Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Published: September 7, 2014 doi: 10.3791/51109

Protocol

ضمان الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات باستخدام الحيوان المناسب والعناية بالجسم.

1. إعداد اسهم المخازن مقدما

  1. إعداد 2 لتر الأسهم الكالسيوم 2+ تايرود الملاحة في (الجدول 1). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
  2. إعداد 2 لتر الأسهم 1.2 ملي كا 2+ تايرود (الجدول 2). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.

2. في يوم من التجربة، إعداد الإرواء، والتحويل، والهضم المخازن المؤقتة

  1. إعداد 150 مل عازلة نضح في كا 2 + تايرود الملاحة في (الجدول 3) وتصفية من خلال 0.2 ميكرون التصفية.
  2. تحضير 35 مل CA انتقال حر 2+ "الواق أ" (جدول 4) و 25 مل تحتوي على الكالسيوم 2+ "العازلة B" (الجدول 5). تصفية كل من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
  3. تحضير محاليل 0.06، 0.24، 0.6، و 1.2 ملي كا 2+ عن طريق خلط العازلة A و B في الجدول 6.
  4. تحضير 25 مل عازلة الهضم عن طريق إذابة الأنزيمات الهضم في 25 مل العازلة نضح (الجدول 7) استنادا إلى وزن الجسم (BW) من الفأرة. تصفية من خلال 0.2 ميكرون فلتر قبل الاستخدام.

3. الإعداد التجريبي

  1. تجميع جهاز Langendorff تدفق مستمر، وهي متاحة تجاريا أو باستخدام تحوي مضخة، أنابيب ومبادل حراري لفائف السماح لمعدل تدفق 3ML / دقيقة من سائل الإرواء تسخينها إلى 37 درجة مئوية. ويرد التخطيطي بسيط في استعراض 2011 من قبل بيل، وآخرون 18.
  2. تعيين تعميم درجة حرارة حمام الماء (~ 47 ° C) من جهاز Langendorff بحيث تدفق من قنية هو عند 37 درجة مئوية في معدل تدفق 3 مل / دقيقة.
  3. تشغيل 70٪ من الإيثانول من خلال نظام نضح لمدة 15 دقيقة، تليها 100 مل من نوع I عالى النقاء المياه. تشغيل عازلة نضح من خلال التنفسيم لمدة 5 دقائق في حين القضاء على فقاعات الهواء.
  4. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع طريقة المرجوة.
  5. خلق قنية عن طريق ربط قطعة قصيرة (حوالي 3 مم) من أنابيب PE-50 إلى غيض من محول 23 G-يور كعب. غيض الحرارة من الأنابيب لخلق الشفة على الذي سيتم وضعه الشريان الأورطي.

4. Cardiomyocyte عزل

  1. حقن الفأر مع 0.2 مل حل الهيبارين (1،000 وحدة دولية / مل)، عن طريق الحقن داخل الصفاق.
  2. بعد 5 دقائق، تخدير الفأر مع isofluorane. عندما تخدير بالكامل (أي رد على قرصة القدم قوية)، رش الصدر مع 70٪ ETOH. فتح الصدر، وبسرعة استئصال القلب، والحرص على عدم تلف الشريان الأورطي، ومكان في 4 ° C عازلة الارواء. استخدام ملقط منحنية لفهم ورفع تحت القلب. هذا يخلق مساحة لخفض مرفقات راء القلب مع مقص غرامة.
  3. يقني؛ يدخل القنية القلب عن طريق استيعاب بلطف حافة الشريان الأورطي مع اثنين من أزواج من ملقط غرامة وسحب بعناية openiنانوغرام من الشريان الأبهر فوق الشفاه للقنية. ضمان غيض من قنية ليس الماضي الصمام الأبهري وإلى البطين، حيث سيؤدي ذلك إلى منع نضح من القلب عبر الشرايين التاجية.
  4. تأمين الشريان الأورطي إلى قنية عن طريق ربط حلقة من 5-0 الحرير خياطة حول الأبهر مباشرة فوق الشفة للقنية.
  5. ملاحظة: الخطوات 4.2 خلال 4.4 ينبغي أن يستكمل في أسرع وقت ممكن للحصول على أفضل جودة الهضم.
  6. ملاحظة: قلب يمكن تعليقه مباشرة على قنية تعلق بالفعل إلى جهاز Langendorff عازلة مع تدفق نضح. ومع ذلك، معلقة على قلب قنية تعلق على حقنة صغيرة من العازلة نضح تحت المجهر تشريح وقد وجد أن تكون الأكثر نجاحا. وهذا يسمح كمية صغيرة من العازلة نضح أن دفعت من خلال مشاهدة لتطهير للشرايين التاجية وضمان القلب بإحكام لقنية. ثم علق قنية على Langendorff مع تشغيل عازلة الارواء.
  7. يرويالقلب مع الكالسيوم 2+ عازلة نضح مجانا في تدفق 3 مل / دقيقة لمدة 2-3 دقيقة.
  8. التبديل إلى انزيم الهضم عازلة ويروي لمدة 7-10 دقيقة، والقلب أصبح أخف وأخف في اللون.
  9. ملاحظة: يمكن تعديل الوقت الهضم بناء على نشاط انزيم وحجم القلب.
  10. مرة واحدة القلب الرخو ملموس، وإزالة القلب من قنية ومكان في صحن P60 العقيمة مع الاحتياطي A (كا 2+ عازلة انتقال حر).
  11. إزالة الأذينين والأوعية الدموية الكبرى. إزالة البطين الأيمن اذا شئت. بالملقط، فصل البطين الى قطع صغيرة. ماصة عدة مرات مع معقمة 5 مل ماصة نقل لزيادة تفريق الخلايا.
  12. تصفية تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال 250 ميكرون تصفية شبكة من النايلون.
  13. تسمح تعليق لتكوير لحوالي 10 دقيقة.
  14. نقل بيليه إلى 0.06 ملي كا 2+ الحل. تسمح للخلايا لتكوير لمدة 10 دقيقة. الخلايا السليمة سوف بيليه، في حين أن معظم الخلايا الميتة سوف تطفو. نضح طاف، ونقل بيليه إلى ملي كا 2+ الحل 0.24.
  15. كرر 10 دقيقة الحضانة، والطموح، ونقل من خلال المتبقيين الكالسيوم 2+ حلول حتى الخلايا في حل 1.2 ملم. عند هذه النقطة، يجب أن تكون أغلبية الخلايا قضيب على شكل myocytes.

5. قياس انقباض والكالسيوم العابرون

  1. ملاحظة: يمكن قياس كل انقباض والعابرين الكالسيوم في وقت واحد.
  2. إعداد FURA، 02:00 حل عن طريق إعادة التعليق في DMSO اللامائية إلى تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر. ويمكن تخزين FURA، 02:00 الحل في مجفف في -20 درجة مئوية.
  3. تحميل 1 مل من الخلايا علقت مع 1 ميكرولتر FURA-2 PM. تسمح للخلايا على الجلوس في الظلام 10 دقيقة ثم نضح طاف. يغسل مرتين مع الحل الكالسيوم 2+ تايرود، والسماح الخلايا لبيليه في الظلام لمدة 10 دقيقة بين يغسل.
  4. وضع ساترة الزجاج في إدراج المرحلة التي تسمح بي ساخنةrfusion / الطموح والقطب يخطو مع مشجعا الحقل العضلية. مكان إدراج مرحلة مجهر مقلوب على اقامة لقياس مضان، إضافة قطرة من النفط إلى العدسة في حالة استخدام هدفا الغمر النفط.
  5. انشاء ساخنة نضح الجاذبية مع حل 1.2 ملي كا 2+ تايرود ذلك الحل على المرحلة تبلغ 37 درجة مئوية. إرفاق التطلع إلى فراغ. نعلق الأقطاب.
  6. بدوره على نظام المجهر، وفتح مضان والحصول على البيانات أبعاد الخلية البرمجيات ratiometric.
  7. إضافة بضع قطرات من FURA-2:00 خلايا تحميلها إلى إدراج مرحلة، ومنع نضح حظات للسماح الخلايا السليمة ليستقر.
  8. استخدام الهدف 40X لتحديد موقع الخلية المطلوبة. وينبغي أن يكون على شكل قضيب الخلايا السليمة وعدم التعاقد من تلقاء أنفسهم. يجب أن العقد واضح وبشكل موحد عند تيرة خلية في 5-20 V.
  9. ملاحظة: يتطلب التحليل الفسيولوجي الهضم ذات جودة عالية. فمن الممكن أن تكون الخلايا التي تبدو في صحة جيدة لكن لا سنويا CE جيدا لتحليل الفسيولوجية. قد تتطلب بروتوكول الهضم صقل للحصول على نوعية عالية، myocytes صحية. بالإضافة إلى ذلك، قد تتطلب القلوب المريضة متحولة أو تعديلات على البروتوكول.
  10. ضبط دوران العدسة وتغيير الفتحة بحيث يتم اصطف الخلية المطلوبة تصل أفقيا على الشاشة والخلفية غير مرئية.
  11. محاذاة الحانات الكشف عن الحافة إلى كل نهاية العضلية وضبط عتبة. محاذاة الكشف قسيم عضلي على جزء من خلية مع sarcomeres موحدة. يعد لكم يمكن أن تجعل هذا الشريط، فإن أكثر دقة النموذج الرياضي من طول قسيم عضلي يكون، طالما أنها ليست على اثنين من سكان sarcomeres.
  12. خلايا الوتيرة 2 هرتز و 5-20 V لمدة 10-15 ثانية قبل التسجيل.
  13. سجل التعقب. ينبغي التقليل من الإضاءة المحيطة للحصول على أفضل الكالسيوم تسجيل عابر.

تحليل 6.

  1. تحليل آثار استخدام مضان ratiometric وأبعاد الخلية البرمجيات الحصول على البيانات.
لقب "> 7. إجراء دراسات إضافية

  1. يوفر هذا البروتوكول الخلايا الزائدة والتي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التجارب الأخرى بما في ذلك: تثبيت والمناعية، وتقييم الآثار المباشرة للمخدرات والثقافة على المدى القصير، ومجهر القوة الذرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مرة واحدة يتم جمع انقباض واقتفاء أثر عابرة (الشكل 2)، ويتم تحليل البيانات بسهولة مع البرنامج المناسب. تتبع بأكمله، أو أجزاء منها يمكن متوسط ​​(الشكل 3). يمكن تحليل انقباض في مجموعة متنوعة من الطرق. من أجل وظيفة الانقباضي، يمكن للمرء أن تقييم حجم الانكماش مع تقصير كسور، أو سرعة الانكماش مع مرور الوقت إلى الذروة تقصير، وتقلص السرعة. وظيفة الانبساطي يمكن تحليلها على نحو مماثل مع الوقت إلى 50٪ تقصير والاسترخاء السرعة. لالعابرين الكالسيوم وبيانات مشابهة يمكن مقارنتها بما في ذلك خط الأساس وذروة FURA-2 النسب والوقت إلى الذروة أو الأساس (الجدول 8). هذه التحليلات توفر بيانات قابلة للمقارنة من WT وKO قلوب على الانقباضي والانبساطي وظيفة مقلص الخلوية، فضلا عن تدفق الكالسيوم، أي من التي يمكن أن تتغير في القلب مع ضعف جهاز مماثل كله. بالإضافة إلى ذلك، خلايا من نفس العزلة يمكناستخدامها لتجارب أخرى على النحو الوارد في البروتوكول، بما في ذلك تلطيخ المناعى (الشكل 4).

كاليفورنيا 2 + تايرود مجانا ملي FW / تركيز المبلغ 2 الحل L
كلوريد الصوديوم 135 58.44 ز 15.8 ز
بوكل 4 74.56 ز 0.596 غرام
MgCl 2 1 1 M 2 مل
HEPES 10 238.31 ز 4.77 ز
ناه 2 ص 4 0.33 141.96 ز 0.094 غرام

الجدول حل 1. خالية من الكالسيوم تايرود - الكواشفاليلة لمدة 2 لتر من محلول المخزون الكالسيوم 2+ خالية تايرود.

1.2 ملي كا 2+ تايرود ملي FW / تركيز المبلغ 2 الحل L
كلوريد الصوديوم 137 58.44 ز 16 ز
بوكل 5.4 74.56 ز 0.805 غرام
MgCl 2 0.5 1 M 1 مل
HEPES 10 238.31 ز 4.77 ز
CaCl 2 · 2H 2 O 1.2 147.01 ز 0.353 غرام

الجدول 2. 1.2 ملي الكالسيوم حل تايرود - الكواشف ل2 L من الأسهم 1.2 ملي كا 2+حل.

نضح العازلة ملي FW كمية الكالسيوم في 150 مل 2+ تايرود مجانا
الجلوكوز 10 180.16 ز 0.27 ز
2،3-Butanedione-monoxime (بي دي إم) 10 101.11 ز 0.152 غرام
التورين 5 125.16 ز 0.094 غرام

الجدول 3. الإرواء العازلة - الكواشف لإعداد عازلة نضح في يوم التجربة.

عازلة و 35 مل الإرواء العازلة
ألبومين المصل البقري (BSA) 0.175 ز

الجدول 4. العازلة A - الكواشف لإعداد الاحتياطي A في يوم التجربة.

عازلة B ملي FW العازلة 25 مل كا 2+ تايرود
الجلوكوز 5 180.16 ز 0.0225 غرام

الجدول 5. العازلة B - الكواشف لإعداد العازلة B في يوم التجربة.

نقل العازلة عازلة ألف (مل) B العازلة (مل)
0.06 ملي كا 2+ 9.5 0.5
0.24 ملي كا 2+ 8 2
0.6 ملي كا 2+ 5 5
1.2 ملي كا 2+ 0 10

الجدول 6. نقل العازلة - الكواشف لإعداد عازلة نقل في يوم من التجربة.

انزيم الهضم العازلة 25 مل الإرواء العازلة
كولاجيناز B 0.4 ملغ / غرام من وزن الجسم
كولاجيناز D 0.3 ملغ / غرام من وزن الجسم
البروتيني الرابع عشر 0.05 ملغ / غرام من وزن الجسم

الجدول 7. انزيم الهضم العازلة - الكواشف لإعداد انزيم دي عازلة الفضالة في يوم التجربة.

انقباض
خط الأساس 1.73 ميكرون
الذروة 1.64 ميكرون
تقصير كسور 4.70٪
وقت الذروة 0.056 ثانية
الوقت إلى 50٪ خط الأساس 0.043 ثانية
العابرين الكالسيوم
خط الأساس 1.18
الذروة 1.32
وقت الذروة 0.021 ثانية
الوقت إلى 50٪ خط الأساس 0.083 ثانية

يحلل الجدول 8. انقباض والكالسيوم عابرة. N = 5.

ن الصفحة = "دائما"> الشكل 1
الرقم 1. لمحة عامة عن التصميم التجريبي. أ) يتم هضمها عن طريق نضح القلب التاجي مع انزيم الهضم العازلة. B) وفرقت الخلايا الى مزيد من الفردية، myocytes صحية. يتم نقل C) خلايا بالتتابع من خلال زيادة تركيزات الكالسيوم بحيث تصبح الخلايا الكالسيوم تسامحا. D) يتم تحميل خلايا مع الكالسيوم يعتمد صباغة، وتيرة FURA-2 PM. E) محملة الخلايا كهربائيا بينما طول قسيم عضلي، طول الخلية، ومضان وتسجل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2.) عينة مقاولونtility التتبع ممثلة طول قسيم عضلي مقابل الوقت. العابرين B) عينة ممثلة الكالسيوم FURA-2 نسبة مقابل الوقت. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. A) متوسط ​​تتبع انقباض بعد التحليل. B) متوسط ​​العابرين الكالسيوم بعد التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. مناعي تلطيخ الهيكل الخلوي cardiomyocyte (α-actinin).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عزل العضلية الجودة يتطلب مستوى معين من الممارسة والتحسين. هذا البروتوكول يتضمن الخطوات الرئيسية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج عملية الهضم. وينبغي النظر بعناية عند أداء هذه، ومخرج من البروتوكول. ينبغي التقليل من الوقت من ازالة القلب إلى القسطرة ونضح، من الناحية المثالية أقل من خمس دقائق. سوف الشطف قلب فورا في المخزن نضح الجليد البارد بعد إزالة من الماوس وتشريح وcannulating قلب في المخزن الجليد الباردة أيضا زيادة فرص الهضم الجودة. والقسطرة في حد ذاته هو خطوة حاسمة. يجب وضع غيض من قنية تحت فروع الأولى من الشريان الأورطي ولكن ليس من خلال صمام الأبهر إلى البطين، حيث سيؤدي ذلك إلى منع التروية في الشرايين التاجية. التروية التاجية ضروري لعملية الهضم الجودة. في هذا المختبر، يتم إرفاق قنية إلى حقنة مليئة عازلة الارواء. بلطف حقن األصغرل كمية من العازلة نضح بعد تصاعد ومشاهدة يمكن الشرايين التاجية واضحة من الدم اختبار كفاية القسطرة.

استكشاف هذا البروتوكول يتضمن تقييم بعناية الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه. إذا لا تصبح لينة القلب بشكل ملموس أثناء الهضم، وهناك عدد قليل من الأسباب المحتملة. أولا، خلال القسطرة، قد طرحت غيض من قنية خارج الصمام الأبهري، ومنع نضح عبر الشرايين التاجية. هذا يمكن تقييمها قبل شنقا القلب على الجهاز Langendorff لكن دفع كمية صغيرة من العازلة نضح من خلال قنية مع حقنة ومشاهدة بعناية لالشرايين التاجية لواضح من الدم. إذا نضح كافية ولكن القلب لا تهضم جيدا، والنظر في شراء الكثير من الإنزيمات المختلفة. لأن الأنزيمات هي في الواقع خليط، والكثير لا تعمل مماثل. نوصي شراء كميات صغيرة من كل الانزيم. عندما يتم العثور على الكثير أن هضم جيدا، purcHASE كميات أكبر من أن الكثير لاستخدامها في المستقبل. كما تمت مناقشته، إذا تشريح والقسطرة للقلب يستغرق وقتا أطول من 5-10 دقيقة، ونوعية الخلايا هضمها يمكن أن يكون الفقراء. تنظر في استكمال العزلة مع نوع البرية أو الحيوانات غير المعالجة في السيطرة على تشريح قبل الانتقال إلى بالضربة القاضية أو الحيوانات المعالجة. بعد الهضم، ويجب أن تكون الخلايا ببطء الكالسيوم تسامحا. خلايا ينبغي أن تنفق على الأقل 10 دقيقة في كل من حلول الكالسيوم. يمكن التسرع هذه الخطوات تقليل المحصول وسلامة الخلايا.

على الرغم من استنساخه، والقياسات الفسيولوجية تعتمد على الهضم بدءا من الجودة. عند اختيار الخلايا للقياس، واختيار الخلايا التي لم يتم التعاقد بشكل عفوي، مما يدل لذلك، غشاء الخلية راشح التالفة. خلايا ينبغي أن ينكمش بانتظام عندما الخطى. النظر يخطو الخلايا لمدة 10-15 ثانية قبل ان يسجل قياسات لضمان الاتساق مقلص. إذا ظهرت الخلية المراد التعاقد بشكل موحد، ولكن القياسات المشتركحجم ntraction يختلف بشكل كبير مع مرور الوقت، تحقق أولا للتأكد من أن المنطقة التي تهم محددة تغطي السكان واحد فقط من sarcomeres. أحيانا مجموعة خليتين معا والمنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويمكن قياس اثنين من مجموعات مختلفة من قسيم عضلي واحد. إذا ما تم اختيار عائد استثمار مناسب ولكن انقباض هو متغير داخل خلية واحدة، قد يكون خلية الموت وينبغي اختيار خلية أخرى. لالعابرين الكالسيوم، فمن الأهمية بمكان أن نعمل على تخفيف FURA-2 صباحا في DMSO اللامائية المجفف ويغير الماء كمية FURA، 02:00 ما هو متاح وظيفيا. بعد التحميل والسماح لا يقل عن 20 دقيقة بين غسل الأولى وقياس العابرين للسماح لجميع FURA-2 صباحا إلى إزالة يؤستر ​​داخل الخلية. كما هو الحال مع أي صبغة الفلورسنت، وحماية الخلايا من الضوء أثناء وبعد العملية. وبعض الخلايا لا امتصاص الصبغة، وبالتالي في بعض الأحيان سوف يلاحظ أي العابرين الكالسيوم في خلية محسوبة. على الرغم من انقباض واقتفاء أثر العابرين الكالسيوم قد تظهر "نظافة "عندما يتم تقليل معدل يخطو بشكل كبير (0.5-1 هرتز)، والقياسات الفسيولوجية هي أكثر بمعدل أقرب إلى معدل ضربات القلب الماوس، وبالتالي وتيرة من 2 هرتز على الأقل ويفضل.

عزل نفسها يمكن تعديلها إذا لزم الأمر. يستخدم هذا المختبر طريقة تدفق مستمر (3 مل / دقيقة بالنسبة للفئران) أثناء الارواء. وقد وجدت بعض الجماعات خطورة تدفق أكثر فعالية. نضح تدفق الجاذبية يسمح لهضم أن تصور بسهولة أكبر كما يزيد معدل تدفق كقلب وهضمها.

كما ذكرنا، هذه التقنيات لا تحمل القيود. ونوعية القياسات الفسيولوجية تعتمد على نوعية الهضم، فإنه من الحكمة لقياس myocytes من القلب أكثر من واحد لكل حالة تجريبية. سوف توفر كل قلب العديد من myocytes لقياس، ولكن تكرار الهضم ضمان أن النتائج متسقة بين القلوب. العزل هو إجراء محطة، وبالتالي، إذا يتضمن التصميم التجريبي الفلبسبب وظيفة قلب حيوان مع مرور الوقت، والعضلية لا يمكن إلا أن تحصد مرة واحدة. ويطلب المزيد من الفئران حتى يمكن اتباعها لفيف طوليا بينما ضحى الفئران الفردية لتحليل العضلية.

تركيزنا تم دراسة انقباض وهيكل هيكل الخلية في الماوس خروج المغلوب، ومع ذلك، العضلية معزولة يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من التجارب الأخرى بما في ذلك تلطيخ الخلايا الحية لتي الأنابيب، ودراسة العضلية من الضغط أو حجم زائد الفئران، ودراسة آثار الدوائية العلاج المناعي، ترنسفكأيشن والنسخي التنميط 19. توفر هذه التقنية مزايا متعددة لا حصر لها على الطرق الأخرى المستخدمة لدراسة قصور القلب. دراسة فسيولوجيا الخلايا الفردية يعطي المعلومات التي لا توفرها دراسات الجهاز كله مثل تخطيط صدى القلب أو تخطيط القلب الكهربائي، وتوفير نظرة ثاقبة على التغيرات الخلوية التي تصاحب كلها و الجهازailure. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا المعزولة متفوقة للهياكل الفرعية الخلوية التصوير، حيث أن خلية كاملة يمكن ملطخة بسهولة وتصوير. عزل العضلية لتحليل انقباض، العابرين الكالسيوم، والمناعي هو أسلوب تنوعا للغاية أن يقدم معلومات قيمة من مجموعة كبيرة من التصاميم التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

مارك زنياك لاستخدام قسم الخليوي والتنموية المعدات الأحياء بالفيديو.

جامعة فاندربيلت التصوير خلية الموارد المشتركة.

وأيد هذا العمل من منحة AHA 12PRE10950005 لتخطيط موارد المؤسسات، منحة AHA 11GRNT7690040 إلى DMB، NIH منحة R01 HL037675 إلى DMB. DMB هو رئيس غلاديس P. Stahlman في أبحاث القلب والأوعية الدموية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl RPI S23020
KCl Sigma P-3911
MgCl2 Sigma M-8266
HEPES EM Science S320
NaH2PO4 Sigma S5011
CaCl2·2H2O Fisher C79
D-(+)-Glucose Sigma G7528
2,3-Butanedione-monoxime (BDM) Sigma B-0753
Taurine Sigma T-0625
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A-7030
Collagenase B Roche Diagnostics 1-088-823
Collagenase D Roche Diagnostics 1-088-882
Protease XIV Sigma P-5147
Heparin APP Pharmaceuticals, LLC 401586D
Isofluorane Butler Schein 11695-6776-2
Fura-2 AM Teflabs 103
DMSO – anhydrous Sigma 276855
IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system IonOptix
250 μm nylon mesh filter Sefar America Lab Pak 03-250/50
23 G Luer-stub adaptor Becton Dickinson 1482619E
PE-50 tubing Becton Dickinson 427410

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
  2. Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias. Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).
  3. Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block. Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).
  4. Splawski, I., et al. CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism. Cell. 119, 19-31 (2004).
  5. Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart. Circulation Research. 26, 679-687 (1970).
  6. Fang, F., et al. Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion. Pharmacology. 88, 149-158 (2011).
  7. Feng, W., et al. Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin. Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).
  8. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).
  9. Kaestner, L., et al. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J Vis Exp. (31), e1433 (2009).
  10. Vainio, L., et al. Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).
  11. Park, M., et al. Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload. Basic Research in Cardiology. , 108 (2013).
  12. Novaes, R. D., et al. Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats. International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).
  13. Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function. PLoS One. 7, e46655 (2012).
  14. Papanicolaou, K. N., et al. Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).
  15. Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes. Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).
  16. Touchberry, C. D., et al. FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).
  17. Helmes, M., et al. Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole. The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).
  18. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).
  19. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 91، cardiomyocyte العزلة، Langendorff، انقباض، العابرين الكالسيوم
العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roth, G. M., Bader, D. M.,More

Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (91), e51109, doi:10.3791/51109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter