die gesund aussehen, aber nicht pa haben gut CE-Kennzeichnung für physiologische Analyse. Verdauung Protokoll kann verlangen, Verfeinerung, um qualitativ hochwertige, gesunde Muskelzellen zu erhalten. Zusätzlich kann Mutante oder kranken Herzen Änderungen des Protokolls erfordern.
- Adjust Linsendrehung und Veränderung Blende so gewünschte Zelle wird horizontal auf dem Bildschirm und Hintergrund ausgekleidet ist nicht sichtbar.
- Richten Kantenerkennung Bars an jedem Ende der Myozyten und passen Schwelle. Richten Sarkomer Erkennung auf einem Teil der Zelle mit einheitlichen Sarkomere. Je länger Sie diese bar zu machen, desto genauer wird das mathematische Modell der Sarkomerlänge sein, solange es nicht auf zwei Populationen von Sarkomere.
- Tempo-Zellen mit 2 Hz und 5-20 V für 10-15 Sekunden vor der Aufnahme.
- Rekordverfolgung. Umgebungslicht sollte die besten Kalzium-Transienten-Aufzeichnung minimiert werden.
6. Analyse
- Analysieren Sie mit ratiometrischen Fluoreszenzspuren und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware.
- Dieses Protokoll stellt überschüssige Zellen, die für eine Vielzahl von anderen Experimenten verwendet werden können, einschließlich: Fixierung und Immunfärbung Beurteilung direkte Arzneimittelwirkungen, Kurzzeitkultur, und Atomkraftmikroskopie.
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Representative Results
Sobald die Kontraktilität und transiente Kurven werden gesammelt (Abbildung 2), werden die Daten einfach mit der geeigneten Software analysiert. Die gesamte Ablaufverfolgung oder Teile davon können gemittelt werden (Abbildung 3). Kontraktilität kann in einer Vielzahl von Weisen analysiert werden. Systolischen Funktion kann man die Stärke der Kontraktion mit fraktionelle Verkürzung oder Kontraktionsgeschwindigkeit mit der Zeit bis zum Peak Verkürzung und Kontraktionsgeschwindigkeit zu beurteilen. Diastolische Funktion können ähnlich mit der Zeit auf 50% Verkürzung und Entspannung Geschwindigkeit analysiert werden. Calcium-Transienten können ähnliche Daten einschließlich der Grundlinie und Peak Fura-2-Verhältnisse und Zeit bis zum Peak oder Basislinie (Tabelle 8) verglichen werden. Diese Analysen stellen vergleichbare Daten WT und KO Herzen auf den systolischen und diastolischen zelluläre Kontraktionsfunktion sowie Calciumflusses, von denen jeder konnte in einem Herzen mit ähnlichen ganze Organdysfunktion verändert werden. Zusätzlich Zellen aus derselben Isolation kannfür andere Experimente wie im Protokoll aufgelistet, einschließlich immunhistochemischer Färbung (Abbildung 4) verwendet werden.
| Ca 2 + frei Tyrode | mM | FW / Konzentration | Menge für 2 L-Lösung |
| NaCl | 135 | 58,44 g | 15,8 g |
| KCl | 4 | 74,56 g | 0,596 g |
| MgCl 2 | 1 | 1 M | 2 ml |
| HEPES | 10 | 238.31 g | 4,77 g |
| NaH 2 PO 4 | 0,33 | 141,96 g | 0,094 g |
Tabelle 1. Calcium-freien Tyrode-Lösung - ReageNächte für 2 l Lager Ca 2 + -freie Tyrode-Lösung.
| 1,2 mM Ca 2 + Tyrode | mM | FW / Konzentration | Menge für 2 L-Lösung |
| NaCl | 137 | 58,44 g | 16 g |
| KCl | 5.4 | 74,56 g | 0,805 g |
| MgCl 2 | 0,5 | 1 M | 1 ml |
| HEPES | 10 | 238.31 g | 4,77 g |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.2 | 147.01 g | 0,353 g |
Tabelle 2. 1,2 mM Calcium Tyrode-Lösung - Reagenzien für 2 l Lager 1,2 mM Ca 2 +Lösung.
| Perfusionspuffer | mM | FW | Menge in 150 ml Ca 2 + frei Tyrode |
| Glucose | 10 | 180.16 g | 0,27 g |
| 2,3-Butandion-Monoxim (BDM) | 10 | 101.11 g | 0,152 g |
| Taurin | 5 | 125.16 g | 0,094 g |
Tabelle 3. Perfusionspuffer - Reagenzien, um die Perfusion Puffer am Tag des Experiments vor.
| Puffer A | 35 ml Perfusionspuffer |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 0,175 g |
Tabelle 4 Puffer A - Reagenzien zum Puffer A am Tag des Experiments vor.
| Puffer B | mM | FW | 25 ml Ca 2 + Tyrode Puffer |
| Glucose | 5 | 180.16 g | 0,0225 g |
Tabelle 5. Puffer B - Reagenzien zu Puffer B am Tag des Experiments vorzubereiten.
| Transferpuffer | Puffer A (ml) | Puffer B (ml) |
| 0,06 mM Ca 2 + | 9.5 | 0,5 |
| 0,24 mM Ca 2 + | 8 | 2 |
| 0,6 mM Ca 2 + | 5 | 5 |
| 1,2 mM Ca 2 + | 0 | 10 |
Tabelle 6. Transferpuffer - Reagenzien zur Transferpuffer am Tag des Experiments vorzubereiten.
| Enzymdigestion Buffer | 25 ml Perfusionspuffer |
| Collagenase B | 0,4 mg / g Körpergewicht |
| Collagenase D | 0,3 mg / g Körpergewicht |
| Protease XIV | 0,05 mg / g Körpergewicht |
Tabelle 7. Enzymdigestion Buffer - Reagenzien, um die Enzym di vorbereitengestion Puffer am Tag des Experiments.
| Kontraktilität | |
| Grundlinie | 1,73 um |
| Spitze | 1,64 um |
| Verkürzungsfraktion | 4,70% |
| Zeit bis zum Peak | 0,056 sec |
| Zeit bis 50% des Ausgangs | 0,043 sec |
| Calciumtransienten | |
| Grundlinie | 1,18 |
| Spitze | 1,32 |
| Zeit bis zum Peak | 0,021 sec |
| Zeit bis 50% des Ausgangs | 0,083 sec |
Tabelle 8. Kontraktilität und Kalzium transienten Analysen. N = 5.
Abbildung 1. Gesamtübersicht der Versuchsplanung. A) Herz über koronare Perfusion mit Enzym-Verdauungspuffer. B) verdaut Zellen werden weiter in einzelne, gesunde Muskelzellen verteilt. C) Die Zellen werden nacheinander durch steigende Calciumkonzentrationen übertragen, so Zellen werden Calcium-tolerant. D) Die Zellen werden mit dem Calcium-abhängigen geladen Farbstoff Fura-2 AM. E) beladenen Zellen werden elektrisch stimuliert, während Sarkomerlänge, Zelllänge und Fluoreszenz aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. a) Proben Contractz Verfolgung durch Sarkomerlänge gegen die Zeit. B) Proben Calciumtransienten von Fura-2-Verhältnis gegen die Zeit dargestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. A) Durchschnittliche Kontraktilität Verfolgung nach der Analyse. B) Durchschnitt der Calcium Transienten nach der Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung von Kardiomyozyten Zytoskelett (α-Actinin).
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Discussion
Isolation von Kardiomyozyten Qualität erfordert ein gewisses Maß an Übung und Optimierung. Dieses Protokoll enthält die wichtigsten Schritte, die das Ergebnis der Verdauung wesentlich beeinflussen können. Diese sollten bei der Durchführung und Fehlersuche das Protokoll sorgfältig geprüft werden. Die Zeit von der Entfernung des Herzens Kanülierung und Perfusion sollte minimiert werden, idealerweise weniger als fünf Minuten. Spülen des Herz sofort in eiskaltem Perfusionspuffer nach dem Entfernen von der Maus und Präparieren und Kanülieren das Herz in eiskaltem Puffer erhöht auch die Chancen für eine Qualität die Verdauung. Die Kanülierung selbst ist ein kritischer Schritt. Die Spitze der Kanüle muß unterhalb der ersten Zweige der Aorta, aber nicht durch die Aortenklappe in die Herzkammer angeordnet werden, wie dies Perfusion der Koronararterien zu verhindern. Koronare Perfusion ist für eine Qualität die Verdauung. In diesem Labor wird die Kanüle in eine Spritze mit Perfusionspuffer gefüllt befestigt. Sanft Injektion eines Small Menge Perfusionspuffer nach der Montage und beobachten die Herzkranzgefäße frei von Blut Angemessenheit der Kanülierung testen.
Fehlerbehebung Dieses Protokoll beinhaltet die Beurteilung der oben genannten vorsichtig kritischen Schritte. Wenn das Herz nicht spürbar weichen während der Verdauung zu werden, gibt es ein paar mögliche Ursachen. Zuerst wird während Kanülierung der Spitze der Kanüle wurde über die Aortenklappe vorgeschoben haben, verhindert Perfusion über die Koronararterien. Dies kann vor dem Aufhängen das Herz auf der Langendorff-Apparatur, sondern drückt eine kleine Menge Perfusionspuffer durch die Kanüle mit einer Spritze und beobachtete sorgfältig für den Herzkranzgefäßen, um frei von Blut beurteilt werden. Wenn Perfusion ist ausreichend, aber das Herz nicht gut verdauen, erwägen den Kauf verschiedenen Chargen von Enzymen. Da die Enzyme tatsächlich Mischungen, keine Lose nicht identisch zu handeln. Wir empfehlen den Kauf kleiner Mengen von jedem Enzym. Wenn viele gefunden, dass gut zu verdauen, purchase größeren Mengen, dass das Los für die zukünftige Verwendung. Wie diskutiert, wenn Präparation und Kanülierung des Herzens länger als 5-10 Minuten, die Qualität der gespaltenen Zellen schlecht. Betrachten Abschluss Isolierungen mit Wildtyp-oder unbehandelten Tieren, die Dissektion, bevor sie zu KO oder behandelten Tieren zu meistern. Nach dem Verdau werden müssen Zellen langsam Calcium tolerant gemacht werden können. Zellen sollten mindestens 10 min in jeder der Calciumlösungen zu verbringen. Rushing diese Schritte können den Ertrag und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern.
Obwohl reproduzierbar, die physiologischen Messungen hängen von einer Qualität, die mit der Verdauung. Bei der Auswahl von Zellen zu messen, wählen Sie Zellen, die nicht spontan sind Vertrags, was eine undichte, beschädigte Zellmembran zeigt. Zellen sollten gleichmäßig zusammenziehen, wenn stimuliert. Betrachten Schrittmacherzellen für 10-15 sec vor der Aufnahme Messungen Kontraktions Konsistenz zu gewährleisten. Wenn die Zelle scheint einheitlich sein Vertrags, aber die Messungen von COntraction Größe variiert sehr stark über die Zeit, überprüfen Sie zunächst, um sicherzustellen, dass die Region von Interesse definiert nur auf eine Bevölkerung von Sarkomere. Gelegentlich zwei Zellen gruppieren und die Region of Interest (ROI) kann die Messung zwei verschiedene Populationen von Sarkomer als einer. Wenn eine entsprechende ROI gewählt wird aber Kontraktilität Variable innerhalb einer Einzelzelle kann die Zelle sterben und eine andere Zelle zu wählen. Für Calcium Transienten, ist es entscheidend, Fura-2 AM in ausgetrockneten wasserfreiem DMSO verdünnen Wasser ändert die Menge von Fura-2 AM, die funktional zur Verfügung steht. Nach dem Laden, lassen Sie mindestens 20 Minuten zwischen der ersten Wäsche und Messspitzen, damit alle Fura-2 AM, de-Veresterung innerhalb der Zelle. Wie bei jeder Fluoreszenzfarbstoff, schützen die Zellen vor Licht während und nach der Belastung. Einige Zellen werden nicht Auffassung den Farbstoff, so gelegentlich keine Calcium-Transienten in einem Messzelle beobachtet werden. Obwohl die Kontraktilität und Calcium Transienten Kurven erscheinen "Reinigungsmittel ", wenn die Schrittmacherrate stark reduziert (0,5-1 Hz) sind Messungen mit einer Geschwindigkeit näher an die Maus Herzrate, also eine Geschwindigkeit von mindestens 2 Hz bevorzugt mehr physiologisch.
Die Isolierung selbst kann auf Wunsch geändert werden. Dieses Labor verwendet eine konstante Strömungsmethode (3 ml / min für Mäuse) während der Perfusion. Einige Gruppen haben festgestellt, eine Schwerkraft effektiver. Gravitationsströmungs Perfusion ermöglicht die Verdauung leichter als die Strömungsrate zunimmt, wenn die Herz verdaut visualisiert werden.
Wie bereits erwähnt, haben diese Techniken tragen Einschränkungen. Da die Qualität der physiologischen Messungen ist abhängig von Qualität der Verdauung, ist es ratsam, Muskelzellen von mehr als einem Herz für jede experimentelle Bedingung zu messen. Jedes Herz wird bieten viele Muskelzellen zu messen, aber wiederholen Aufschlüsse wird sichergestellt, dass Ergebnisse konsistent zwischen Herzen sind. Isolation ist ein Terminal Verfahren, wenn also experimentelle Design beinhaltet Follaufgrund der Herzfunktion eines Tieres über der Zeit können die Kardiomyozyten nur einmal geerntet werden. Mehr Mäuse werden so benötigt eine Kohorte in Längsrichtung eingehalten werden, während die einzelnen Mäuse getötet zu Kardiomyozyten zu analysieren.
Unser Fokus studiert seit Kontraktilität und Zytoskelett-Struktur in einem Knockout-Maus, jedoch isoliert Kardiomyozyten können für eine Vielzahl von anderen Experimenten mit Live-Zellfärbung für T-Tubuli verwendet werden, das Studium Kardiomyozyten von Druck oder Volumenüberladung Mäuse, die die Auswirkungen von pharmakologischen Behandlung, Immunfluoreszenz, Transfektion 9 und Transkriptionsprofilierung 19. Dieses vielseitige Technik bietet zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Methoden verwendet werden, um Herzversagen zu untersuchen. Studium der Physiologie der einzelnen Zellen gibt Informationen, die nicht durch ganze Organ Studien wie Echokardiographie oder Elektrokardiographie angeboten wird, die einen Einblick in die zellulären Veränderungen, die ganze Organ f begleitenailure. Zusätzlich sind isolierte Zellen superior zum Abbilden subzelluläre Strukturen, wie die gesamte Zelle kann leicht gefärbt und abgebildet werden. Isolieren Kardiomyozyten für die Analyse der Kontraktilität, Calcium Transienten und Immunfluoreszenz ist eine äußerst vielseitige Technik, die wertvolle Informationen aus einer Vielzahl von experimentellen Designs bietet.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Marc Wozniak für die Nutzung der Abteilung für Zell-und Entwicklungsbiologie Videografie Ausrüstung.
Vanderbilt University Cell Imaging Shared Resource.
Diese Arbeit wird von AHA Zuschuss 12PRE10950005 zu ERP, AHA Zuschuss 11GRNT7690040 DMB, NIH R01 HL037675 DMB unterstützt. DMB ist die Gladys P. Stahlman Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
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