Protocol
동물과 관련된 모든 절차가 적절한 동물 사용의 승인을 확인하고 몸을 관심.
1 사전에 주식 버퍼를 준비합니다
- 이 L 재고 칼슘 무료 타이로드의 (표 1)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.
- 이 L 재고 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드의 (표 2)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.
실험의 날 2는, 관류, 전송, 소화 버퍼를 준비합니다
- 칼슘 + 무료 타이로드의 (표 3)에 150 ml의 관류 버퍼를 준비하고 0.2 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
- 35 ML을 준비 칼슘 무료 전송 "버퍼" "버퍼 B"(표 5)를 포함 (표 4)과 25 ㎖의 칼슘. 0.2 μm의 필터를 통해 각각의 필터.
- 공의 솔루션을 준비0.06, 0.24, 0.6, 및 혼합 버퍼 1.2 밀리미터 칼슘과 B 표 6 당.
- 마우스의 체중 (BW)에 기초하여 25 ㎖의 관류 완충액 (표 7)에 소화 효소를 용해하여 25 ㎖의 분해 완충액을 준비한다. 사용하기 전에 0.2 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
3 실험 설정
- 시판 또는 3 ㎖의 유속을 허용하는 연동 펌프, 배관 및 열 교환기 코일을 사용하여, 정 유량 랑겐 돌프 장치를 조립 / 37 ° C로 가열 된 관류 액의 분. 간단한 도식 벨 2,011 리뷰 제공, 그 외 18됩니다.
- 정맥으로부터 유출 3 ㎖ / 분의 유속으로 37 ° C에서 그래서 랑겐 돌프 장치의 순환 수조 온도 (~ 47 ° C)를 설정.
- 초순수 타입 I 물 100 ㎖ 다음에 15 분 동안 관류 시스템을 통해 70 % 에탄올을 실행. 정기적 복용을 통해 실행 관류 버퍼5 분간 m은 기포를 제거하면서.
- 원하는 방법으로 모든 수술 도구를 소독.
- 23 G 루어 스텁 어댑터의 끝 부분에 PE-50 튜브의 짧은 조각 (약 3mm)를 부착하여 정맥을 만듭니다. 튜브의 열 팁은 대동맥이 배치 될 동안 입술을 만들 수 있습니다.
4 심근 격리
- 복강 내 주사를 통해, 0.2 ml의 헤파린 용액 (1000 IU / ml)로 마우스를 주입한다.
- 5 분 후, 이소 플루오 란에 마우스를 마취. 완전히 (강한 발 핀치에 대한 응답)를 마취하지 않는 경우, 70 % EtOH로 가슴에 스프레이. 가슴을 열고 신속하게 4 ° C 관류 버퍼의 대동맥과 장소를 손상되지 않도록주의하면서 마음을 절제. 잡고 마음에서 들어 올려 곡선 집게를 사용합니다. 이 미세 가위로 마음의 뒤에 첨부 파일을 트림 공간을 만듭니다.
- 부드럽게 잘 포셉 이쌍과 대동맥의 가장자리를 잡고 조심스럽게 openi을 당겨 마음을 Cannulate캐 뉼러의 입술을 통해 대동맥의 NG. 이 관상 동맥을 통해 심장의 재관류을 억제하므로, 캐뉼라의 선단 대동맥판지나 뇌실에 있지 않은지 확인.
- 즉시 정맥의 입술 위의 대동맥 주위에 5-0 실크 봉합사의 루프를 매서 캐 뉼러에 대동맥을 고정합니다.
- 참고 : 4.4을 통해 4.2 가능한 한 빨리 최고 품질의 소화 완료해야 단계를 반복합니다.
- 주 : 마음은 이미 관류 버퍼를 흐르는 랑겐 돌프의 장치에 부착 된 정맥에 직접 걸 수 있습니다. 그러나, 해부 현미경으로 관류 버퍼의 작은 주사기에 부착 된 정맥에 마음을 매달려 가장 성공적인 것으로 밝혀졌다. 이것은 관류 완충액 소량 관상 동맥의 삭제에 대한 시청 안전하게 캐뉼라에 부착되는 심장을 보장 통해 푸시 될 수있다. 정맥은 관류 버퍼를 실행하는 랑겐 돌프에 걸려있다.
- 관류2 ~ 3 분 동안 3 ㎖ / min의 유량 칼슘 무료 관류 버퍼 마음.
- 소화 버퍼 효소 및 7 ~ 10 분 동안 관류로 전환, 마음은 색상 부드럽고 가벼운 될 것입니다.
- 주 : 분해 시간은 효소 활성 및 심장 크기에 따라 조정될 수있다.
- 마음이 palpably 이완되면, 버퍼 (칼슘 무료 전송 버퍼)와 멸균 P60 접시에 정맥과 장소에서 마음을 제거합니다.
- 심방과 큰 혈관을 제거합니다. 원하는 경우 우심실을 제거합니다. 핀셋으로 작은 조각으로 심실을 구분합니다. 멸균 5 ML 전송 피펫 피펫 여러 번 더 세포를 분산합니다.
- 250 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 50 ml의 원추형 튜브에 세포 현탁액을 필터.
- 서스펜션은 약 10 분 동안 펠렛을 허용합니다.
- 0.06 밀리미터 칼슘 용액에 펠렛을 전송합니다. 세포는 10 분 동안 펠렛을 허용합니다. 대부분의 사균 플로트 반면 건강한 세포 펠렛 것이다. 뜨는을 기음과 0.24 mM의 칼슘 용액에 펠렛을 전송합니다.
- 10 분 배양, 구토물이기도를 반복 한 세포가 1.2 mM의 용액에 때까지 나머지 두 칼슘 솔루션을 통해 전송할 수 있습니다. 이 시점에서, 세포의 대부분은 막대 모양의 근세포이어야한다.
(5) 측정 수축성과 칼슘 과도
- 주 : 수축성 칼슘 과도 모두 동시에 측정 할 수있다.
- 1 μg / μL의 농도로 무수 DMSO에 재현 탁에서의 Fura-2 오전 솔루션을 준비합니다. 의 Fura-2 오전 솔루션은 -20 ° C에서 데시 케이 터에 저장 될 수 있습니다.
- 부하 1 μL의 Fura - 오전 2시와 정지 세포의 1 ML. 세포가 어두운 10 분 후 흡인 상등액에 앉아 할 수 있습니다. 세포는 세척 사이 10 분 동안 어둠 속에서 펠렛 할 수 있도록 칼슘 타이로드의 솔루션으로 두 번 씻으십시오.
- 가열 체육을 할 수있는 무대 삽입에 유리 커버 슬립을 배치심근 필드 자극기와 페이싱 rfusion / 흡인 전극. 거꾸로 현미경에 배치 무대 삽입 오일 침지 목표를 사용하는 경우 렌즈에 오일 한 방울을 추가, 형광 측정을 위해 설정합니다.
- 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드의 솔루션을 가열 중력 관류를 설정 무대에서 솔루션은 37 ° C에 도달 할 수 있도록. 진공 흡입을 연결합니다. 전극을 연결합니다.
- 현미경 시스템의 전원을 켜고 비율 계량 형광 및 세포 치수 데이터 수집 소프트웨어를 엽니 다.
- 일시적으로 혈류를 차단하는 것은 건강한 세포가 정착 할 수 있도록 무대 삽입에의 Fura - 오전 2로드 세포의 몇 방울을 추가합니다.
- 원하는 셀을 찾으려면 40 배 목표를 사용합니다. 건강한 세포는 막대 모양의 자발적 계약을 체결하지해야합니다. 그것은 눈에 띄게 균일 계약 셀은 5 ~ 20 V.에 진행되는시기
- 주 : 생리 학적 분석은 고품질의 소화를 필요로한다. 그것은 건강한 보이지만 연평균하지 않는 세포를 가질 수 있습니다 생리 학적 분석을 위해 잘 CE. 소화 프로토콜은 높은 품질, 건강한 근육 세포를 얻기 위해 정제가 필요할 수 있습니다. 또한, 돌연변이 또는 질병 마음 프로토콜에 대한 수정이 필요할 수 있습니다.
- 렌즈 회전 및 변경 조리개 그렇게에 원하는 화면 및 배경에 가로로 줄 지어 조정합니다 볼 수 없습니다.
- 심근 세포의 양 끝을 에지 검출 막대를 맞추고 임계 값을 조정합니다. 균일 한 sarcomeres와 세포의 일부에 근절 검출을 맞 춥니 다. 더 이상 당신이 줄을 만들 수 있습니다, 근절 길이의보다 정확한 수학적 모델이 너무 오래가 sarcomeres의이 인구에 없기 때문에 것입니다.
- 페이스 세포 2 Hz에서 녹음하기 전에 10 ~ 15 초 동안 5 ~ 20 V에서.
- 기록 추적. 주변 광에 가장 칼슘 과도 녹화 최소화해야한다.
(6) 분석
- 비율 적 형광 및 셀 치수 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 트레이스를 분석한다.
- 고정 및 면역 염색, 직접 약물 효과, 단기 문화, 원자력 현미경 평가 :이 프로토콜을 포함한 다른 다양한 실험에 사용할 수있는 과량의 세포를 제공한다.
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Representative Results
수축력이 과도 트레이싱 (도 2)를 수집되면, 데이터는 쉽게 적절한 소프트웨어로 분석한다. 전체 추적, 또는 그 일부 (도 3)을 평균화 할 수있다. 수축력은 다양한 방식으로 분석 될 수있다. 수축기 함수, 한 단축과 피크 부분 단축, 또는 시간의 속도로 수축 수축의 크기 및 수축 속도를 평가할 수있다. 이완기 기능은 50 % 단축 및 휴식 속도와 시간을 유사하게 분석 할 수 있습니다. 칼슘 과도를 들어, 유사한 데이터베이스 라인과 피크의 Fura-2 비율 및 시간 뾰족하거나 기준 (표 8)를 포함하여 비교 될 수있다. 이러한 분석은 유사한 전체 장기 부전으로 마음에서 변경 될 수있는있는 수축기 및 이완기 세포 수축 기능에 대한 WT와 KO 마음뿐만 아니라 칼슘 플럭스에서 비교 데이터를 제공합니다. 또한, 동일한 세포로부터 분리 할 수있다면역 조직 화학 염색 (도 4)를 포함하는 프로토콜에 나열된 다른 실험에 사용될.
| 칼슘 + 무료 타이로드 | mM의 | FW / 농도 | 양이 L 솔루션 |
| 염화나트륨 | 135 | 58.44 g | 15.8 g |
| 의 KCl | 4 | 74.56 g | 0.596 g |
| MgCl2를 | 1 | 한 M | 2 ML |
| HEPES | 10 | 238.31 g | 4.77 g |
| 의 NaH 2 PO 4 | 0.33 | 141.96 g | 0.094 g |
표 1 칼슘이없는 타이로드의 솔루션 - Reage재고 칼슘 - 무료 타이로드의 솔루션이 L에 대한 국세청.
| 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드 | mM의 | FW / 농도 | 양이 L 솔루션 |
| 염화나트륨 | 137 | 58.44 g | 16g |
| 의 KCl | 5.4 | 74.56 g | 0.805 g |
| MgCl2를 | 0.5 | 한 M | 1 ML |
| HEPES | 10 | 238.31 g | 4.77 g |
| 염화칼슘 2 · 2H 2 O | 1.2 | 147.01 g | 0.353 g |
표 2 1.2 mM의 칼슘 타이로드의 솔루션 - 재고 1.2 밀리미터 칼슘의이 L 용 시약 2 +솔루션입니다.
| 관류 버퍼 | mM의 | FW | 150 ㎖의 칼슘 금액 2 + 무료 타이로드 |
| 포도당 | 10 | 180.16 g | 0.27 g |
| 2,3 - 부탄 - monoxime (BDM) | 10 | 101.11 g | 0.152 g |
| 타우린 | 5 | 125.16 g | 0.094 g |
표 3 관류 버퍼 - 시약 실험 당일 관류 완충액을 제조 하였다.
| 버퍼 | 35 ㎖의 관류 버퍼 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 0.175g |
표 4 버퍼 A - 시약 실험 당일 완충액을 제조 하였다.
| 버퍼 B | mM의 | FW | 25 ㎖의 칼슘 타이로드 버퍼 |
| 포도당 | 5 | 180.16 g | 0.0225 g |
표 5 버퍼 B - 시약 실험 당일 버퍼 B를 제조 하였다.
| 전송 버퍼 | 버퍼 (ML) | 버퍼 B (ML) |
| 0.06 밀리미터 칼슘 | 9.5 | 0.5 |
| 0.24 밀리미터 칼슘 | 8 | 이 |
| 0.6 밀리미터 칼슘 | 5 | 5 |
| 1.2 밀리미터 칼슘 | 0 | 10 |
표 6 전송 버퍼 - 시약 실험 당일에 전송 버퍼를 제조 하였다.
| 효소 분해 완충액 | 25 ㎖의 관류 버퍼 |
| 콜라게나 B | 0.4 밀리그램 / g의 체중 |
| 콜라게나 D | 0.3 밀리그램 / g의 체중 |
| 단백질 분해 효소 XIV | 0.05 밀리그램 / g의 체중 |
표 7은 효소 분해 완충액 - 디 효소 시약을 제조실험 당일 혼잡 버퍼입니다.
| 수축성 | |
| 기준 | 1.73 μm의 |
| 피크 | 1.64 μm의 |
| 분수 쇼트닝 | 4.70 % |
| 시간이 피크 | 0.056 초 |
| 50 % 기준선에 시간 | 0.043 초 |
| 칼슘 과도 | |
| 기준 | 1.18 |
| 피크 | 1.32 |
| 시간이 피크 | 0.021 초 |
| 50 % 기준선에 시간 | 0.083 초 |
표 8 수축성과 칼슘 과도 분석. N = 5.
실험 설계의 1 일반 개요를 그림. A) 심장이 효소 소화 버퍼입니다. B)와 관상 동맥 혈류를 통해 소화 세포 더 개인, 건강한 근육 세포로 분산된다. 세포가 칼슘 허용. D 지도록 C) 세포가 순차적으로 증가 칼슘 농도를 통해 전송되는) 세포가 의존 칼슘로드 염료,의 Fura-2입니다. E)로드 세포가 전기적으로 근절 길이, 셀 길이, 형광 기록하는 동안 진행된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2) 샘플 contrac리티는 대 시간입니다. 대 시간의 Fura-2의 비율로 표시되는 B) 샘플 칼슘 과도 근절 길이로 표현 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3) 분석. B 후 평균 수축 추적) 분석 후 칼슘 과도의 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
심근 세포 골격 (α-티닌)의 그림 4 면역 염색.
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Discussion
품질 심근의 분리 연습 및 최적화의 어떤 수준을 필요로한다. 이 프로토콜은 크게 소화의 결과에 영향을 미칠 수있는 주요 단계가 포함되어 있습니다. 수행 및 프로토콜 문제를 해결할 때이 신중하게 고려되어야한다. 삽관 및 재관류에 마음의 제거까지의 시간은 이상적 이하 오분보다 최소로 할 것. 얼음처럼 차가운 버퍼에 마음을 마우스에서 제거하고 해부 및 cannulating 후 얼음처럼 차가운 관류 버퍼에 즉시 마음을 세척하는 것도 품질 소화의 기회를 증가 할 것이다. 삽관 자체는 중요한 단계입니다. 이 관상 동맥의 관류를 차단하므로 캐뉼라의 선단은 아니지만 뇌실로 대동맥판 통해서 대동맥 제 분기 아래에 배치되어야한다. 관상 동맥 관류 품질 소화에 필수적이다. 이 연구실에서는, 캐 뉼러는 관류 버퍼 가득 주사기에 부착된다. 부드럽게 스말을 주입설치 및 혈액의 명확한 관상 동맥 삽관의 적합성을 테스트 할 수 있습니다보고 후 재관류 버퍼의 리터의 양입니다.
이 프로토콜 문제 해결을주의 깊게 상기 중요한 단계 평가를 포함한다. 심장이 소화하는 동안 palpably 소프트가되지 않을 경우, 몇 가지 잠재적 인 원인이 있습니다. 첫째, 삽관시, 정맥의 끝은 관상 동맥을 통해 혈류를 방지 대동맥 판막 이상 진행되었을 수 있습니다. 이것은 랑겐 돌프 장치에 매달려 있지만, 심장 주사기와 캐 뉼러를 통해 관류 완충액 소량 밀고 피 지우기 관상 동맥주의 깊게 관찰 전에 평가 될 수있다. 관류가 적합하지만, 경우 마음은 잘 소화 효소의 다른 많은 구입을 고려하지 않습니다. 효소가 실제로 혼합물이기 때문에, 많은 동일하게 행동하지 않습니다. 우리는 각 효소의 소량을 구입하는 것이 좋습니다. 제비는 purc 잘 소화 것을 발견하는 경우향후 사용을 위해 그 많은 많은 양을 하세. 논의 된 바와 같이 심장의 해부 및 삽관이 이상 ~ 10 분 걸릴 경우, 소화 세포의 품질이 저하 될 수 있습니다. 녹아웃 또는 처리 된 동물로 이동하기 전에 절개를 마스터하기 위해 야생 형 또는 치료 동물 완료 아이솔레이션을 고려하십시오. 소화 한 후, 세포는 천천히 칼슘 허용 할 수 있어야합니다. 세포는 칼슘 용액 각각에서 적어도 10 분을 소비한다. 다음 단계를 돌진하는 세포의 수율과 가능성을 줄일 수 있습니다.
재현되지만, 생리적 측정 품질 소화 시작에 의존한다. 측정 셀을 선택하면, 자발적으로 새는, 손상된 세포막을 나타냅니다, 계약되지 않은 셀을 선택합니다. 진행되면 세포가 균일하게 수축한다. 수축의 일관성을 보장하기 위해 측정을 녹음하기 전에 10 ~ 15 초 동안 세포를 서성 고려하십시오. 세포가 나타나면 균일하게 수축하지만, 할 공동의 측정ntraction의 크기는 크게 시간이 지남에 따라, 첫 번째로 정의 된 관심 영역이 sarcomeres의 한 인구를 커버 있는지 확인하여주십시오 다릅니다. 때때로 두 셀의 그룹화 및 관심 (ROI)의 영역은 1로 근절의 두 개의 서로 다른 인구를 측정 할 수있다. 적절한 ROI가 선택되지만 수축력이 단일 셀 내에서 가변되는 경우, 세포가 죽을 수 있고, 다른 셀은 선택되어야한다. 칼슘 과도를 들어, 물이 기능적으로 사용할 수의 Fura-2 오전 양을 변경으로 건조 된 무수 DMSO에서의 Fura-2 오전 희석하는 것이 중요합니다. 로딩 후 모든의 Fura-2 오전 세포 내에서 탈 에스테르 화 할 수 있도록 처음 세탁 및 측정 과도 사이에 적어도 20 분을 할 수 있습니다. 임의의 형광 염료와 같이, 도중 및 이후에 로딩 빛으로부터 세포를 보호한다. 일부 세포는 따라서 가끔씩 칼슘 과도 측정 된 세포에서 관찰되지 않습니다 염료를 흡수는하지 않습니다. 수축과 칼슘 과도 트레이싱은 "보이는 경우가 있지만페이싱 속도가 크게 (0.5-1 200Hz)를 감소 청소기 "측정 가까이 마우스 심박수, 바람직 적어도 2 헤르츠 이렇게 걸음에 속도보다 생리이다.
원하는 경우 분리 자체가 변형 될 수있다. 본 연구실은 재관류 중에 일정한 흐름 법 (마우스 3 ㎖ / 분)를 사용한다. 일부 그룹은 중력이 더 효과적인 흐름을 발견했다. 소화가 용이 심장 유량 증가가 소화로 가시화 될 때까지 중력 흐름 관류한다.
언급 한 바와 같이, 이들 기술은 한계를 가지고 수행. 생리 학적 측정의 품질은 소화의 품질에 의존적이기 때문에, 각 실험 조건에 대한 하나 이상의 심장에서 심근 세포를 측정하기 위해 신중. 각각의 마음을 측정하는 많은 근육 세포를 제공하지만 반복 digestions 결과가 마음 사이의 일관성을 보장합니다. 실험 디자인 FOLL 관련된 경우 격리, 따라서, 단말기 절차시간이 지남에 따라 동물의 심장 기능을 인하여 심근 번만 수확 될 수있다. 더 마우스는 그래서 필요한 개별 쥐가 심근를 분석하기 위해 희생하는 동안 코호트는 길이 방향으로 따라 할 수 있습니다.
우리의 초점은 녹아웃 마우스에서 수축성 및 세포 골격 구조를 연구하고있다, 그러나, 절연 심근은 약리학 적 효과를 검토, 압력 또는 용적 과부하 생쥐 심근 공부, t-세뇨관 대한 생균 염색을 포함한 다른 다양한 실험에 사용될 수있다 치료, 면역, 형질 구, 그리고 전사는 19 프로파일 링. 이 다재 다능 한 기술은 심장 마비를 연구하는 데 다른 방법에 비해 수많은 장점을 제공한다. 개별 셀의 공부 생리학은 전체 장기 F 함께 세포 변화에 대한 통찰력을 제공하는 등의 심 초음파 검사 또는 심전도 등 모든 장기 연구에 의해 제공되지 않은 정보를 제공합니다ailure. 전 세포를 쉽게 염색 묘화 될 수있는 외에, 고립 셀, 촬상 부 셀룰러 구조물 우수하다. 수축, 칼슘 과도 및 면역 형광 분석을 위해 심근을 분리하는 실험적인 디자인의 거대한 다양성에서 가치있는 정보를 제공하는 매우 다양한 기술입니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
세포 및 발생 생물학 비디오 촬용 장비학과의 사용에 대한 마크 워즈니악.
밴더빌트 대학의 세포 이미징 공유 리소스.
이 작품은 DMB하기 위해 ERP에 AHA 부여 12PRE10950005, DMB하는 AHA 부여 11GRNT7690040, NIH 보조금 R01 HL037675에 의해 지원됩니다. DMB는 심장 혈관 연구의 글래디스 P. Stahlman 의자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
References
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