Biology

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Published: September 7, 2014 doi: 10.3791/51109

Gretchen M. Roth¹, David M. Bader^1,2, Elise R. Pfaltzgraff²

¹Department of Medicine, Vanderbilt University, ²Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

Protocol

動物に関わるすべての手続きが適切な動物を使用することによって承認されていることを確認し、ボディケア。

1事前に証券バッファを準備します

2Lの株式のCa ^{2 +}フリーのタイロード（ 表1）を準備します。 NaOHでpHを7.4に調整する。
2Lの株式1.2のCa ^{2 +}タイロード（ 表2）を準備します。 NaOHでpHを7.4に調整する。

実験の日に2。、灌流、転送、および消化緩衝液を準備する

のCa ^{2 +}フリーのタイロード（ 表3）に150ミリリットルの灌流液を準備し、0.2μmのフィルターを通して濾過する。
35ミリリットルを準備のCa ^{2 +}の無料送迎「バッファーA」「緩衝液B」（ 表5）を含む（ 表4）と25ミリリットルのCa ^{2 +。} 0.2μmのフィルターを介してそれぞれをフィルタリングします。
0の溶液を調製緩衝液Aおよび表6あたりBを混合することにより0.06、0.24、0.6、および1.2のCa ^{2 +。}
マウスの体重（BW）に基づいて、25ミリリットルの灌流液（ 表7）に消化酵素を溶解させて25ミリリットルの消化緩衝液を調製する。使用前に0.2μmのフィルターを通してろ過する。

3実験のセットアップ

市販または3ミリリットルの流量を可能にするために蠕動ポンプ、配管、熱交換器コイルを用いて、定流量ランゲンドルフ装置を組み立てる/ 37°Cに加熱した灌流液の分。簡単な概略図がベルら ¹⁸によって2011件に設けられている。
カニューレから流出が3ml /分の流速で37°Cになるようにランゲンドルフ装置の水浴温度（〜47℃）を循環させる設定。
超高純度のI型水100ml、続いて15分間灌流システムを介して70％エタノールを実行する。本稿では、Webを介して実行灌流液5分間のm個の気泡を排除しつつ。
目的のメソッドを持つすべての手術器具を滅菌する。
23 Gルアースタブアダプターの先端に、PE-50チューブの短い断片（約3mm）を取り付けることにより、カニューレを作成します。チューブの熱先端が大動脈が配置され、その上リップを作成します。

4心筋細胞の単離

腹腔内注射を介して、0.2ミリリットルのヘパリン溶液（千IU / ml）でマウスを注入する。
5分後、イソフルランでマウスを麻酔。（強い足のピンチに応答なし）完全に麻酔をかけたときに、70％エタノールで胸をスプレー。胸を開き、すぐに心臓を切除、大動脈、および4℃の灌流液内の場所を傷つけないように注意しながら。把握し、心の下で持ち上げるように湾曲した鉗子を使用してください。これは細かいハサミで心の後ろに添付ファイルをトリミングする領域を作成します。
優しく細かい鉗子2対の大動脈の端をつかんで慎重にopeniを引っ張ることにより、心臓にカニューレを挿入カニューレのリップの上大動脈のngの。これは冠状動脈を介して心臓の灌流を阻害するように、カニューレの先端が大動脈弁を過ぎおよび心室にないことを確認してください。
すぐにカニューレのリップの上行大動脈の周囲に5-0絹縫合糸のループを接続することによりカニューレに大動脈を固定します。
注：4.4を通じて4.2可能な限り迅速に、最高品質の消化のために完了する必要があります手順。
注：心はすでに灌流液を流しながらランゲンドルフ装置に取り付けられたカニューレに直接掛けることができます。しかし、解剖顕微鏡下で灌流液の小さなシリンジに取り付けられたカニューレに心臓をぶら下げ最も成功したことが見出されている。これは、冠状動脈のクリアを監視し、心臓が確実にカニューレに取り付けられ、確実に、灌流液の少量を介してプッシュされることを可能にする。カニューレは、その後、灌流液を流水でランゲンドルフに掛けている。
灌流2-3分間3ミリリットル/分の流量でのCa ^{2 +}フリーの灌流バッファーで心。
消化緩衝液酵素および7-10分間灌流するスイッチ、心は色が柔らかく、軽くなります。
注：消化時間は、酵素活性及び心臓の大きさに基づいて調整することができる。
心臓が触知弛緩すると、緩衝液A（CA ^{2 +}の無料転送バッファ）で無菌のp60皿にカニューレと場所から心臓を取り出します。
心房および大血管を削除します。必要に応じて、右心室を削除します。鉗子を使用すると、小さな断片に心室を分ける。さらに、細胞を分散させるための無菌の5mlホールピペットとピペットを数回。
250μmのナイロンメッシュフィルターに通した50mlコニカルチューブに細胞懸濁液をフィルタリングする。
懸濁液は約10分間ペレット化するようにします。
0.06のCa ^{2 +}溶液中にペレットを転送します。細胞を10分間ペレット化するようにします。ほとんどの死細胞が浮遊しながら健康な細胞は、ペレットにします。上清を吸引し、0.24のCa ^{2 +}の溶液にペレットを移す。
10分間のインキュベーションを繰り返し、吸引し、細胞を1.2 mM溶液になるまで、残りの二つのCa ^{2 +}ソリューションを通じて転送します。この時点で、細胞の大部分は、棒状筋細胞である必要があります。

5。収縮およびカルシウムトランジェントを測定する

注：収縮性とカルシウムトランジェントの両方を同時に測定することができる。
を1μg/μlの濃度に無水DMSOに再懸濁することにより、フラ-2 AM溶液を調製する。フラ-2 AM溶液を、-20℃でデシケーター中に保存することができる。
負荷1μlのフラ-2 AMで懸濁した細胞の1ミリリットル。細胞は、上清を吸引した後、暗い10分で静置する。細胞は洗浄の間に、10分間、暗所でペレット化することができ、カルシウム^{2 +}タイロード溶液で2回洗浄する。
加熱されたPEを可能にする段階文書にカバーガラスを置きrfusion /吸引し、筋細胞フィールド刺激をペーシング電極。倒立顕微鏡に置き、ステージインサートは、油浸対物レンズを使用している場合、レンズへのオイルの滴を追加して、蛍光測定用に設定。
1.2のCa ^{2 +}タイロード液で加熱された重力の灌流を設定し、ステージ上の溶液を37℃に達するようにします。真空吸引を取り付けます。電極を取り付けます。
顕微鏡システムの電源を入れ、レシオメトリック蛍光およびセル寸法データ収集ソフトウェアを開きます。
瞬間的に灌流の遮断が健康な細胞を沈降させるために、ステージインサートにフラ-2 AM負荷細胞の数滴を追加します。
の所望の細胞を配置する対物レンズ40倍を使用してください。健康な細胞は棒状ではなく、自発的に収縮するである必要があります。それは、目に見えて、均一に契約セルは5〜20 Vでペーシングされるべきとき
注意：生理解析は、高品質の消化を必要とします。それは健康的に見えますが、PAをしない細胞を有することが可能である生理学的な解析のためにうまくCE。消化プロトコルは、高品質、健康的な筋細胞を得るために洗練が必要な場合があります。さらに、変異体または疾患の心は、プロトコルへの変更が必要な場合があります。
レンズ回転を調整し、所望のセルが画面上に水平に並んで背景が表示されていないされて開口部を変更してください。
筋細胞の両端にエッジ検出棒の位置を合わせ、しきい値を調整。均一な筋節での細胞の一部に筋節検出を合わせます。もはやあなたは、このバーを作ることができ、筋節の長さのより正確な数学的モデルは、それが筋節の2集団ではないので、となります。
記録前2 Hzから10〜15秒5-20 Vでペース細胞。
録音のトレース。周囲の光が最高のカルシウムトランジェント記録用に最小化されるべきである。

6。分析

レシオメトリック蛍光および細胞寸法データ収集ソフトウェアを使用してトレースを分析します。

タイトル "> 7。さらなる研究

固定および免疫染色、直接的な薬物の効果を評価する、短期文化、原子間力顕微鏡：このプロトコルは、を含む他の実験さまざまな目的で使用することができ、過剰な細胞を提供する。

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Representative Results

（ 図2）の収縮性と過渡追跡が収集されると、データは容易に適切なソフトウェアを用いて分析される。全体トレースまたはその一部（ 図3）を平均化することができる。収縮性は、さまざまな方法で分析することができる。収縮機能のために、人はショートニングピークまでの時間、および収縮速度を短縮率と収縮の大きさ、または収縮の速度を評価することができます。拡張機能は、50％の短縮及び緩和速度と時間と同様に分析することができる。カルシウム過渡応答のために、同様のデータは、ベースラインとピークのFura-2比と時間ピークまでのベースライン（ 表8）を含む、比較することができます。これらの分析は、類似の全器官の機能不全と心に変化させることができたこれらのいずれも収縮期および拡張期の細胞収縮機能上のWT及びKOの心だけでなく、カルシウム流からの比較可能なデータを提供する。さらに、同じアイソレーションからの細胞をすることができますプロトコールに記載されているように免疫組織化学的染色（ 図4）を含む、他の実験のために使用される。

のCa ^{2 +}を無料タイロード	mMの	FW /濃度	2 L溶液のための金額
NaClを	135	58.44グラム	15.8グラム
塩化カリウム	4	74.56グラム	0.596グラム
のMgCl ₂	1	1 M	2ミリリットル
HEPES	10	238.31グラム	4.77グラム
のNaH ₂ PO ₄	0.33	141.96グラム	0.094グラム

表1カルシウムを含まないタイロード液 -レアージュ株式のCa ^{2 +}を含まないタイロード溶液を2LのためにNTS。

1.2のCa ^{2 +}タイロード	mMの	FW /濃度	2 L溶液のための金額
NaClを	137	58.44グラム	16グラム
塩化カリウム	5.4	74.56グラム	0.805グラム
のMgCl ₂	0.5	1 M	1ミリリットル
HEPES	10	238.31グラム	4.77グラム
のCaCl _{2·2H 2} O	1.2	147.01グラム	0.353グラム

表2 1.2mMのカルシウムタイロード液 -株式1.2のCa 2リットル用試薬²⁺ソリューション。

灌流バッファー	mMの	FW	150ミリリットルのCa ^{2 +}の量を無料タイロード
グルコース	10	180.16グラム	0.27グラム
2,3-ブタンジオン - モノオキシム（BDM）	10	101.11グラム	0.152グラム
タウリン	5	125.16グラム	0.094グラム

表3潅流バッファ -試薬、実験の日に灌流液を調製した。

バッファA	35ミリリットル灌流バッファー
ウシ血清アルブミン（BSA）	0.175グラム

表4バッファーA -試薬は、実験の日に緩衝液Aを調製した。

緩衝液B	mMの	FW	25ミリリットルのCa ^{2 +}タイロードバッファー
グルコース	5	180.16グラム	0.0225グラム

表5緩衝液B -試薬は、実験の日に緩衝液Bを調製した。

バッファ転送	バッファーA（ml）を	緩衝液B（ml）を
0.06のCa ^{2 +}	9.5	0.5
0.24のCa ^{2 +}	8	2
0.6のCa ^{2 +}	5	5
1.2のCa ^{2 +}	0	10

表6に転送バッファ -試薬は実験当日に転写緩衝液を調製した。

酵素消化緩衝液	25ミリリットル灌流バッファー
コラゲナーゼB	は0.4mg / g体重
コラゲナーゼD	は0.3mg / g体重
プロテアーゼXIV	は0.05mg / g体重

表7酵素消化緩衝液 -試薬酵素ジを準備する実験の日に、輻輳バッファ。

収縮性
ベースライン	1.73ミクロン
ピーク	1.64ミクロン
短縮率	4.70パーセント
ピークまでの時間	0.056秒
50％のベースラインまでの時間	0.043秒
カルシウムトランジェント
ベースライン	1.18
ピーク	1.32
ピークまでの時間	0.021秒
50％のベースラインまでの時間	0.083秒

表8収縮とカルシウム過渡解析。 N = 5。

実験計画の1。一般概観図。 A）心臓を酵素消化緩衝液で冠灌流を経由して消化する。B）細胞はさらに、個体の健康筋細胞に分散されている。C）細胞の細胞がカルシウム寛容になるように順次増加するカルシウム濃度を介して転送される。D）細胞を依存性カルシウムがロードされている染料は、フラ-2 AM。E）にロードされた細胞が電気的に筋節長、セル長、および蛍光が記録されている間にペーシングされる。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2のA）サンプルcontractilityが対時間。対時間のFura-2比で表さB）サンプルカルシウムトランジェント筋節の長さで表さトレース。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3 A分析後の）平均収縮のトレース。分析後のカルシウム過渡応答のB）の平均。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

心筋細胞の細胞骨格（α-アクチニン）の図4。免疫蛍光染色。

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Discussion

質の高い心筋細胞の単離は、練習と最適化のいくつかのレベルが必要です。このプロトコルは、大幅に消化の結果に影響を与えることができます重要なステップが含まれています。プロトコルを実行すると、トラブルシューティングの際にこれらを慎重に検討する必要があります。カニューレ挿入および灌流に対する心臓の除去からの時間は、理想的には5分未満、最小化されるべきである。氷冷緩衝液で心臓をマウスから除去し、解剖してカニューレ挿入した後、氷冷潅流バッファにすぐに心をすすぎは、品質消化の可能性を高めるでしょう。カニュレーション自体は重要なステップです。これは冠状動脈の灌流を防ぐことができますようにカニューレの先端は、大動脈の最初の枝の下ではなく、大動脈弁を通して心室に配置する必要があります。冠灌流は品質消化に不可欠です。この研究室では、カニューレは、灌流緩衝液で充填されたシリンジに取り付けられている。ゆっくりSmalのを注入する血液の明確な冠状動脈を取り付け、見た後、灌流液lの量がカニュレーションの妥当性をテストすることができます。

このプロトコルのトラブルシューティングを慎重に、前述の重要なステップを評価することを含む。心臓が消化中に触知ソフトにならない場合は、数の潜在的な原因があります。まず、カニューレ挿入の際に、カニューレの先端が冠状動脈を経由して灌流を防止、大動脈弁を越えて進められている可能性があります。これはランゲンドルフ装置上で心をぶら下げなくシリンジでカニューレを通して灌流液の少量を押し、血液を明確に冠状動脈を注意深く見ている前に評価することができる。灌流が適切であるが、心はよく消化しない場合は、酵素の異なるロットの購入をご検討ください。酵素は、実際の混合物であるため、多くは同じように行動しない。私たちは、各酵素の少量の購入をお勧めします。ロットは、purcよく消化していることが発見された場合将来の使用のために、その多くのより多くの量をHASE。説明したように解剖し、心臓のカニューレ挿入が5〜10分よりも長いを取る場合、消化された細胞の品質が低下することができる。ノックアウトまたは処置動物に移る前に解剖をマスターする野生型または未処理動物と完成アイソレーションを考えてみましょう。消化後、細胞がゆっくりとカルシウムが耐性となることがなければなりません。細胞は、カルシウム溶液のそれぞれに、少なくとも10分を費やすべきである。これらのステップを急ぐことは細胞の収率および生存率を低下させることができる。

再現可能なものの、生理学的測定は、品質消化で始まるによって異なります。測定する細胞を選択すると、自然に漏出、損傷した細胞膜を示しており、収縮していない細胞を選択します。ペースの時に、細胞を均一に縮小しなければならない。収縮の整合性を確保するために測定値を記録する前に10〜15秒のために細胞をペーシングを検討してください。セルが均一に収縮しているように見えますが、共同の測定をする場合ntractionの大きさは、大幅に時間をかけて、最初に定義された関心領域は、筋節の唯一の人口をカバーすることを確認してください異なります。時折つのセルのグループ化と関心領域（ROI）は、一つとして筋節の二つの異なる集団を測定することができる。適切なROIが選択されなく収縮性は、単一のセル内の変数である場合、細胞は死んでいてもよく、別のセルが選択されるべきである。カルシウム過渡応答のためには、水は、機能的に利用可能であるフラ-2 AMの量を変化させるように乾燥の無水DMSO中のFura-2 AMを希釈するために非常に重要です。ロード後、すべてのFura-2 AMは細胞内で脱エステル化することができるように最初の洗浄·測定トランジェントの間に少なくとも20分を可能にします。任意の蛍光色素と同様に、ロード中および後の光から細胞を保護する。いくつかの細胞は、カルシウムトランジェントが測定されたセルで観察されませんので、時折、色素を取り込むことはありません。収縮性およびカルシウムトランジェントトレーシング」が表示されることがありますがペーシングレートが大きく（0.5〜Hz）を低減するクリーン」、測定が近いマウスの心拍数、好ましい少なくとも2 Hzでのこのようにペース速度で、より生理的である。

必要に応じて分離自体は変更することができます。本研究室では、灌流中に一定フロー法（マウスについて3ミリリットル/分）を使用します。いくつかのグループは、重力がより効果的な流れを発見した。心臓が消化されるように消化流量が増加するにつれて、より容易に可視化されるために重力流灌流が可能になる。

上述したように、これらの技術は、制限を運ぶない。生理学的測定の質が消化の品質に依存しているように、各実験条件に対して複数の心臓から心筋細胞を測定することが賢明である。各心臓は測定するための多くの筋細胞を提供しますが、繰り返し消化は、結果が心の間で一貫していることが保証されます。実験計画はfollを伴う場合の分離は、このように、端末の手順である時間をかけて、動物の心臓機能をにより、心筋細胞は一度しか採取することができる。よりマウスは個別のマウスが心筋細胞を分析するために犠牲にしている間コホートを縦方向に続くことができるので、必要とされる。

私たちの焦点は、ノックアウトマウスでは収縮性および細胞骨格構造を研究したが、分離された心筋細胞は、薬理学的効果を調べる、圧力または容積過負荷にしたマウス由来の心筋細胞を研究し、T管用の生細胞染色など、他の実験のさまざまな目的で使用することができます治療、免疫蛍光、トランスフェクション^9、および転写プロファイリング^19。この多目的技術は、心不全を研究するために使用される他の方法よりも無数の利点を提供する。個別の細胞の生理を研究することは全臓器fのに伴う細胞の変化への洞察を提供し、そのような心エコー検査や心電図などの全器官の研究によって提供されていない情報を提供しますailure。全細胞を容易に染色し、画像化することができるように、また、単離された細胞は、画像化サブ細胞構造のために優れている。収縮、カルシウムトランジェント、および免疫蛍光の分析のための心筋細胞を分離する実験的なデザインの膨大な種類から貴重な情報を提供しています、非常に汎用性の高い技術です。

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Disclosures

私たちは、開示することは何もない。

Acknowledgments

細胞·発生生物学のビデオ撮影機器の部門を使用するためのマーク·ウォズニアック。

ヴァンダービルト大学の細胞イメージング共有リソース。

この作品は、ERPへのAHA助成12PRE10950005、DMBにするDMB、NIH助成金R01 HL037675にAHA助成11GRNT7690040によってサポートされています。 DMBは、心血管研究におけるグラディスP.スタールマンチェアです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl₂	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH₂PO₄	Sigma	S5011
CaCl₂·2H₂O	Fisher	C79
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528
2,3-Butanedione-monoxime (BDM)	Sigma	B-0753
Taurine	Sigma	T-0625
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A-7030
Collagenase B	Roche Diagnostics	1-088-823
Collagenase D	Roche Diagnostics	1-088-882
Protease XIV	Sigma	P-5147
Heparin	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
Isofluorane	Butler Schein	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO – anhydrous	Sigma	276855
IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system	IonOptix
250 μm nylon mesh filter	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G Luer-stub adaptor	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 tubing	Becton Dickinson	427410