בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Protocol

להבטיח שכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מאושרים על ידי השימוש בבעלי החיים המתאימים וטיפול גוף.

.1 הכינו חוצצי המלאי מראש

1. הכן מניית 2 L Ca ^{2 +} של Tyrode החופשי (טבלת 1). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.
2. הכן מניית 2 L 1.2 של מ"מ Ca ^{2 +} Tyrode (טבלת 2). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH.

.2 ביום של הניסוי, הכינו זלוף, העברה, ועיכול חוצצים

1. הכן חיץ זלוף 150 מ"ל בCa ^{2 +} של Tyrode החופשי (לוח 3) ולסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
2. הכן 35 מ"ל Ca ^{2 +} העברה חופשית "חוצץ" (לוח 4) ו25 מ"ל Ca ^{2 +} המכיל "הצפת B" (לוח 5). לסנן כל דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
3. הכן את הפתרונות של 0.06, 0.24, 0.6, ו1.2 מ"מ Ca ^{2 +} על ידי הצפת ערבוב וB ללוח 6.
4. הכן חיץ עיכול 25 מ"ל על ידי המסת אנזימי עיכול ב25 מ"ל חיץ זלוף (לוח 7) המבוסס על משקל הגוף (BW) של העכבר. לסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.

.3 הגדרת ניסוי

1. להרכיב מנגנון זרימת Langendorff קבוע, זמין באופן מסחרי או באמצעות משאבה, צינורות, וסליל מחליף חום peristaltic כדי לאפשר קצב זרימה של 3ml / דקה של perfusate המחומם ל37 מעלות צלזיוס. סכמטי פשוט מסופק בסקירת 2011 על ידי בל, et al ^18.
2. הגדר טמפרטורת אמבט מים במחזור (~ 47 ° C) של מנגנון Langendorff כך יצוא שמהצינורית הוא על 37 מעלות צלזיוס בקצב זרימה של 3 מ"ל / דקה.
3. הפעל 70% אתנול באמצעות מערכת זלוף במשך 15 דקות, ואחריו מסוג ultrapure אני מים 100 מ"ל. חיץ זלוף להפעיל באמצעות התוכנה למ 'במשך 5 דקות תוך ביטול בועות אוויר.
4. לעקר את כל הכלים כירורגיים עם שיטה רצויה.
5. צור צינורית על ידי הצמדת קטע קצר (מ"מ על 3) PE-50 צינורות לקצה מתאם Luer-בדל 23 G. טיפ חום של צינורות כדי ליצור שפה אשר לאב העורקים יהיו ממוצבת.

בידוד .4 Cardiomyocyte

1. הזרק עכבר עם 0.2 מ"ל פתרון הפרין (1,000 IU / ml), באמצעות הזרקת intraperitoneal.
2. אחרי 5 דקות, להרדים עכבר עם isofluorane. כשהרדים (אין תגובה לקמצוץ רגל חזקה) באופן מלא, לרסס חזה עם EtOH 70%. פתח את החזה, לכרות במהירות הלב, נזהר שלא לפגוע באב העורקים, ומקום ב4 ° C חיץ זלוף. השתמש במלקחיים מעוקלים לתפוס ולהרים תחת הלב. זה יוצר חלל לקצץ קבצים מצורפים מאחורי הלב עם מספריים עדינים.
3. Cannulate הלב בעדינות על ידי אחיזה בקצה של אב העורקים עם שני זוגות מלקחיים בסדר ומושך openi בזהירותng של אב העורקים מעבר לשפה של הצינורית. ודא את הקצה של הצינורית הוא לא עבר שסתום אב העורקים ולתוך החדר, כמו זה יהיה לעכב זלוף של הלב באמצעות העורקים הכליליים.
4. אבטח את אב העורקים לצינורית על ידי קשירת לולאה של 5-0 תפר משי סביב אב העורקים מייד מעל השפה של הצינורית.
5. הערה: שלבי 4.2 דרך 4.4 אמורים להסתיים במהירות האפשרית לעיכול באיכות הטובה ביותר.
6. הערה: הלב יכול להיות תלוי ישירות על גבי הצינורית כבר מחוברת למכשירי Langendorff עם זורם חיץ זלוף. עם זאת, תלוי הלב על צינורית שמחוברת למזרק קטן של חיץ זלוף תחת מיקרוסקופ לנתיחה כבר מצא להיות מוצלח ביותר. זה מאפשר כמות קטנה של חיץ זלוף כדי שתועבר, צופה לסליקת עורקים הכליליים והבטחת לב מחוברת היטב לצינורית. הצינורית לאחר מכן נתלתה על Langendorff עם הפעלת מאגר זלוף.
7. תנקבהלב עם חיץ זלוף החופשי Ca ^{2 +} בזרימה של 3 מ"ל / דקה במשך 2-3 דקות.
8. לעבור לאנזים חיץ עיכול ותנקב ל7-10 דקות, לב יהפוך רך יותר וקל יותר בצבע.
9. הערה: זמן עיכול יכול להיות מותאם המבוסס על פעילות אנזים וגודל לב.
10. ברגע שהלב הוא מוחשי רפוי, להוציא את הלב מהצינורית ומניחים בצלחת P60 סטרילי עם הצפת (Ca ^{2 +} חיץ העברה חופשית).
11. הסר אטריה וכלי גדול. הסר חדר ממני אם תרצה בכך. עם מלקחיים, מפריד את החדר לחתיכות קטנות. כמה פעמים פיפטה עם טפטפת העברה 5 מ"ל סטרילי כדי לפזר עוד תאים.
12. סנן את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל דרך מסנן רשת ניילון 250 מיקרומטר.
13. לאפשר ההשעיה עד גלולה במשך כ 10 דקות.
14. העבר את הכדור לפתרון 0.06 מ"מ Ca ^{2 +.} לאפשר לתאי גלולה עבור 10 דקות. תאים בריאים גלולה, בעוד שרוב התאים מתים יצופו. לשאוב supernatant, ולהעביר את הכדור לפתרון ^{2 +} מ"מ Ca 0.24.
15. חזור 10 דגירה דקות, שאיפה, ולהעביר באמצעות שני ^{2 +} פתרונות Ca שנותרו עד תאים בפתרון 1.2 מ"מ. בשלב זה, רוב התאים צריכים להיות myocytes מוט בצורה.

.5 ארעיים התכווצות וסידן מדידה

1. הערה: שתי התכווצות וארעית סידן ניתן למדוד בו זמנית.
2. הכן פורע-2 פתרון PM על ידי resuspending בDMSO נטול מים לריכוז של 1 מיקרוגרם / μl. פתרון הפורע-02:00 יכול להיות מאוחסן בתא ייבוש ב-20 מעלות צלזיוס.
3. 1 טען מ"ל של תאים תלויים עם μl 1 פורע-2 PM. לאפשר לתאים לשבת בחושך 10 דקות לאחר מכן supernatant לשאוב. שטוף פעמיים עם הפתרון של Ca ^{2 +} Tyrode, מאפשר לתאי גלולה בחושך עבור 10 דקות בין שוטף.
4. מניחים coverslip זכוכית בהוספת שלב שמאפשרת PE המחומםrfusion / שאיפה ואלקטרודה צעדה עם ממריץ שדה myocyte. הוספת שלב מקום במיקרוסקופ ההפוכה להגדיר למדידת הקרינה, הוספת טיפה של שמן לעדשה אם באמצעות אובייקטיבי טבילת שמן.
5. הגדרת זלוף כובד המחומם עם פתרון 1.2 מ"מ Ca ^{2 +} של Tyrode כך פתרון על במה מגיע 37 מעלות צלזיוס. צרף שאיפה לואקום. חבר אלקטרודות.
6. הפעל את מערכת מיקרוסקופ, ולפתוח את תוכנת הקרינה ורכישת נתונים מידות תא ratiometric.
7. הוסף כמה טיפות של תאים עמוסים פורע-2 בבוקר ועד הוספת השלב, חסימת זלוף לרגע כדי לאפשר לתאים בריאים להתיישב.
8. השתמש אובייקטיבי 40X כדי לאתר תאים הרצויים. תא בריא צריך להיות מוט בצורה ולא באופן ספונטני להידבקות. צריך כאשר התא בקצב זה בעליל וחוזה אחיד ב5-20 V.
9. הערה: ניתוח פיזיולוגי דורש עיכול באיכות גבוהה. זה אפשרי שיהיה לי תאים שנראים בריא, אבל לא pa ce גם לניתוח פיסיולוגי. פרוטוקול עיכול עשוי לדרוש עידון כדי לקבל איכות גבוהה, myocytes הבריא. בנוסף, לבבות מוטציה או חולים עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול.
10. התאימו סיבוב עדשה ושינוי צמצם כך התא רצוי הוא בשורה בצורה אופקית על מסך ורקע אינה גלויה.
11. יישר ברים גילוי קצה לכל קצה של myocyte ולהתאים סף. יישר זיהוי sarcomere על חלק מתא עם sarcomeres האחיד. ככל שאתה יכול לעשות זה בר, המודל המתמטי מדויק יותר של אורך sarcomere יהיה, כל עוד זה לא על שתי אוכלוסיות של sarcomeres.
12. תאי קצב ב2 הרץ ו5-20 V של 10-15 שניות לפני ההקלטה.
13. רשומה מעקב. אור הסביבה צריך להיות ממוזער להקלטה ארעית סידן הטוב ביותר.

.6 ניתוח

1. לנתח עקבות באמצעות הקרינה ratiometric ותוכנת רכישת נתונים מידות תא.

כותרת "> 7. מחקרים נוספים

1. פרוטוקול זה מספק תאים עודפים שיכול לשמש למגוון רחב של ניסויים אחרים, כוללים: קיבעון וimmunostaining, הערכת השפעות ישירות סמים, תרבות טווח קצרה, ומיקרוסקופ כוח אטומי.

Representative Results

ברגע שההתכווצות והעתקים חולפים נאספות (איור 2), הנתונים מנותחים בקלות עם התוכנה המתאימה. המעקב כל, או החלקים מן יכול להיות בממוצע (איור 3). התכווצות יכולה להיות מנותחת במגוון של דרכים. לתפקוד הסיסטולי, אחד יכול להעריך את סדר הגודל של התכווצות עם קיצור חלקי, או במהירות של התכווצות עם זמן להגיע לשיא קיצור, ומהירות התכווצות. פונקציה הדיאסטולי ניתן לנתח באופן דומה עם זמן לקיצור 50% ומהירות הרפיה. עבור ארעיים סידן, ניתן להשוות נתונים דומים הכוללים בסיס ושיא הפורע-2 יחסים וזמן להגיע לשיא או נקודת התחלה (לוח 8). ניתוחים אלה מספקים נתונים דומים מלב WT וKO על תפקוד התכווצות סלולארי סיסטולי ודיאסטולי, כמו גם שטף סידן, כל אחד מהם יכולים להיות שונה בלב עם תפקוד לקוי של איבר כולו דומה. בנוסף, תאים מאותו הבידוד יכוליםלשמש בניסויים אחרים כפי שמופיע בפרוטוקול, כוללים מכתים immunohistochemical (איור 4).

Ca 2 + Tyrode החופשי	מ"מ	FW / ריכוז	הסכום עבור 2 L פתרון
NaCl	135	58.44 גרם	15.8 גרם
KCl	4	74.56 גרם	0.596 גרם
MgCl 2	1	1 M	2 מ"ל
HEPES	10	238.31 גרם	4.77 גרם
לאא 2 PO 4	0.33	141.96 גרם	0.094 גרם

פתרון 1 של Tyrode ללא סידן שולחן - ריאדNTS ל2 L של הפתרון של מניית Ca ^{2 +} -חינם Tyrode.

1.2 מ"מ Ca 2 + Tyrode	מ"מ	FW / ריכוז	הסכום עבור 2 L פתרון
NaCl	137	58.44 גרם	16 גרם
KCl	5.4	74.56 גרם	.805 גרם
MgCl 2	0.5	1 M	1 מ"ל
HEPES	10	238.31 גרם	4.77 גרם
CaCl 2 · 2H 2 O	1.2	147.01 גרם	0.353 גרם

פתרון טבלה 2 1.2 מ"מ סידן של Tyrode - ריאגנטים ל2 L של מניית 1.2 מ"מ Ca ^{2 +}פתרון.

זלוף מאגר	מ"מ	FW	הסכום ב150 מ"ל Ca 2 + Tyrode החופשי
גלוקוז	10	180.16 גרם	0.27 גרם
2,3-Butanedione-monoxime (BDM)	10	101.11 גרם	0.152 גרם
טאורין	5	125.16 גרם	0.094 גרם

לוח 3: זלוף מאגר - ריאגנטים להכנת חיץ זלוף ביום של ניסוי.

חיץ	35 מ"ל זלוף מאגר
אלבומין בסרום שור (BSA)	0.175 גרם

.4 הצפת שולחן - ריאגנטים להכין מאגר ביום של ניסוי.

החיץ B	מ"מ	FW	חיץ 25 מ"ל Ca 2 + Tyrode
גלוקוז	5	180.16 גרם	.0225 גרם

לוח 5: הצפת B - ריאגנטים להכין הצפת B ביום של ניסוי.

העבר את הצפת	חיץ (מ"ל)	החיץ B (מ"ל)
0.06 מ"מ Ca 2 +	9.5	0.5
0.24 מ"מ Ca 2 +	8	2
0.6 מ"מ Ca 2 +	5	5
1.2 מ"מ Ca 2 +	0	10

שולחן הצפת .6 העברה - ריאגנטים להכנת חיץ העברה ביום של ניסוי.

אנזים עיכול הצפת	25 מ"ל זלוף מאגר
Collagenase B	0.4 מ"ג משקל גוף / g
Collagenase D	0.3 מ"ג משקל גוף / g
פרוטאז XIV	0.05 מ"ג משקל גוף / g

לוח 7: אנזימים עיכול חוצץ - ריאגנטים להכין di אנזים חיץ Gestion ביום של ניסוי.

התכווצות
Baseline	1.73 מיקרומטר
שיא	1.64 מיקרומטר
קיצור חלקי	4.70%
זמן להגיע לשיא	0.056 שניות
זמן תחילת המחקר 50%	0.043 שניות
ארעיים סידן
Baseline	1.18
שיא	1.32
זמן להגיע לשיא	0.021 שניות
זמן תחילת המחקר 50%	0.083 שניות

לוח 8 חולף התכווצות וסידן ניתוחים. N = 5.

n-page = "תמיד">
איור 1 סקירה כללית של עיצוב ניסיוני. ) לב מתעכל באמצעות זלוף כלילית עם חיץ עיכול אנזים. B) תאים מפוזרים יותר לתוך myocytes פרט, בריא. תאי C) מועברים ברצף באמצעות ריכוזי סידן הגדלת כך שהתאים יהפכו סידן סובלני. ד) תאים נטענים עם סידן תלוי צבע, פורע-2 תאי AM. E) טעון על חשמל בקצב בזמן שאורך sarcomere, אורך תא, וקרינה נרשמים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 Contrac לדוגמא)tility איתור מיוצג על ידי אורך sarcomere לעומת זמן. ארעיים סידן B) לדוגמא מיוצג על ידי הפורע-2 יחס לעומת זמן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3) מעקב התכווצות ממוצע לאחר הניתוח. B) הממוצע של ארעיים סידן לאחר ניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צביעת .4 Immunofluorescent דמותו של שלד תא cardiomyocyte (α-actinin).

Discussion

בידוד של שריר לב באיכות דורש רמה מסוימת של תרגול ואופטימיזציה. פרוטוקול זה מכיל שלבים עיקריים שיכול להשפיע על התוצאה של העיכול באופן משמעותי. אלה יש לשקול בזהירות בעת ביצוע ופתרון הבעיות בפרוטוקול. הזמן מהסרת הלב לcannulation וזלוף צריך להיות ממוזער, באופן אידיאלי פחות מחמש דקות. שטיפת הלב מייד במאגר זלוף קר כקרח לאחר הסרת מהעכבר ולנתח וcannulating הלב במאגר קר כקרח גם תגדיל את הסיכויים של מערכת עיכול איכות. Cannulation עצמו הוא שלב קריטי. הקצה של הצינורית יש להציב מתחת לענפים הראשונים של אב העורקים אך לא דרך מסתם אאורטלי לתוך החדר, כמו זה יהיה למנוע טפטוף של העורקים הכליליים. זלוף כלילית הוא חיוני לעיכול איכות. במעבדה זו, הצינורית מחוברת למזרק מלא בחיץ זלוף. בעדינות הזרקת smalסכום l של חיץ זלוף לאחר ההתקנה וצפייה בעורקים הכליליים ברורים של דם יכולים לבדוק הלימות cannulation.

פתרון בעיות בפרוטוקול זה כרוך בהערכה בזהירות את הצעדים קריטיים האמורים. אם הלב אינו הופך להיות מוחשי רך במהלך העיכול, יש כמה גורמים אפשריים. ראשית, במהלך cannulation, הקצה של הצינורית ייתכן שהתקדם אל מעבר לשסתום אב העורקים, מניעת זלוף דרך העורקים הכליליים. זה יכול להיות מוערך לפני שניתק הלב על מנגנון Langendorff אבל דוחף כמות קטנה של חיץ זלוף דרך הצינורית עם מזרק וצופים בזהירות לעורקים הכליליים לברור של דם. אם זלוף הוא נאות אבל הלב אינו לעכל היטב, לשקול רכישת מגרשים שונים של אנזימים. בגלל שהאנזימים הם למעשה תערובות, הרבה לא מתנהגים באופן זהה. אנו ממליצים לרכוש כמויות קטנות של כל אנזים. כאשר הרבה נמצאים שמעכל היטב, purcהאזה כמויות גדולות יותר של הרבה שלשימוש עתידי. כפי שנאמר, אם לנתיחה וcannulation של הלב לקחת זמן רב יותר מאשר 5-10 דקות, באיכות של התאים מתעכלים יכולה להיות עניה. שקול בידודים השלימו עם סוג בר או חיות שלא טופלו להשתלט על הנתיחה לפני שעבר למפסיד יוצא, או בעלי חיים שטופלו. לאחר עיכול, תאים חייבים להיות לאט להתבצע סידן סובלני. תאים צריכים להשקיע לפחות 10 דקות בכל אחד מפתרונות סידן. ממהר צעדים אלה יכולים להפחית את התשואה וכדאיות של תאים.

למרות שחזור, המדידות הפיזיולוגיות תלויות במתחילות עם עיכול איכות. בעת בחירת תאים למדוד, לבחור תאים שאינם באופן ספונטני התקשרות, דבר המצביע על קרום דולף, ניזוק תא. תאים צריכים להתכווץ באופן אחיד, כאשר בקצב. שקול צעדה תאים ל10-15 שניות לפני הקלטת מדידות על מנת להבטיח עקביות התכווצות. אם תא נראה שהתקשרות באופן אחיד, אך המדידות של שיתוףגודל ntraction משתנה באופן דרסטי לאורך זמן, לבדוק תחילה לוודא כי האזור של עניין המוגדר מכסה רק אחד אוכלוסייה של sarcomeres. לפעמים קבוצת שני תאים יחד ואת האזור של העניין (ROI) ניתן למדוד שתי אוכלוסיות שונות של sarcomere כאחד. אם החזר על השקעה מתאימה נבחר אבל ההתכווצות משתנה בתוך תא בודד, התא עשוי להיות גוסס ויש לבחור תא אחר. עבור ארעיים סידן, זה קריטי כדי לדלל פורע-2 לפנות הבוקר בDMSO נטול מים מיובשים כמים משנים את כמות הפורע-2 הנה אשר הוא פונקציונלי זמינה. לאחר טעינה, תאפשר לפחות 20 דקות בין השטיפה הראשונה והארעיים מדידה כדי לאפשר לכל הפורע-2 בבוקר ועד דה esterify בתוך התא. כמו עם כל צבע פלואורסצנטי, להגן על התאים מפני אור במהלך ואחרי הטעינה. תאים מסוימים לא ספיגים הצבע, וכך מדי פעם ארעיים סידן יקויימו בתא שנמדד. למרות שהעתקים ארעיים התכווצות וסידן עשויים להופיע "נקי ", כאשר שיעור צעדה מופחת במידה ניכרת (0.5-1 הרץ), המדידות הן יותר פיסיולוגיות בקצב קרוב יותר לקצב הלב של העכבר, ובכך קצב של לפחות 2 הרץ הוא מועדף.

הבידוד עצמו יכול להיות שונה אם תרצה בכך. מעבדה זו משתמשת בשיטת זרימה מתמדת (3 מ"ל / דקה לעכברים) במהלך זלוף. חלק מהקבוצות מצאו כובד לזרום יעיל יותר. זרימת כוח הכבידה זלוף מאפשר לעיכול להיות דמיין בקלות רבה יותר ככל שעולה קצב זרימה כמו הלב מתעכל.

כאמור, בטכניקות אלה עושים לשאת מגבלות. כמו האיכות של המדידות הפיזיולוגיות תלויה באיכות של מערכת העיכול, זה נבון כדי למדוד myocytes מלב יותר מפעם אחת עבור כל תנאי ניסוי. כל לב יספק myocytes רב למדוד, אבל digestions חוזר יבטיח כי תוצאות עולות בקנה אחד בין לבבות. בידוד הוא הליך מסוף, וכך, אם עיצוב ניסיון כרוך follבשל תפקוד הלב של בעלי חיים לאורך זמן, ניתן לקצור שריר הלב רק פעם אחת. יותר עכברים נדרשים כל כך עוקבה ניתן בעקבות אורכים בעוד עכברים בודדים מוקרבים לנתח שריר לב.

ההתמקדות שלנו כבר לומדת התכווצות ומבנה cytoskeletal בעכבר נוקאאוט, לעומת זאת, שריר לב מבודד יכול לשמש למגוון רחב של ניסויים אחרים, כוללים מכתים תא חי לt-tubules, לומד שריר לב מלחץ או עכברי נפח עמוס, בוחן את ההשפעות של תרופתי טיפול, immunofluorescence, transfection ^9, ותעתיק פרופיל ^19. טכניקה תכליתית זו מספקת יתרונות רבים מספור על פני שיטות אחרות המשמשות ללימודים אי ספיקת לב. פיזיולוגיה לימוד של תאים בודדים נותנת מידע שאינו מוצע על ידי מחקרי איבר שלמים כמו אקוקרדיוגרפיה או electrocardiography, מתן תובנה השינויים התאיים המלווים f איבר השלמהailure. בנוסף, תאים מבודדים עדיפים למבנים תת סלולארי הדמיה, כמו כל התא יכול להיות מוכתם בקלות ובצלם. בידוד שריר לב לניתוח של התכווצות, ארעיים סידן, וimmunofluorescence הוא טכניקה מאוד תכליתית, המציעה מידע רב ערך ממגוון עצום של עיצובים ניסיוניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2·2H2O	Fisher	C79
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528
2,3-Butanedione-monoxime (BDM)	Sigma	B-0753
Taurine	Sigma	T-0625
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A-7030
Collagenase B	Roche Diagnostics	1-088-823
Collagenase D	Roche Diagnostics	1-088-882
Protease XIV	Sigma	P-5147
Heparin	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
Isofluorane	Butler Schein	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO – anhydrous	Sigma	276855
IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system	IonOptix
250 μm nylon mesh filter	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G Luer-stub adaptor	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 tubing	Becton Dickinson	427410